Summary
Eine schnelle und einfache Art und Weise die menschliche Zelllinien mit induzierbarer und reversible cDNA Überexpression oder shRNA-vermittelte Knock-down des Gens von Interesse zu erzeugen. Diese Methode ermöglicht es Forschern, zuverlässig und hoch reproduzierbar zu manipulieren Zelllinien, die nur schwer durch transiente Transfektion Methoden oder konventionellen knockdown / Knockout-Strategien zu verändern sind.
Abstract
Ein wichtiger Ansatz im Bereich der Säugerzelle Biologie ist die Manipulation der die Expression von Genen von Interesse in ausgewählten Zellinien, mit dem Ziel, zu enthüllen einem oder mehreren der des Gens Funktion (en) unter Verwendung von transienten / stabile Überexpression oder Knockdown des Gens von Interesse. Leider für verschiedene zellbiologische Untersuchungen dieser Ansatz ist ungeeignet, wenn Manipulationen der Genexpression führen Zellwachstum / Zellproliferation Mängel oder unerwünschte Zelldifferenzierung. Daher haben Forscher die Tetracyclin-Repressorprotein (TetR), genommen aus dem E. angepaßt coli Tetracyclin-Resistenz-Operons 1, zu einer sehr effizienten und engen regulatorischen Systeme zu erzeugen, um cDNAs in Säugerzellen 2,3 auszudrücken. Kurz gesagt, hat TetR um entweder (1) Block Initiation der Transkription wurde durch Bindung an das Tet-Operator (TO) in der Promotorregion nach Zugabe von Tetracyclin (Tet-off bezeichnet System) oder (2) binden an die AN in modifizierter tEr Abwesenheit von Tetracyclin (sog. Tet-On-System) (Abbildung 1). Angesichts der Unannehmlichkeiten, das Tet-Off-System die kontinuierliche Anwesenheit von Tetracyclin (welches eine Halbwertszeit von etwa 24 Stunden in Gewebe Zellkulturmedium) erfordert das Tet-On-System wurden ausführlicher optimiert, was in der Entwicklung von sehr engen und effiziente Vektor-Systeme für die cDNA-Expression, wie hier verwendet.
Kurz nach der Gründung der RNA-Interferenz (RNAi) für die Gen-Knockdown in Säugetierzellen 4, Vektoren, kurz-hairpin RNAs (shRNAs) beschrieben wurden diese Funktion sehr ähnlich siRNAs 5-11. Jedoch haben diese shRNA-vermittelte Knockdown Ansätze die gleiche Einschränkung wie herkömmliche Knockout Strategien, da stabile Abreicherung nicht durchführbar, wenn Genziele für zelluläre Überleben essentiell. Um diese Einschränkung zu umgehen, van de Wetering et al. 12 veränderte die shRNA Expressionsvektor pSUPER 5
Hier beschreiben wir ein Verfahren effizient zu erzeugen stabilen menschlichen Tet-On Zell-Linien, die zuverlässig fahren entweder induzierbare Überexpression oder Abreicherung des Gens von Interesse. Mit dieser Methode haben wir erfolgreich generiert Tet-on-Zelllinien, die wesentlich erleichtert die Analyse der MST / hMOB / NDR Kaskade in Zentrosom 13,14 und Apoptose Signalisierung 15,16. In diesem Bericht beschreiben wir unsere Vektoren der Wahl, neben der Beschreibung der zwei aufeinander folgenden Manipulationen Schritte, die erforderlich sind, um effizient zu erzeugen sind menschliche Tet-on-Zelllinien (Abbildung 2). Außerdem neben umreißt ein Protokoll für die Herstellung von menschlichen Tet-On Zell-Linien werden wir kritischen Aspekte hinsichtlich der technischen Verfahren und die Charakterisierung von Tet-On-Zellen zu diskutieren.
Protocol
Ein. Klonierung pcDNA6_TetR_IRES_blast
- Wie in 3 dargestellt, führen einen teilweisen Verdau des Plasmids pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen) mit den Restriktionsenzymen Xba I und Nco I, die TetR-Gen und den Promotor des Blasticidin Widerstand (BlastR)-Gen zu entfernen. Isolieren Sie die 4,6 kb Vektorfragment.
- Um die Polyadenylierungssequenz aus der TetR-Gen zu entfernen, durch PCR einzuführen eine Xho I-Stelle unmittelbar nach dem Stop-Codon des TetR cDNA gleichzeitiger Schonung der Xba I-Stelle am 5'-Ende der cDNA. Subklonieren das resultierende Fragment in pMigR1 17 unter Verwendung von Restriktionsenzymen XbaI und XhoI zur Erzeugung des pMigR1_TetR Plasmid.
- Verdauen pMigR1_TetR Vektor mit den Restriktionsenzymen Xba I und Nco I-Fragment, um die TetR_IRES freizugeben. Isolieren Sie das 1,25 kb Insert-Fragment.
- Ligieren das 4,6 kb pcDNA6/TR und die 1,25 kb TetR_IRES Fragmente. Transform des Ligationsprodukts in kompetente E.coli und Identifizierung des gewünschten pcDNA6_TetR_IRES_blast Konstrukt unter Verwendung von molekularbiologischen Standardtechniken.
2. Generierung von Zelllinien stabil exprimieren TetR
- Am Tag 1 Seed 1x10 6 Zellen pro 10-cm Gewebekulturplatte mit Ihrem Standard-Wachstumsmedium (zB DMEM ergänzt mit 10% FCS). Seed zwei Platten, eine für die Transfektion mit pcDNA6_TetR_IRES_blast, und die andere als eine negative Kontrolle für Blasticidin Selektion. Stellen Sie sicher, den günstigsten Durchgang möglich und die empfohlene Wachstumsmedium zu verwenden.
- Am Tag 2 transfizieren eine Platte mit 2 ug pcDNA6_TetR_IRES_blast mit Fugene 6 (e2691, Promega) nach den Anweisungen des Herstellers. Nicht transfizieren die zweite Platte.
- Am Tag 3, fügen Standard Wachstumsmedium mit 5 ug / ml Blasticidin an beide Platten. Bitte beachten Sie, dass die optimale Auswahl Konzentration kann für eine bestimmte Zelllinie variieren und vielleicht need vorher festgelegt werden.
- Am Tag 4 aufgeteilt, die Zellen mit 1/5, 1/25, 1/50 und 1/100 unter Verwendung von 10-cm Platten und Standard-Wachstumsmedium, das 5 mg / ml Blasticidin. Stellen Sie sicher, richtig zu beschriften Platten mit untransfizierte oder transfizierten Zellen. Bereiten Sie zwei Platten pro Verdünnungsstufe.
- Überprüfen Zellen täglich, sicherzustellen, dass alle Zellen auf den transfizierten Platten haben innerhalb der ersten Woche gestorben. Auswahl ändern media alle 2-3 Tage.
- Nach 1-2 Wochen sollte Blasticidin-resistente Kolonien beginnen zu erscheinen. Wählen Platten mit 5 bis 50 Kolonien, sicherzustellen, dass einzelne Kolonien ausgewählt werden können.
- Wenn Kolonien haben einen Durchmesser von ca. 5 mm (oder größer) erreicht, Isolieren mindestens 12 unabhängigen Klonen mittels Klonierung Zylindern, um einzelne Kolonien zu wählen. Übertragen jeder Klon in ein separates Loch einer 24-Well Gewebekulturplatte. Wenn konfluent, spalten die Zellen aus jeder Vertiefung in einem einzigen Well einer 6-Well-Gewebekulturplatte.
- Weiter zu Kultur cldiejenigen in der Auswahl Medien. Wenn konfluent, geteilte Zellen aus jeder Vertiefung in zwei einzelne Vertiefungen einer 6-well Gewebekulturplatten.
- Für jeden zu testenden Klon, eingefroren eine Vertiefung konfluenten Zellen und Ernte Zellen in der anderen gut für nachfolgende Prüfung durch Immunblotting.
- Detect TetR durch Western-Blot mit dem monoklonalen anti-TET02 Antikörper (MoBiTec GmbH). Erinnern, um ein Lysat der parentalen Zelllinie als Negativkontrolle umfassen.
- Wählen Sie 3 Klone mit der höchsten TetR Ausdruck und erweitern Sie jeden klonalen Kultur. Einfrieren Bestände jedes vielversprechende Klon so schnell wie möglich. Schließlich prüft die molekularen und zellbiologischen interessierenden Parameter durch Vergleichen der parentalen Zellinien mit den TetR-exprimierenden Klonen. Wählen Sie den "besten" Klon mit der höchsten TetR Ausdruck, der nicht angezeigt wird keine Veränderungen in den molekularen und zellbiologischen Parameter von Interesse.
3. Pilot Prüfung von pter und pT-Rex DEST30 Vektoren Expressten shRNA oder cDNAs, Jeweils
- Generieren PTER Plasmid mit shRNA Inserts 12, wie beschrieben. Konstrukt pT-Rex DEST30 Vektor (12.301 bis 016, Invitrogen), enthaltend die cDNA von Interesse mittels Gateway-Technologie (Invitrogen). Im Fall von cDNA-Expression wird die Zugabe eines Tags der cDNA später zu erleichtern Erkennung von exogen exprimierten Proteins.
- Transient zu transfizieren die elterliche Zielzelle Einklang mit PTER oder pT-Rex DEST30 Plasmide (Ausdruck entweder shRNAs oder cDNAs von Interesse) mit dem Transfektionsreagenz der Wahl. Für die Prüfung von shRNA Expressionsplasmide, sorgen für eine hohe Transfektionseffizienz erreicht werden kann.
- Ernte transfizierten Zellen und Verfahren zur Immunoblot mit den entsprechenden Antikörpern in der Erwartung, eine Verarmung oder Überexpression des Gens von Interesse zu erkennen.
4. Erzeugung von stabilen Zelllinien mit Tetrazyklin-induzierbarer (Tet-On) Expression von cDNAs oder shRNAs Verwenden PTER oder pT-Rex DEST30 Vektoren
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Representative Results
Ein Beispiel für die erstmalige Beschreibung RPE-1-Zelllinien stabil exprimieren TetR ist in Abbildung 4 dargestellt. Beachten Sie, dass alle RPE-1 Klone unterschiedlicher TetR ausdrücken (vgl. Bahnen 2 und 5), während die elterliche Zelllinie (die als negative Kontrolle) nicht exprimiert die exogene TetR-Protein (Abbildung 4, Spur 1). Diese Variation in TetR Expression unter RPE-1 Tet-On Zell-Klone wird erwartet, da die Expression des TetR exprimierenden Plasmiden ist stark abhängig von dem Plasmid Integrationsstelle.
Die Charakterisierung der stabilen RPE-1 Tet-On Zell-Klone, die gegen die shRNAs MST3 Kinase gerichtet zeigt, dass mehrere Klone untersucht, um die Zelllinien, die mit dem effizientesten Depletion von dem Gen von Interesse (5) definiert werden müssen. Im dargestellten Fall (Fig. 5) Zellklone # 1, # 2 und # 3 wurden zur weiteren Analyse ausgewählt. Die Variation in Depletion Effizienz wird erwartet, da die Expression von shRNA Expression ist stark abhängig von dem Plasmid Integrationsstelle.
Abbildung 1. Die Unterschiede zwischen Tet-Off und Tet-On Expressionssysteme sind gezeigt. Der Tetracyclin (Tet) Repressorprotein (TetR) zu entweder (1) Block Initiation der Transkription wurde durch Bindung an das Tet-Operator (TO) in dem modifizierten Promotor Region nach Zugabe von Tetracyclin (Tet-off bezeichnet System) oder (2) binden an die in der Abwesenheit von Tetracyclin (bezeichnet Tet-On-System).
Abbildung 2. Beschreibung der beiden aufeinanderfolgenden Manipulation notwendigen Schritte zur Erzeugung menschlicher Tet-On Zell-Linien mit induzierbarer Expression des shRNA oder cDNA von Interesse. (zB Serumentzug Reaktion, Zellproliferation abrufen, oder Expression von Markerproteinen) wird das "beste" TetR-positiven Klon erweitert und gespeichert wird. Schritt 2: Erzeugung von Tet-on-Zelllinien mit induzierbarer shRNA / cDNA Ausdruck. Die "besten" TetR-positive Zellen mit pitel 12 für shRNA-Expression oder mit pT-Rex DEST30 (12301-016, Invitrogen) für die cDNA-Expression transfiziert und Blast / Zeocin oder Blast/G418 resistente Klone ausgewählt sind. Mehrere einzelne Zellklone werden gepickt, expandiert und durch Immunoblotting gescreent für Tetracyclin-induzierbare Knockdown oder Expression des Gens von Interesse. Schließlich Klone von Interesseerweitert werden, erneut getestet und gespeichert.
Abbildung 3. Erzeugung des pcDNA6_TetR_IRES_blast Vektor. Die neu generierte pMigR1_TetR Plasmid wurde mit Xba I und Nco I verdaut, und das freigesetzte 1.25kb Fragment, das das TetR und IRES (internal ribosome entry site) Sequenzen wurde in der angezeigten Xba I und Nco I-Stellen von klonierten pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen). Der resultierende Vektor pcDNA_TetR_IRES_blast drückt das TetR und das Blasticidin-Resistenzgen (BlastR) unter Verwendung desselben CMV-Promotor, wodurch sichergestellt wird, dass alle Blasticidin-resistenten Zellen exprimieren ebenfalls TetR.
Abbildung 4. Analyse der RPE-1-Zell-Klone stabil mit pcDNA / TetR_IRES_blast transfiziert.Elterliche RPE-1-Zellen wurden in RPE-1-Zellen stabil exprimiert TetR durch Immunoblotting mit Anti-TetR (oberes Feld) und anti-alpha-Tubulin-Antikörper (unteres Feld) verglichen.
Abbildung 5. . (-) Oder Vorliegen (+) von Tetracyclin (Tet) für 72 Std, Analyse der RPE-1 TetR-positiven Klone, die stabil mit pTER_shMST3 transfiziert Um Zellen mit Tetracyclin-induzierbare Expression von shRNAs Targeting MST3 identifizieren, wurden Klone in Abwesenheit gezüchtet vor der Verarbeitung Immunoblot mit anti-MST3 (oben) und anti-alpha-Tubulin-Antikörper (unten).
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Discussion
Wir glauben, dass Tet-On-Systeme erheblich erleichtern die Analyse der Genfunktion, insbesondere in Zellsysteme, die schwierig zu manipulieren und / oder wenn die manipulierte Gen ist essentiell für das Überleben der Zelle sind. Darüber hinaus bietet die Fähigkeit, die Genexpression durch hochspezifische Tet-On-Systeme kontrollieren die Möglichkeit Genfunktionen in verschiedenen Phasen (zum Beispiel während der Zellzyklusprogression oder wohldefinierten Differenzierungsprozesse) studieren. Die hier vorgestellten Verfahren ermöglichen es den Forschern zur Erzeugung der gewünschten stabilen Tet-On Zell-Linien innerhalb eines vernünftigen Zeitrahmens (normalerweise 3-6 Monate, weitgehend in Abhängigkeit vom Ausmaß der molekularen und zellbiologischen Profilierung, die für die Charakterisierung der TetR-positiv ist Zelllinien). Die erfolgreiche Erzeugung und Anwendung von Tet-On Zell-Linien ist jedoch kritisch abhängig von mehreren Faktoren ab.
Zuerst wird die Selektion von Zellen mit ausreichend hoher Expression TetRerforderlich ist, um stringente Repression der Transkription in Abwesenheit der Tetracyclin gewährleisten. Ebenso wichtig ist, sollte die anfängliche Charakterisierung der Ziel-Zellen, die den TetR alle möglichen molekularen und zellbiologischen Parameter, die auf lange Sicht untersucht werden. In unserer Erfahrung ist ein gut charakterisiertes TetR-positive Zelllinie ein sehr guter Ausgangspunkt für zahlreiche Forschungsprojekte.
Zweitens ist es notwendig, das Tetracyclin-Konzentration so niedrig wie möglich, um mögliche pleiotrope Effekte verhindern halten beim Testen und Analysieren Tet-On-Klone für shRNA / cDNA-Expression. Wenn möglich, sollte das Tetracyclin-Konzentration nicht höher als 2 pg / ml (vorzugsweise kleiner als 2 pg / ml). Da außerdem Tetracyclin hat eine Halbwertszeit von etwa 24 Stunden in Gewebe Zellkulturmedium, Experimente, die mehrere Tage zusätzlichen Runden von Tetracyclin Zugabe Betracht ziehen sollten. Doxycyclin, Tetracyclin ein synthetisches alternative, Kann auch berücksichtigt werden, wenn zytotoxischen Ebenen von Tetracyclin zur Sorge sind.
Drittens sollten Tests unterschiedlich für cDNA und shRNA-Expression angewendet werden. Während Tet-on-Zellen, die cDNAs einfach produzieren nachweisbare Mengen von Proteinen innerhalb von 24 Stunden, kann der Abbau von endogenen Faktoren shRNA-vermittelte Knockdown viel länger dauern. Generell empfehlen wir Klone shRNAs nur 96 Stunden nach Tetracyclin Zugabe, die zu verminderten Niveaus des Gens von Interesse führen wird, auch wenn die Halbwertszeit von Ihr Ziel ist 24 Stunden zu testen. Das Beispiel in Abbildung 5 dargestellt stellt eine "ideale" Screening-Ergebnis für die shRNA-vermittelte Depletion und Modifikationen an der Testprotokoll ist möglicherweise erforderlich, um die optimale knock down Bedingungen festzulegen. Last, but not least, möchten wir die Tatsache, dass etablierte Screening-Tools (qRT-PCR-Sonden, Antikörper) wird dadurch wesentlich erleichtert die Identifizierung des gewünschten Zell-Klone zu betonen. </ P>
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken allen Mitgliedern unseres Labors für hilfreiche Diskussionen. Wir danken Joanna Lisztwan und Christina Gewinner für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von der BBSRC Gewährung BB/I021248/1 unterstützt und die Wellcome Trust Gewährung 090090/Z/09/ZAH ist ein Wellcome Trust Research Career Development Fellow an der UCL Cancer Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Tested Tet-free |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratories | P31-011 | 100 mg/ml in media |
| anti-TET02 | MoBiTec GmbH | TET02 | Use at 1/1000 to 1/2000 for WB |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg/ml in ethanol |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg/ml in water |
| Cloning cylinders | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | re-useable |
References
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