Summary
En rask og enkel måte å generere humane cellelinjer med induserbar og reversible cDNA overekspresjon eller shRNA-mediert knock-ned av genet av interesse. Denne metoden gjør forskere til pålitelig og svært reproduserbart manipulere cellelinjer som er vanskelig å endre ved forbigående transfeksjon metoder eller konvensjonelle knockdown / knockout strategier.
Abstract
En stor tilnærming innen pattedyrcelle biologi er manipulering av ekspresjonen av gener av interesse i utvalgte cellelinjer, med sikte på å avsløre en eller flere av genets funksjon (er) ved hjelp av forbigående / stabil overekspresjon eller knockdown av genet av interesse. Dessverre, for ulike cellebiologiske undersøkelser denne tilnærmingen er uegnet når manipulasjoner av genuttrykk resultat i cellevekst / spredning feil eller uønsket celledifferensiering. Derfor har forskere tilpasset den Tetracycline repressor protein (TetR), tatt fra E. coli tetracyklin motstand 1 operon, for å generere svært effektiv og stram regelverk å uttrykke cDNA'ene i pattedyrceller 2,3. Kort sagt har TetR blitt modifisert til enten (1) blokk initiering av transkripsjon ved binding til Tet-operatøren (TO) i promoter-regionen ved tilsetning av tetracyklin (kalt Tet-off-system) eller (2) bindes til TO i than fravær av tetracyklin (kalt Tet-on-systemet) (Figur 1). Gitt ulemper Tet-off system krever kontinuerlig tilstedeværelse av tetracyklin (som har en halveringstid på omtrent 24 timer i vev cellekulturmedium) Tet-on-systemet har blitt mer omfattende optimalisert, som resulterer i utvikling av svært stramt og effektive vektor systemer for cDNA uttrykk som brukes her.
Kort tid etter etableringen av RNA-interferens (RNAi) for gene knockdown i pattedyrceller 4, vektorer som uttrykker korte hårnål RNA (shRNAs) ble beskrevet som fungerer svært lik siRNAs 5-11. Men disse shRNA-mediert knockdown tilnærminger har samme begrensning som konvensjonelle knockout strategier, siden stabil uttømming er ikke gjennomførbart når genet mål er avgjørende for cellulær overlevelse. For å overvinne denne begrensningen, van de Wetering et al. 12 endret shRNA ekspresjonsvektor pSUPER 5
Her beskriver vi en fremgangsmåte til effektivt å generere stabile humant Tet-on cellelinjer som pålitelig kjøre enten induserbar overekspresjon eller uttømming av genet av interesse. Ved hjelp av denne metoden, har vi lykkes genereres Tet-on cellelinjer som i betydelig grad tilrettelagt analysen av MST / hMOB / NDR kaskade i sentrosomen 13,14 og apoptose signaliserer 15,16. I denne rapporten beskriver vi våre vektorer av valg, i tillegg til å beskrive de to etterfølgende manipulasjon trinnene som er nødvendige for å effektivt å generere human Tet-on cellelinjer (figur 2). Videre, i tillegg skissere en protokoll for generering av menneskelig Tet-on cellelinjer, vil vi diskutere viktige aspekter ved de tekniske prosedyrer og karakterisering av Tet-on celler.
Protocol
1. Kloning av pcDNA6_TetR_IRES_blast
- Som illustrert i figur 3, utfører en delvis digest av pcDNA6/TR plasmid (V1025-20, Invitrogen) med restriksjonsenzymene Xbal og Nco jeg å fjerne TetR genet og promotoren av blasticidin motstand (BlastR) genet. Isolere 4,6 kb vektor fragment.
- Å fjerne polyadenylerings sekvens fra TetR genet, innføre ved PCR en Xho jeg umiddelbart etter stoppkodonet av TetR cDNA mens bevare Xbal området på 5'end av cDNA. Subklon det resulterende fragment til pMigR1 17 hjelp restriksjonsenzymene Xbal og Xho jeg å generere pMigR1_TetR plasmid.
- Fordøye pMigR1_TetR vektor med restriksjonsenzymer Xbal og Nco jeg å slippe TetR_IRES fragment. Isolere 1,25 kb innsatsen fragment.
- Ligere den 4,6 kb pcDNA6/TR og 1,25 kb TetR_IRES fragmenter. Transform ligation produktet inn kompetent E.coli og identifisere ønskede pcDNA6_TetR_IRES_blast konstruere ved hjelp av standard molekylærbiologiske teknikker.
2. Generasjon av Cell Lines stabilt Uttrykke TetR
- På dag 1, Seed 1x10 6 celler pr 10-cm vevskulturplaten bruke standard dyrkningsmedium (f.eks DMEM supplert med 10% FCS). Seed to plater, en for transfeksjon med pcDNA6_TetR_IRES_blast, og den andre som en negativ kontroll for blasticidin valg. Sørg for å bruke den laveste passasje mulig og anbefalt vekstmedium.
- På dag 2 transfektere en plate med 2 ug pcDNA6_TetR_IRES_blast hjelp Fugene 6 (E2691, Promega) etter produsentens instruksjoner. Ikke transfektere den andre platen.
- På dag 3, legge standard dyrkningsmedium inneholdende 5 ug / ml blasticidin til begge platene. Vær oppmerksom på at optimale valg konsentrasjonen kan variere for en gitt celle linje og kanskje need skal fastsettes på forhånd.
- På dag 4, dele cellene på 1/5, 1/25, 1/50 og 1/100 med 10-cm plater og standard dyrkningsmedium inneholdende 5 mg / ml blasticidin. Sørg for å merkes skikkelig plater som inneholder untransfected eller transfektert celler. Forbered to plater per fortynningssteg.
- Sjekk celler daglig, slik at alle cellene på untransfected platene har dødd i løpet av den første uken. Endre utvalg media hver 2-3 dager.
- Etter 1-2 uker, bør blasticidin-resistente kolonier begynner å vises. Velg skåler inneholdende 5-50 kolonier for å sikre at enkle kolonier kan plukkes.
- Når koloniene har nådd en diameter på omtrent 5 mm (eller større), isolere minst 12 uavhengige kloner med kloning sylindere å plukke enkeltkolonier. Overføre hver klone inn i en separat brønn i en 24-brønners vevskultur plate. Når konfluent, splitte cellene fra hver brønn inn i en enkelt brønn av en 6-brønns vevkultur-plate.
- Fortsett til kultur clde i valg medier. Når confluent, delte cellene fra hver brønn i to enkle brønner på et 6-brønns vevskulturplaten.
- For hver klon som skal testes, fryse en brønn av konfluente celler og høste celler i den andre brønnen for påfølgende testing ved immunoblotting.
- Oppdage TetR av Western blotting med monoklonalt anti-TET02 antistoff (MoBiTec GmbH). Husk å inkludere et lysat av foreldrenes cellelinje som en negativ kontroll.
- Velg 3 kloner med høyest TetR uttrykk og utvide hver klonal kultur. Fryse bestander av hver lovende klone så snart som mulig. Til slutt undersøke de molekylære og cellebiologiske parametere av interesse ved å sammenligne foreldrenes cellelinjer med TetR-uttrykker kloner. Velg "beste" klone med høyest TetR uttrykk som ikke viser noen endringer i de molekylære og cellebiologiske parametre av interesse.
3. Pilottesting av Pter og PT-Rex DEST30 Vektorer Expressing shRNA eller cDNA'ene, Henholdsvis
- Generere Pter plasmid med shRNA innlegg som beskrevet 12. Konstruer pT-Rex DEST30 vektor (12301-016, Invitrogen) som inneholder cDNA interessepunkt ved hjelp av Gateway-teknologi (Invitrogen). I tilfelle av cDNA uttrykk, vil tilsetning av en kode til cDNA senere lette deteksjon av eksogent uttrykte proteinet.
- Forbigående transfektere foreldrenes målcellen linje med Pter eller PT-Rex DEST30 plasmider (uttrykke enten shRNAs eller cDNA'ene av interesse) ved hjelp av transfeksjon reagens av valget. For testing av shRNA uttrykk plasmider, sikre høy transfeksjon effektivitet kan oppnås.
- Innhøsting transfektert celler og prosess for immunoblotting bruke de riktige antistoffene, forventer å oppdage en utarming eller overuttrykte din genet av interesse.
4. Generasjon Stabile cellelinjene med Tetracycline-induserbar (Tet-on) Expression of shRNAs eller cDNA'ene Bruke Pter eller PT-Rex DEST30 Vektorer
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et eksempel for den første karakterisering av RPE-1 cellelinjer stabilt uttrykkende TetR er vist i Figur 4. Merk at alle RPE-1 kloner uttrykker varierende nivåer av TetR (sammenlign søyle 2 og 5), mens Parental cellelinjen (som tjener som negativ kontroll) ikke uttrykker det eksogene TetR protein (Figur 4, en lane). Denne variasjonen i TetR uttrykk blant RPE-1 Tet-on cellekloner ventes, siden ekspresjon av TetR uttrykke plasmider er svært avhengig plasmidet integrering nettstedet.
Karakterisering av stabile RPE-1 Tet-on cellekloner uttrykker shRNAs rettet mot MST3 kinase viser at flere kloner må testes for å definere cellelinjene med den mest effektive uttømming av genet av interesse (figur 5). I det viste tilfellet (figur 5) cellekloner # 1, # 2 og # 3 ble valgt for videre analyse. Variasjonen in uttømming effektivitet forventes, siden ekspresjon av shRNA uttrykk er svært avhengig plasmidet integrering nettstedet.
Figur 1. Forskjellene mellom Tet-off og Tet-on ekspresjonssystemer vises. Tetracyklin (Tet) repressor protein (TetR) har blitt endret til enten (1) blokk initiering av transkripsjon ved binding til Tet-operatør (TO) i promotoren region ved tilsetning av tetracyklin (kalt Tet-off-system) eller (2) bindes til i fravær av tetracyklin (kalt Tet-on-systemet).
Figur 2. Beskrivelse av de to påfølgende manipulasjon nødvendige skritt for å generere human Tet-on cellelinjer med induserbar ekspresjon av shRNA eller cDNA av interesse. (f.eks serum sult svar, celleproliferasjon priser, eller uttrykk for markørproteiner), er den "beste" TetR-positive klone utvidet og lagret. Trinn 2: Generering av Tet-on cellelinjer med induserbar shRNA / cDNA uttrykk. De "beste" TetR-positive celler transfektert med Pter 12 for shRNA uttrykk eller med PT-Rex DEST30 (12301-016, Invitrogen) for cDNA uttrykk, og Blast / Zeocin eller Blast/G418 resistente kloner er valgt, henholdsvis. Flere individuelle cellekloner blir plukket, utvidet og skjermet av immunoblotting for tetracycline-induserbar knockdown eller ekspresjon av genet av interesse. Endelig, kloner av interesseer utvidet, re-testet og lagret.
Figur 3. Generering av pcDNA6_TetR_IRES_blast vektor. Den nygenererte pMigR1_TetR plasmid ble fordøyd med Xbal og Nco I, og det frigitte 1.25kb fragment inneholdende TetR og IRES (intern ribosom inngang nettsted) sekvenser ble klonet inn i den viste Xbal og NCO I områder av pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen). Den resulterende pcDNA_TetR_IRES_blast vektor uttrykker TetR og Blasticidin motstand genet (BlastR) med samme CMV arrangøren, og dermed sikre at alle Blasticidin resistente celler også hurtiginnsjekking TetR.
Figur 4. Analyse av RPE-en celle kloner stabilt transfektert med pcDNA / TetR_IRES_blast.Parental RPE-1 celler ble sammenlignet med RPE-1 celler stabilt uttrykker TetR ved immunoblotting hjelp av anti-TetR (øverst panel) og anti-alpha-tubulin antistoff (bunnpanelet).
Figur 5. . Analyse av RPE-en TetR-positive kloner stabilt transfektert med pTER_shMST3 å identifisere celler med tetracyklin-induserbar ekspresjon av shRNAs målretting MST3 ble kloner dyrket i fravær (-) eller nærvær (+) av tetracyklin (Tet) for 72 timers, før behandling for immunoblotting bruker anti-MST3 (øverst panel) og anti-alpha-tubulin antistoff (bunnpanelet).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi tror at Tet-on systemer sterkt lette analysen av genfunksjon, særlig i cellesystemer som er vanskelig å manipulere og / eller når den manipulerte genet er essensielt for celleoverlevelse. Videre tilbyr muligheten til å kontrollere genekspresjon ved svært spesifikke Tet-on systemer mulighet til å studere genfunksjoner på ulike stadier (for eksempel under cellesyklus progresjon eller veldefinerte differensiering prosesser). Metoden presenteres her at forskere å generere den ønskede stabile Tet-on cellelinjer innenfor en rimelig tidsramme (normalt 3-6 måneder, i stor grad avhengig av omfanget av molekylær og celle biologisk profilering som er nødvendig for å karakterisere TetR-positive cellelinjer). Den vellykkede generering og anvendelse av Tet-on cellelinjer, er imidlertid kritisk avhengig av flere faktorer.
Først, valg av celler med tilstrekkelig høy ekspresjon av TetRer nødvendig for å sikre undertrykkelse av strenge transkripsjon i fravær av tetracyklin. Like viktig, bør den første karakterisering av målcellene uttrykker TetR dekke alle mulige molekylære og celle biologiske parametre som skal undersøkes på lang sikt. I vår erfaring, er et godt karakterisert TetR-positive cellelinje et svært godt utgangspunkt for en rekke forskningsprosjekter.
Sekund, er det nødvendig å holde tetracyklin konsentrasjon så lav som mulig for å forhindre mulige mitogen effekt ved testing og analysering Tet-on kloner for shRNA / cDNA uttrykk. Hvis mulig bør tetracyklin konsentrasjonen ikke være høyere enn 2 ug / ml (fortrinnsvis mindre enn 2 pg / ml). Dessuten, siden tetracyklin har en halveringstid på omtrent 24 timer i vev cellekulturmedium, eksperimenter som siste flere dager bør vurdere ytterligere runder tetracyklin tillegg. Doksycyklin, et syntetisk tetracyklin alternativ, Kan også tas i betraktning når cytotoksiske nivåer av tetracyklin er av bekymring.
Tredje, bør testene brukes ulikt for cDNA og shRNA uttrykk. Mens Tet-on celler som uttrykker cDNA'ene vil lett gi målbare mengder av proteiner innen 24 timer, kan uttømming av endogene faktorer ved shRNA-mediert knockdown ta mye lengre tid. Vanligvis anbefaler vi å teste kloner uttrykker shRNAs bare 96 timer etter tetracyklin tillegg, noe som vil føre til reduserte nivåer av din genet av interesse selv om halveringstid av målet ditt er 24-timers. Eksempelet vist på fig 5 er et 'ideelle' screening resultat for shRNA-mediert uttømming, og modifikasjoner til testprotokoll kanskje være nødvendig for å definere den optimale slå ned forholdene. Sist, men ikke minst, ønsker vi å understreke det faktum at veletablerte screening verktøy (QRT-PCR sondene, antistoffer) vil i stor grad forenkle identifiseringen av dine ønskede cellekloner. </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker alle medlemmer av vårt laboratorium for personer diskusjoner. Vi takker Joanna Lisztwan og Christina Gewinner for kritisk lesning av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av BBSRC tilskuddet BB/I021248/1 og Wellcome Trust stipend 090090/Z/09/ZAH er en Wellcome Trust Forskning Karriereutvikling stipendiat ved UCL Cancer Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Tested Tet-free |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratories | P31-011 | 100 mg/ml in media |
| anti-TET02 | MoBiTec GmbH | TET02 | Use at 1/1000 to 1/2000 for WB |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg/ml in ethanol |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg/ml in water |
| Cloning cylinders | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | re-useable |
References
- Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant. Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).
- Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268, 1766-1769 (1995).
- Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553 (2002).
- McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. A. Gene silencing using micro-RNA designed hairpins. RNA. 8, 842-850 (2002).
- Miyagishi, M., Taira, K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).
- Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., Conklin, D. S. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev. 16, 948-958 (2002).
- Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).
- Sui, G., et al. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).
- Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 6047-6052 (2002).
- van de Wetering, M., et al. Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector. EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).
- Hergovich, A., et al. The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation. Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).
- Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication. Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).
- Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases. Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).
- Vichalkovski, A., et al. NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis. Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).
- Pear, W. S., et al. Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow. Blood. 92, 3780-3792 (1998).
