Summary
一种快速简便的方法来产生人类细胞系诱导的，可逆的基因表达或shRNA介导的，感兴趣的基因敲除。此方法使研究人员能够可靠地和高再现性操作的细胞系，是很难改变，通过瞬时转染的方法或常规的击倒/基因敲除策略。
Abstract
一个主要的方法在哺乳动物细胞生物学领域是操纵在选定的单元格线的兴趣基因的表达，的目的是显示一个或多个该基因的功能（次）瞬态/稳定过表达或敲除的基因的兴趣。不幸的是，这种做法是不合适的各种细胞生物学研究时，操纵细胞的生长/的增殖缺陷或不需要的细胞分化的基因表达的结果。因此，研究人员已经适应了四环素阻遏蛋白（四环素），采取从E.大肠杆菌四环素抗性操纵子1，生成非常高效和严格的监管系统，以表达在哺乳动物细胞中的cDNA 2,3。总之，四环素 - 已被修改，或者（1）块转录起始的绑定到在Tet-运算符（TO）的启动子区域中添加四环素（称为Tet-off系统）时，或（2）结合的TO在吨他没有四环素（称为的Tet-系统）（ 图1）。鉴于不便Tet-off系统需要四环素（它具有的半衰期为约24小时，在组织细胞培养基）的持续存在的Tet-系统上的已被更广泛地优化，在很紧的发展所导致的和高效的cDNA表达载体系统，在这里使用。
成立后不久的RNA干扰（RNAi）的基因敲除在哺乳动物细胞中，载体表达的短发夹RNA（shRNA片段）进行了描述，非常到的siRNA 5-11类似的功能。然而，这些shRNA介导的敲除的方法具有相同的限制，与传统的基因敲除策略，当靶基因的细胞存活是必不可少的，因为稳定的消耗是不可行的。为了克服这种局限性，面包车韦特灵等 12修改的shRNA表达载体pSUPER 5
在这里，我们描述了一个方法，有效地生成稳定的人的春节，可靠地驱动“诱导表达或枯竭，感兴趣的基因的细胞株。使用这种方法，我们已经成功生成春节细胞株，大大促进了分析的的MST / hMOB / NDR级联中心体13,14和凋亡信号15,16。在此报告中，我们描述我们给出的载体，除了描述的两个连续的操作步骤是必要的以有效地产生人的Tet-细胞系（ 图2）。此外，除了概述的产生的一个协议，用于人类的Tet-细胞系中，我们将讨论有关的技术程序和表征的Tet-细胞上的关键方面。
Protocol
1。克隆pcDNA6_TetR_IRES_blast
- 正如图3中所示，执行pcDNA6/TR质粒（V1025-20，Invitrogen公司）用限制性酶XbaⅠ和Nco I位删除的四环素基因和启动子的杀稻瘟素的电阻（BlastR）基因的部分的摘要。隔离4.6 kb的载体片段。
- 要删除从四环素基因的多聚腺苷酸化序列，通过PCR引入XhoⅠ位点后，立即停止密码子，四环素，同时节省的Xba I位点的cDNA的5'末端的cDNA。使用限制性内切酶XbaⅠ和XhoⅠ位生成pMigR1_TetR质粒亚克隆所得片段插入pMigR1 17，。
- 消化pMigR1_TetR载体用限制性酶XbaⅠ和Nco I位，释放TetR_IRES片段。隔离1.25 kb的插入片段。
- 结扎：4.6 KB pcDNA6/TR和1.25 kb的TetR_IRES片段。风帆连接产物ansform主管大肠杆菌，并使用标准的分子生物学技术确定所需的pcDNA6_TetR_IRES_blast结构。
2。代稳定表达的细胞系四环素
- 在第1天，种子1×10 6个细胞每10厘米的组织培养板中，使用标准的生长培养基（ 例如，用10％FCS的DMEM培养液）。种子两块板，一个用于转染pcDNA6_TetR_IRES_blast，和其他的杀稻瘟素的选择作为阴性对照。确保使用最低的通道可能和推荐的生长培养基中。
- 在第2天，转染2微克pcDNA6_TetR_IRES_blast使用Fugene 6（E2691，Promega）中，按照生产商的说明的一个板。不要转染第二板。
- 第3天，标准生长介质中含有5微克/毫升杀稻瘟到这两个板块。请注意，对于一个给定的细胞系的最佳选择的浓度可能会有所不同，可能Ň电火工品必须预先确定。
- 在第4天，细胞分裂，在1/5，1/25，1/50和1/100使用10-cm的板和标准的生长培养基中含有5毫克/毫升的杀稻瘟素。确保正确标注板未转染或转染的细胞。准备两个板块每股稀释步骤。
- 每天检查细胞，确保所有细胞的转染板的第一个星期内相继去世。更改选择媒体每隔2-3天。
- 1-2周后，杀稻瘟素抗性集落开始出现。选择板，含有5〜50的菌落，以确保单个菌落可以拾取。
- 当菌落已经达到了一个直径大约5毫米（或更大），隔离至少12个独立的克隆，使用克隆缸挑选单个菌落。每个克隆转移到一个单独的24孔组织培养板的孔。当融合时，从每个孔中的细胞分裂成一个单一的孔的6孔组织培养板中。
- 继续文化CL在选择媒体的。当融合时，从每个孔中的分裂细胞分为两个单独的6孔组织培养板的孔中。
- 对于每个要测试的克隆，冻结一个孔的融合细胞和收获细胞，通过免疫印迹法的其他以及随后的测试。
- 通过Western印迹法使用小鼠单克隆抗TET02抗体（MoBiTec联系）检测四环素。请记住，包括作为阴性对照的亲代细胞系的裂解物。
- 四环素表达最高和扩大选择3个克隆，每一个克隆培养。尽快冻结股票的每一个有前途的克隆。最后，通过比较亲本细胞系与四环素表达克隆研究的分子和细胞生物学参数。选择“最好”的克隆与四环素表达最高不显示任何改变的分子和细胞生物学参数。
3。试点测试pTER和PT-REX DEST30载体的表达ING shRNA或的cDNA，
- 生成pTER的shRNA插入质粒的说明12。构建的PT-，雷克斯DEST30载体（12301-016 Invitrogen公司）的cDNA使用网关技术（Invitrogen公司）的利益。以cDNA表达的情况下，添加了标签的cDNA将购买方便外源性表达的蛋白质的检测。
- 瞬时转染父母的靶细胞系与pTER或PT-REX的DEST30的质粒（无论是的shRNA表达或cDNA的利益）的转染试剂的选择。的shRNA表达载体的测试，确保可以达到较高的转染效率。
- 收获转染细胞和免疫过程使用相应的抗体，期待您感兴趣的基因检测耗尽或过度表达。
4。与四环素诱导（TET-ON）的shRNA的表达或cDNA使用pTER或PT-REX DEST30载体的的稳定细胞系产生的
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Representative Results
的RPE-1细胞系稳定表达四环素的初始特性的一个例子如图4所示。注意所有的RPE-1克隆表达不同水平的四环素- （比较泳道2和5），而线（作为阴性对照）的亲本细胞不表达外源性四环素蛋白（ 图4，泳道1）。四环素 - 表达RPE-1之间的这种变化的Tet-细胞克隆是意料之中的，因为四环素表达质粒的表达是高度依赖于质粒的整合位点。
表征的稳定的RPE-1的Tet-细胞克隆表达的shRNA MST3激酶针对显示的几个克隆进行测试，以便定义的细胞系，与感兴趣的基因（ 图5）的最有效的耗尽。在图示的情况下（ 图5）的细胞克隆＃1，＃2和＃3被选择用于进一步分析。的变化我Ň损耗效率是意料之中的，因为shRNA表达的表达是高度依赖于质粒的整合位点。
图1。之间的差异的Tet-off和表达系统的Tet-被示出。四环素（四环素）阻遏蛋白（四环素- ）已被修改，以通过结合到在Tet-运算符（TO）或者（1）块转录起始的启动子区域添加四环素（称为Tet-off系统）时，或（2）结合到TO在四环素的情况下（称为的Tet-系统）。
图2。描述的两个连续操作的必要步骤来生成人类的Tet-与景点的shRNA或cDNA的诱导表达的细胞系上。 如血清饥饿的反应，细胞增殖率，或标记蛋白的表达）的测试后，'最好'的四环素阳性克隆扩大和存储。第2步：生成四环素诱导的shRNA /基因表达的细胞株。 “最好的”四环素阳性细胞转染shRNA表达或pTER 12与PT-REX DEST30（12301-016，Invitrogen公司）的基因表达，高炉/吉欧或Blast/G418性克隆的选择，。几个个别的细胞克隆被拾取，扩大，并筛选四环素诱导击倒或感兴趣的基因的表达的免疫印迹。最后，克隆被扩展，再经测试和储存。
图3。代的pcDNA6_TetR_IRES_blast向量的新生成的pMigR1_TetR质粒用 XbaⅠ 和 NcoⅠ消化，释放的1.25kb片段，它含有TetR和IRES（内部核糖体进入位点）的序列显示的XbaⅠ和 NcoⅠ位点克隆到pcDNA6/TR（V1025-20，Invitrogen公司）。将所得pcDNA_TetR_IRES_blast矢量表示TetR和杀稻瘟菌素抗性基因（BlastR）使用相同的CMV启动子，从而确保所有的杀稻瘟菌素抗性细胞也表达四环素 - 。
图4。分析RPE-1细胞克隆稳定转染质粒pcDNA / TetR_IRES_blast。家长的RPE-1细胞相比，RPE-1细胞中稳定表达，通过免疫印迹法使用抗四环素（顶板）和抗-α-微管蛋白抗体（底部面板）的四环素。
图5。稳定转染的RPE-1四环素阳性克隆分析与pTER_shMST3。要识别的shRNA靶向MST3四环素诱导型表达的细胞，克隆生长72小时的情况下（ - ）或存在（+），四环素（四环素），处理之前用于免疫印迹使用反MST3（顶板）和抗-α-微管蛋白抗体（底部面板）。
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Discussion
我们相信的Tet-系统上，大大方便了对基因功能的分析，特别是在电池系统是难以操纵和/或当操纵基因的细胞的存活是必需的。此外，能够控制基因的表达具有高度特异性春节的系统上提供了一个机会来研究基因功能，在不同的阶段（例如在细胞周期进展或明确定义的分化过程）。这里介绍的方法使研究人员能够生成所需的稳定的Tet-细胞株在合理的时间内（一般为3-6个月，很大程度上取决于四环素阳性的特性是必要的程度，分子和细胞生物学分析，细胞系）。成功的产生和应用四环素对细胞系，但是，是极其依赖于几个因素。
首先，选择的细胞以足够高的表达四环素是必需的，以确保在没有严格的转录镇压四环素。同样重要的是，初始特性的靶细胞表达四环素应当涵盖所有可能的分子和细胞生物学上的长期研究的参数将被。根据我们的经验，一个良好的特点四环素阳性细胞株，为众多的研究项目是一个很好的起点。
其次，它是必要的，以保持尽可能的低，以防止可能的多效性作用的四环素浓度时，测试和分析的Tet-为短发夹/ cDNA表达克隆。如果可能的话，四环素浓度不应高于2微克/毫升（优选地低于2微克/毫升）。此外，由于四环素具有在组织细胞的培养基中，过去数天的实验，应考虑额外轮四环素此外，约24小时的半衰期。多西环素，合成四环素替代，也可以被认为四环素的细胞毒性水平时的关注。
三，测试适用于不同的cDNA和shRNA表达。虽然春节细胞上表达的cDNA容易产生蛋白质的检测量的24小时内，消耗的内生因素介导的短发夹击倒需要更长的时间。一般情况下，我们建议测试克隆的shRNA表达只有96个小时后，四环素此外，这将导致您感兴趣的基因水平的下降，即使你的目标的半衰期是24小时。在图5中所示的例子中表示介导的短发夹耗尽“理想”的筛选结果，可能需要修改测试协议，以确定最佳的条件击倒。最后，但并非最不重要的一点是，我们想强调的是，完善的筛检工具（定量RT-PCR探针，抗体），将大大方便识别您想要的细胞克隆。/ P>
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢我们实验室的所有成员的有益讨论。我们感谢的乔安娜Lisztwan和克里斯蒂娜Gewinner批判性阅读的手稿。本工作受的BBSRC授予BB/I021248/1和威康信托基金会资助090090/Z/09/ZAH是一个威康信托基金会的研究生涯发展的伦敦大学学院癌症研究所的研究员。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Tested Tet-free |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratories | P31-011 | 100 mg/ml in media |
| anti-TET02 | MoBiTec GmbH | TET02 | Use at 1/1000 to 1/2000 for WB |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg/ml in ethanol |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg/ml in water |
| Cloning cylinders | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | re-useable |
References
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