Summary
Inducible और प्रतिवर्ती सीडीएनए या हित के जीन की overexpression shRNA की मध्यस्थता दस्तक नीचे के साथ मानव कोशिका लाइनों उत्पन्न करने के लिए एक तेजी से और सरल तरीका है. इस विधि मज़बूती और अत्यधिक reproducibly में हेरफेर सेल लाइनों है कि क्षणिक अभिकर्मक तरीकों या पारंपरिक / पछाड़ना पीटा रणनीतियों द्वारा बदल मुश्किल हैं शोधकर्ताओं के लिए सक्षम बनाता है.
Protocol
1. PcDNA6_TetR_IRES_blast की क्लोनिंग
- के रूप में 3 चित्र में सचित्र, साथ प्लाज्मिड pcDNA6/TR प्रतिबंध एंजाइमों Xba मैं और NCO मैं tetr जीन और blasticidin (BlastR) प्रतिरोध जीन के प्रमोटर को दूर करने के लिए (V1025-20, Invitrogen) के एक आंशिक डाइजेस्ट करते हैं. 4.6 केबी वेक्टर टुकड़ा अलग.
- Tetr जीन से polyadenylation अनुक्रम को दूर करने के लिए, पीसीआर द्वारा tetr बंद करो कोडोन सीडीएनए जबकि संरक्षण सीडीएनए के 5'end में Xba मैं इस साइट के तुरंत बाद एक Xho साइट मैं शुरू. में परिणामस्वरूप टुकड़ा pMigR1 17 प्रतिबंध एंजाइमों Xba मैं और Xho मैं का उपयोग करने के लिए pMigR1_TetR प्लाज्मिड उत्पन्न Subclone.
- प्रतिबंध एंजाइमों Xba मैं और NCO मैं साथ pMigR1_TetR वेक्टर डाइजेस्ट लिए TetR_IRES टुकड़ा जारी. 1.25 केबी डालने टुकड़ा अलग.
- 4.6 केबी pcDNA6/TR और 1.25 केबी TetR_IRES टुकड़े कटी घमनी को बांधना. Trसक्षम ई. कोलाई में ligation उत्पाद ansform और वांछित pcDNA6_TetR_IRES_blast का निर्माण मानक आणविक जीव विज्ञान तकनीक का उपयोग की पहचान.
2. सेल लाइन्स पीढ़ी stably व्यक्त tetr
- 1 दिन, 1x10 बीज 10 सेमी टिशू कल्चर प्लेट का उपयोग कर अपने मानक मध्यम विकास के प्रति 6 कोशिकाओं (जैसे DMEM 10% FCS साथ पूरक). दो प्लेटों, एक pcDNA6_TetR_IRES_blast साथ अभिकर्मक के लिए, और अन्य blasticidin चयन के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में बीज. करने के लिए कम से कम संभव मार्ग और सिफारिश की मध्यम विकास का उपयोग सुनिश्चित करें.
- 2 दिन, transfect 2 ग्राम pcDNA6_TetR_IRES_blast के निर्माता के निर्देशों का पालन 6 Fugene (E2691, PROMEGA) का उपयोग कर के साथ एक प्लेट. दूसरे की थाली नहीं transfect.
- 3 दिन, मानक विकास दोनों प्लेटों के 5 blasticidin / ग्राम मिलीलीटर युक्त मध्यम जोड़ने. कृपया ध्यान दें कि इष्टतम चयन एकाग्रता एक दिया सेल लाइन के लिए भिन्न हो सकते हैं और हो सकता है nपहले से निर्धारित किया जा eed.
- 4 दिन, 1 5 / कोशिकाओं विभाजित / 25 1, 1/50 और 1/100 का उपयोग कर 10 सेमी प्लेटों और मानक वृद्धि 5 मिलीग्राम / एमएल blasticidin युक्त मध्यम. सुनिश्चित करें कि ठीक से untransfected या ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से युक्त प्लेटों लेबल. कमजोर पड़ने कदम प्रति दो प्लेटें तैयार.
- कोशिकाओं दैनिक जाँच करें, यह सुनिश्चित करना है कि सभी untransfected प्लेटों पर कोशिकाओं को 1 सप्ताह के भीतर मृत्यु हो गई है. चयन मीडिया बदलें हर 2-3 दिन.
- 1-2 सप्ताह के बाद, blasticidin प्रतिरोधी कालोनियों प्रकट करने के लिए शुरू करना चाहिए. 5 से 50 कालोनियों को रोकने के लिए सुनिश्चित करें कि एकल कालोनियों उठाया जा सकता है प्लेटों का चयन करें.
- जब कालोनियों लगभग 5 मिमी (या बड़ा) के एक व्यास तक पहुँच चुके हैं, कम से कम 12 स्वतंत्र क्लोनिंग सिलेंडरों का उपयोग करने के लिए एकल कालोनियों लेने क्लोनों अलग. एक 24-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली का एक अलग कुएं में प्रत्येक क्लोन स्थानांतरण. जब मिला हुआ है, एक एक ऊतक 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली के साथ एकल में हर अच्छी तरह से कोशिकाओं को विभाजित.
- संस्कृति सीएल के लिए जारीचयन मीडिया में लोगों को. मिला हुआ है, जब एक 6-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली के दो सिंगल कुओं में हर अच्छी तरह से विभाजित कोशिकाओं.
- प्रत्येक क्लोन परीक्षण किया जाना, एक संगामी कोशिकाओं और immunoblotting द्वारा फसल कोशिकाओं बाद परीक्षण के लिए दूसरे को अच्छी तरह से अच्छी तरह से नहीं हिलेगा.
- वेस्टर्न माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विरोधी TET02 (MoBiTec GmbH) का उपयोग करते हुए सोख्ता tetr का पता लगाने. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में माता पिता के सेल लाइन के एक lysate शामिल करना न भूलें.
- उच्चतम tetr अभिव्यक्ति के साथ 3 क्लोनों का चयन करें और प्रत्येक clonal संस्कृति का विस्तार. प्रत्येक होनहार क्लोन के शेयरों के रूप में संभव के रूप में जल्द ही रुक. अंत में, tetr व्यक्त क्लोन के साथ माता पिता के सेल लाइनों की तुलना द्वारा ब्याज की आणविक और कोशिका जैविक मापदंडों की जांच. उच्चतम tetr अभिव्यक्ति है कि ब्याज की आणविक और कोशिका जैविक मापदंडों में किसी भी परिवर्तन के प्रदर्शित नहीं करता है के साथ 'सर्वश्रेष्ठ' क्लोन का चयन करें.
3. Pter के पायलट परीक्षण और पीटी - रेक्स DEST30 वैक्टर एक्सप्रेसआईएनजी shRNA या cDNAs क्रमशः,
- ShRNA आवेषण के साथ प्लाज्मिड pter के रूप में 12 वर्णित उत्पन्न करता है. पीटी - रेक्स DEST30 (12,301-016, Invitrogen) वेक्टर गेटवे प्रौद्योगिकी (Invitrogen) का उपयोग करते हुए ब्याज की सीडीएनए युक्त निर्माण. सीडीएनए अभिव्यक्ति के मामले में, सीडीएनए टैग के अलावा बाद में exogenously व्यक्त प्रोटीन का पता लगाने की सुविधा होगी.
- Transiently pter या पीटी - रेक्स DEST30 (या तो shRNAs या ब्याज की cDNAs व्यक्त) plasmids पसंद के अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग करने के साथ माता पिता के लक्ष्य सेल लाइन transfect. ShRNA अभिव्यक्ति plasmids के परीक्षण के लिए सुनिश्चित करने के लिए, उच्च अभिकर्मक क्षमता हासिल किया जा सकता है.
- हार्वेस्ट उचित एंटीबॉडी का उपयोग immunoblotting के लिए ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं और प्रक्रिया, एक या ब्याज की अपने जीन की कमी overexpression का पता लगाने की उम्मीद है.
4. (Tet पर) टेट्रासाइक्लिन-inducible shRNAs या cDNAs pter या पीटी - रेक्स DEST30 वैक्टर का उपयोग कर की अभिव्यक्ति के साथ स्थिर सेल लाइन्स का सृजन
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Representative Results
RPE-1 सेल stably tetr व्यक्त लाइनों के प्रारंभिक लक्षण वर्णन के लिए एक उदाहरण 4 चित्र में दिखाया गया है. ध्यान दें कि सभी RPE-1 क्लोनों tetr के स्तर अलग व्यक्त (2 गलियों और 5 की तुलना), जबकि माता पिता सेल लाइन (जो नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है) exogenous tetr प्रोटीन व्यक्त नहीं करता है (4 चित्रा, 1 लेन). RPE-1 के बीच tetr अभिव्यक्ति में यह बदलाव Tet सेल क्लोनों पर उम्मीद है, plasmids व्यक्त tetr की अभिव्यक्ति के बाद से प्लाज्मिड एकीकरण साइट पर अत्यधिक निर्भर है.
स्थिर RPE-1 Tet पर सेल क्लोनों व्यक्त MST3 kinase के खिलाफ निर्देशित shRNAs से पता चलता है कि कई क्लोनों करने के क्रम में ब्याज की जीन (5 चित्रा) के सबसे कुशल रिक्तीकरण के साथ सेल लाइनों को परिभाषित करने के लिए परीक्षण किया जाना है. के लक्षण वर्णन सचित्र मामले में (5 चित्रा) सेल क्लोनों # 1, # 2 और # 3 आगे के विश्लेषण के लिए चुना गया था. मैं भिन्नताn रिक्तीकरण दक्षता की उम्मीद है, क्योंकि shRNA अभिव्यक्ति की अभिव्यक्ति प्लाज्मिड एकीकरण साइट पर अत्यधिक निर्भर है.
चित्रा 1. Tet बंद और Tet पर अभिव्यक्ति सिस्टम के बीच मतभेदों को दिखाया गया है. टेट्रासाइक्लिन (TET) repressor प्रोटीन (tetr) Tet ऑपरेटर () के लिए बाध्य किया गया है प्रमोटर में या तो (1) प्रतिलेखन के ब्लॉक दीक्षा के लिए संशोधित टेट्रासाइक्लिन (करार दिया प्रणाली Tet बंद) के अलावा पर क्षेत्र या टेट्रासाइक्लिन (करार प्रणाली Tet पर) की अनुपस्थिति में (2) करने के लिए बाध्य है.
चित्रा 2. लगातार दो हेरफेर उत्पन्न करने के लिए आवश्यक कदम का वर्णन मानव Tet shRNA या ब्याज की सीडीएनए inducible अभिव्यक्ति के साथ सेल लाइनों पर. (जैसे सीरम भुखमरी प्रतिक्रिया, सेल प्रसार दर, या मार्कर प्रोटीन की अभिव्यक्ति) के लिए परीक्षण के बाद, 'सर्वश्रेष्ठ' tetr पॉजिटिव क्लोन का विस्तार है और संग्रहीत. चरण 2: Tet पीढ़ी inducible shRNA / सीडीएनए अभिव्यक्ति के साथ सेल लाइनों पर. 'सर्वश्रेष्ठ' tetr पॉजिटिव कोशिकाओं shRNA अभिव्यक्ति के लिए 12 pter के साथ या PT-Rex सीडीएनए अभिव्यक्ति के लिए DEST30 (12,301-016, Invitrogen) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे हैं, और / ब्लास्ट Zeocin या Blast/G418 प्रतिरोधी क्लोनों का चयन कर रहे हैं, क्रमशः. कई अलग - अलग सेल क्लोनों उठाया, का विस्तार कर रहे हैं और टेट्रासाइक्लिन-inducible या हित के जीन की पछाड़ना की अभिव्यक्ति के लिए immunoblotting द्वारा जांच की. अंत में ब्याज की, क्लोनका विस्तार कर रहे हैं, फिर से परीक्षण किया और संग्रहीत.
चित्रा 3. का सृजन pcDNA6_TetR_IRES_blast वेक्टर. नव सृजित प्लाज्मिड pMigR1_TetR में Xba मैं और NCO मैं के साथ पचा किया गया था, और जारी 1.25kb tetr और IRES युक्त टुकड़ा (आंतरिक ribosome प्रविष्टि साइट) दृश्यों प्रदर्शित Xba मैं और NCO मैं की साइटों में क्लोन किया गया था pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen). परिणामस्वरूप pcDNA_TetR_IRES_blast वेक्टर tetr और Blasticidin प्रतिरोध जीन (BlastR) ही सीएमवी प्रमोटर का उपयोग कर व्यक्त किया, जिससे यह सुनिश्चित करना है कि सभी Blasticidin प्रतिरोधी कोशिकाओं को भी व्यक्त tetr.
चित्रा 4. RPE-1 सेल क्लोनों का विश्लेषण stably / pcDNA TetR_IRES_blast साथ ट्रांसफ़ेक्ट.माता पिता RPE 1 कोशिकाओं RPE एक stably विरोधी tetr (शीर्ष पैनल) और विरोधी अल्फा ट्यूबिलिन (नीचे पैनल) एंटीबॉडी का उपयोग immunoblotting tetr व्यक्त कोशिकाओं की तुलना में थे.
चित्रा 5. (-) टेट्रासाइक्लिन (Tet) या उपस्थिति (+) 72 घंटे के लिए, RPE एक tetr पॉजिटिव क्लोनों का विश्लेषण stably pTER_shMST3 साथ ट्रांसफ़ेक्ट लक्ष्यीकरण MST3 shRNAs की टेट्रासाइक्लिन-inducible अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं की पहचान, क्लोन अनुपस्थिति में बड़े हो रहे थे से पहले विरोधी MST3 (शीर्ष पैनल) और विरोधी अल्फा ट्यूबिलिन एंटीबॉडी (नीचे पैनल) का उपयोग immunoblotting के लिए प्रसंस्करण.
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Discussion
हम मानते हैं कि Tet पर सिस्टम बहुत सेल प्रणाली है कि हेरफेर करने के लिए और / या जब चालाकी से जीन सेल अस्तित्व के लिए आवश्यक है के लिए मुश्किल हैं में विशेष रूप से जीन समारोह का विश्लेषण, सुविधा. इसके अलावा, Tet पर अत्यधिक विशिष्ट सिस्टम द्वारा जीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने की क्षमता विभिन्न चरणों कोशिका चक्र प्रगति या अच्छी तरह से परिभाषित भेदभाव प्रक्रियाओं के दौरान (उदाहरण के लिए) में जीन कार्यों का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है. यहाँ प्रस्तुत विधि शोधकर्ताओं उत्पन्न करने के लिए सक्षम हो जाएगा वांछित स्थिर Tet सेल लाइनों पर (आम तौर पर 3-6 महीने, एक उचित समय फ्रेम के भीतर बड़े पैमाने पर आणविक और कोशिका जैविक रूपरेखा की हद तक है कि tetr पॉजिटिव के लक्षण वर्णन के लिए आवश्यक है पर निर्भर करता है सेल लाइनों). सफल और पीढ़ी आवेदन Tet सेल लाइनों पर, तथापि, गंभीर रूप से कई कारकों पर निर्भर है.
सबसे पहले, tetr की पर्याप्त उच्च अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं का चयनटेट्रासाइक्लिन के अभाव में प्रतिलेखन के कड़े दमन को सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है. महत्वपूर्ण समान रूप से, लक्ष्य tetr व्यक्त कोशिकाओं के प्रारंभिक लक्षण वर्णन सभी संभव आणविक और कोशिका जैविक मापदंडों को कवर किया जाना चाहिए कि लंबे समय पर अध्ययन किया जाएगा. हमारे अनुभव में, एक अच्छी तरह से विशेषता tetr पॉजिटिव सेल लाइन कई अनुसंधान परियोजनाओं के लिए एक बहुत अच्छा प्रारंभिक बिंदु है.
दूसरा, यह जरूरी है कि जितना संभव हो कम संभव pleiotropic प्रभावों को रोकने के टेट्रासाइक्लिन एकाग्रता रखने के लिए जब परीक्षण और shRNA / सीडीएनए अभिव्यक्ति के लिए क्लोन Tet पर विश्लेषण. यदि संभव हो तो, टेट्रासाइक्लिन एकाग्रता 2 ग्राम / मिलीग्राम (preferentially 2 ग्राम / मिलीग्राम से कम) से अधिक नहीं होना चाहिए. इसके अलावा, के बाद से टेट्रासाइक्लिन एक ऊतक सेल संस्कृति मध्यम, प्रयोगों है जो पिछले कई दिनों टेट्रासाइक्लिन अलावा अतिरिक्त दौर पर विचार करना चाहिए के बारे में 24 घंटा का आधा जीवन है. डॉक्सीसाइक्लिन, एक सिंथेटिक टेट्रासाइक्लिन वैकल्पिक, जब भी टेट्रासाइक्लिन की साइटोटोक्सिक स्तर चिंता का विषय माना जा सकता है.
तीसरा, परीक्षण सीडीएनए और shRNA अभिव्यक्ति के लिए अलग लागू किया जाना चाहिए. जबकि Tet कोशिकाओं पर व्यक्त cDNAs आसानी से 24 घंटे के भीतर प्रोटीन के detectable मात्रा का उत्पादन होगा, shRNA की मध्यस्थता पछाड़ना द्वारा अंतर्जात कारकों की कमी बहुत लंबे समय तक ले जा सकते हैं. आम तौर पर, हम क्लोनों shRNAs टेट्रासाइक्लिन इसके अलावा, जो अपने हित के जीन के कम स्तर के लिए नेतृत्व भी यदि अपने लक्ष्य का आधा जीवन 24 घंटे के बाद केवल 96 घंटा व्यक्त का परीक्षण करने के लिए सलाह देते हैं. चित्रा 5 में दिखाया उदाहरण एक 'आदर्श' shRNA की मध्यस्थता कमी के लिए स्क्रीनिंग के परिणाम का प्रतिनिधित्व करता है, और परीक्षण प्रोटोकॉल में संशोधन की स्थिति नीचे इष्टतम दस्तक को परिभाषित करने के लिए आवश्यक हो सकता है. , पिछले नहीं बल्कि कम से कम, हम तथ्य यह है कि अच्छी तरह से स्थापित की स्क्रीनिंग उपकरण (qRT - पीसीआर जांच, एंटीबॉडी) बहुत अपने वांछित सेल क्लोनों की पहचान की सुविधा होगी तनाव <होगा./ P>
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम उपयोगी विचार - विमर्श के लिए हमारी प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को धन्यवाद. हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए Joanna Lisztwan और क्रिस्टीना Gewinner धन्यवाद. इस काम बीबीएसआरसी अनुदान BB/I021248/1 द्वारा समर्थित किया गया था और वेलकम ट्रस्ट अनुदान 090090/Z/09/ZAH UCL कैंसर संस्थान में एक वेलकम ट्रस्ट रिसर्च कैरियर विकास साथी है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Tested Tet-free |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratories | P31-011 | 100 mg/ml in media |
| anti-TET02 | MoBiTec GmbH | TET02 | Use at 1/1000 to 1/2000 for WB |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg/ml in ethanol |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg/ml in water |
| Cloning cylinders | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | re-useable |
References
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