Summary
Indüklenebilir ve ilgilenilen genin reversibl cDNA aşırı veya shRNA aracılı knock-down ile insan hücre hatları oluşturmak için bir hızlı ve kolay yolu. Bu yöntem geçici transfeksiyon yöntemleri veya konvansiyonel knockdown / nakavtla stratejileri değiştirmek zordur güvenilir ve son derece tekrarlanabilir işlemek hücre hatları için araştırmacılar sağlar.
Abstract
Memeli hücre biyolojisi alanında önemli bir yaklaşımı gösterir etmek amacı ile, seçilen hücre hatları ilgi genlerinin ifadesi manipülasyon bir ya da bu genin geçici / kararlı ekspresyonu ya da devirme kullanılarak gen fonksiyonu (ler) in çeşitli ilgi. Ne yazık ki, çeşitli hücre biyolojik araştırmalar için bu yaklaşımın uygun olduğunda hücre büyümesi / çoğalması kusurları veya istenmeyen hücre farklılaşmasında gen ekspresyonu sonucu manipülasyonlar. Bu nedenle, araştırmacılar E. alınan Tetrasiklin repressör proteini (Tetr), adapte olması coli, tetrasiklin direnci operon 1, 2,3, memeli hücrelerinde cDNA ifade etmek için çok verimli ve sıkı düzenleyici sistemleri üretmek için. Kısacası, Tetr de TO tetrasiklin (Tet-off sistemi olarak adlandırılır) ilavesinden sonra yükseltici bölgesinde Tet-operatör (TO) bağlanarak veya (2) bağlama ile transkripsiyon (1) blok başlatma ya da için modifiye edilmiştir ttetrasiklin onun yokluğunda (sistem Tet-on adlandırılır) (Şekil 1). Tet-off sistemi tetrasiklin sürekli varlığı (hangi doku hücre kültürü ortamında yaklaşık 24 saat bir yarılanma ömrüne sahiptir) gerektirir rahatsızlık Verilen Tet-sistem daha kapsamlı çok sıkı geliştirme sonuçlanan optimize edilmiştir ve cDNA ifade vektörü için etkili sistemler burada kullanılan şekliyle.
Yakında kısa saç tokası RNA'lar (shRNAs) eksprese 4 memeli hücrelerinde, vektörler gen demonte için RNA interferans (RNAi) kurulması sonrası siRNA'lar 5-11 çok benzer işlevi tanımlanmıştır. Gen hedefleri hücresel hayatta kalmak için gerekli olan zaman stabil tükenmesi mümkün değildir Bununla beraber, bu shRNA aracılı knockdown yaklaşımları, konvansiyonel nakavt stratejiler aynı sınırlama var. Bu sınırlandırmayı aşmak için, van de Wetering ark. 12. shRNA ekspresyon vektörü pSUPER modifiye 5
Burada, biz verimli üretmek için bir yöntem tarif istikrarlı insan Tet-on güvenilir indüklenebilir aşırı veya ilgi gen tükenmesi ya götürmek hücre hatları. Bu yöntemi kullanarak, başarılı yarattı Tet-önemli ölçüde sentrozom 13,14 ve 15,16 sinyalizasyon apoptoz MST / hMOB / NDR çağlayan analizi kolaylaştırdı hücre hatları. Bu yazıda, tercih edilen bizim vektörleri tarif verimli üretilmesi için gerekli olan iki ardışık işleme adımları tanımlayan ek olarak insan Tet-on hücre hatları (Şekil 2). Dahası, nesil için bir protokol taslağını yanısıra insan Tet-on hücre hatları, biz kritik teknik prosedürleri ile ilgili yönlerini ve karakterizasyonu hücreleri Tet-üzerinde görüşecek.
Protocol
1. PcDNA6_TetR_IRES_blast klonlanması
- Şekil 3 'de gösterildiği üzere, kısıtlama enzimleri xba I ve NCO bir gen ve Tetr blasticidin direnci (BlastR) gen promoter çıkarmak için birlikte plazmid pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen) kısmi bir özet gerçekleştirir. 4.6 kb vektör fragmanı ayırın.
- Tetr geninden poliadenilasyon sekansı kaldırmak için, bir Xho I site hemen Tetr bir stop kodonu cDNA 5'end de muhafaza xba I site süre sonra cDNA, PCR ile getirmektedir. PMigR1_TetR plazmid üretmek için kısıtlama enzimlerinin xba I ve Xho I ile pMigR1 17 içine sonuçtaki fragman Subclone.
- TetR_IRES fragmanı serbest restriksiyon enzimleri xba I ve Astsubay ben pMigR1_TetR vektör sindirmek. 1.25 kb ekleme parçası ayırın.
- 4.6 kb pcDNA6/TR ve 1.25 kb TetR_IRES parçaları Arter. TrYetkili E.coli içine ligasyon ürünü ansform ve standart moleküler biyoloji teknikleri kullanarak istenen pcDNA6_TetR_IRES_blast yapı tanımlar.
2. Hücre Hatları Nesil stabil Tetr ifade
- Günde 1, Tohum 1x10 Açık standart büyüme ortamı kullanılarak 10 cm doku kültürü plaka başına 6 hücre (örneğin DMEM% 10 FCS ile takviye). Tohum iki levha, pcDNA6_TetR_IRES_blast ile transfeksiyon için, diğeri ise blasticidin seçimi için bir negatif kontrol olarak, diğer. Mümkün olan en düşük geçiş ve tavsiye edilen büyüme ortamında kullanmak için emin olun.
- Günde 2 üzerinde, transfekte üreticinin yönergelerini izleyerek Fugene 6 (E2691, Promega) kullanılarak pcDNA6_TetR_IRES_blast 2 mikrogram ile bir tabak. Ikinci plaka transfekte etmeyin.
- 3. günde, iki tabak için 5 mg / ml blasticidin içeren standart büyüme ortamı ekleyin. Optimum seçimi konsantrasyonu belirli bir hücre hattı için farklı olabileceğini lütfen unutmayın olabilir nönceden belirlenecek eed.
- 4. günde, 10 cm tabak ve 5 mg / ml blasticidin içeren standart büyüme ortamı kullanılarak 1/50 ve 1/100, 1/25, 1/5 de hücreleri bölme. Düzgün untransfected veya transfekte hücreler içeren plakalar etiketlemek için emin olun. Seyreltme adım başına iki tabak hazırlayın.
- Untransfected plakalar üzerinde tüm hücreleri ilk hafta içinde öldüğü sağlanması, günlük hücreleri denetleyin. 2-3 günde bir seçim ortamı değiştirin.
- 1-2 hafta sonra, blasticidin dayanıklı koloniler görünmeye başlaması gerekir. Tek koloniler toplandı olmasını sağlamak için 5-50 ihtiva eden koloniler plakalar seçin.
- Koloniler yaklaşık olarak 5 mm (ya da daha büyük) bir çapa ulaştığı zaman, tek koloniler almak için klonlama silindir kullanılarak, en az 12 bağımsız klon izole eder. 24 iyi doku kültürü plaka ayrı bir kuyuya her klon aktarın. Ne zaman birleşmiş, iyi bir 6-doku kültür plakasının tek tek her bir kuyu gelen hücreleri ayrıldı.
- Kültür cl DevamSeçimi medya olanları. 6-iyi doku kültürü plaka iki tek kuyulara her kuyudan zaman konfluent, split hücreler.
- Her klon test edilmesi için immunblotting sonraki test için başka bir kuyuya confluent hücreleri ve hasat hücreleri de bir dondurma.
- Batı fare monoklonal anti-TET02 antikor (Mobitec GmbH) kullanarak blotting ile Tetr algıla. Bir negatif kontrol olarak ebeveyn hücre hattının bir lizat dahil unutmayınız.
- Yüksek Tetr ifade ile 3 klon seçin ve her klonal kültür genişletin. En kısa sürede, her umut verici klonu stokları dondurun. Son olarak, tetr-salgılayan klonlar ile karşılaştırarak ana hücre soyu ile, ilgilenilen ve moleküler biyolojik hücre parametreleri inceleyin. Ilgi moleküler ve hücre biyolojisi parametrelerinde herhangi bir değişiklik göstermez yüksek Tetr ifadesi ile 'en iyi' klon seçin.
3. Pter ve pT-Rex DEST30 Vektörler Pilot Test ExpressSırasıyla ing shRNA veya cDNA,
- 12 açıklandığı gibi shRNA ekler ile plazmid pter oluşturun. Pt-Rex DEST30 vektör (12301-016, Invitrogen) ve ağ geçidi teknolojisi (Invitrogen) kullanılarak ilgi cDNA içeren Construct. CDNA ifade etmesi halinde, cDNA ile bir etiketin ilave daha sonra ifade edilmiş protein Eksojen olarak tespit kolaylaştıracaktır.
- Geçici seçim transfeksiyon reaktif kullanılarak pter veya pT-Rex DEST30 plazmidler (shRNAs veya ilgi cDNAlarının da ifade) ile Ebeveyn hedef hücre hattı transfekte. ShRNA ifade plazmid test için, yüksek transfeksiyon verimlilik elde edilebilir sağlamak.
- Hasat ilgi gen tükenmesi veya aşırı algılamak için bekliyor, uygun antikorlar kullanılarak immunoblotting için hücreleri ve süreç transfekte.
4. Tetrasiklin-indüklenebilir (Tet-on) pter veya pT-Rex DEST30 Vektörler kullanma shRNAs veya cDNAlann Expression Kararlı Hücre Hatları Üretimi
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stabil bir şekilde eksprese eden Tetr RPE-1 hücre hatları ilk karakterizasyonu için bir örneği Şekil 4'te gösterilmektedir. Ebeveyn hücre hattı (negatif kontrol olarak görev yapar) eksojen Tetr proteini ifade etmez ise tüm RPE-1 klonları (Şekil 4, şeritli 1), (şerit 2 ve 5 karşılaştırın) Tetr çeşitli düzeylerde ifade unutmayın. RPE-1 arasında Tetr ekspresyonu Bu varyasyon Tet-on hücre klonlarının bekleniyor, plazmid ifade Tetr ifadesi yana plazmid entegrasyon sitede son derece bağlıdır.
Istikrarlı RPE-1 Tet-on hücre klonlarının MST3 kinaz yöneltilmiş ifade shRNAs birçok klonlar ilgi gen (Şekil 5) en verimli tükenmesi ile hücre çizgilerini belirlemek amacıyla test edilmesi olduğunu göstermektedir. Karakterizasyonu Örnek gösterilen durumda (Şekil 5) hücre klonu # 1, # 2 ve # 3 daha ileri analiz için seçilmiştir. Varyasyon ishRNA ifade ifade plazmid entegrasyonu sitesinde bağımlı olduğundan n tükenmesi verimlilik beklenmektedir.
Şekil 1. Tet-off ve Tet-ekspresyon sistemleri arasındaki farklılıklar gösterilmektedir. Tetrasiklin (Tet) repressör proteini (Tetr) yükselticisinde Tet-operatörü (TO) bağlanarak transkripsiyon (1) blok inisiyasyon birine modifiye edilmiştir tetrasiklin (adlandırılan Tet-kapalı sistem) ilavesi üzerine bölgedeki ya da tetrasiklin (sistem Tet-on olarak adlandırılır) yokluğunda TO (2) bağlanır.
Şekil 2. Üretilmesi için gerekli iki birbirini takip eden manipülasyon adım açıklaması insan Tet-on shRNA ya da ilgi cDNA indüklenebilir ifade ile hücre çizgileri. (örneğin serum açlık yanıtı, hücre çoğalması oranları, ya da marker proteinlerin ekspresyonu) için test ettikten sonra, 'en iyi' Tetr pozitif klon genişledi ve saklanır. Adım 2: Nesil Tet-on indüklenebilir shRNA / cDNA ifade ile hücre hatları. 'En iyi' Tetr-pozitif hücreler shRNA ifade pter 12 veya cDNA ifade pT-Rex DEST30 (12301-016, Invitrogen) ile transfekte edilir ve Şok / Zeocin veya Blast/G418 dirençli klonlar sırasıyla seçilir. Çeşitli bireysel hücre klonları, aldı genişledi ve faiz geninin Tetrasiklin-indüklenebilir demonte veya ifade için immunblotting taranmaktadır. Ilgi çekici olarak, klonların, genişletilmiş yeniden test ve saklanır.
Şekil 3,. PcDNA6_TetR_IRES_blast vektör üretimi. Plazmid yeni jenere pMigR1_TetR xba I ve NCO I ile sindirildi ve Tetr ve IRES içeren serbest 1.25kb parçası (dahili ribozom giriş bölgesini) sekansları gösterilen xba I ve NCO bir sitesi içine klonlandı pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen). Elde edilen vektör pcDNA_TetR_IRES_blast böylece bu bütün Blasticidin dirençli hücreler de ekspres Tetr sağlanması, aynı CMV promoter kullanılarak Tetr ve Blasticidin direnç geninden (BlastR) ifade eder.
Şekil 4. RPE-1 hücre klonları analiz stabil bir şekilde pcDNA / TetR_IRES_blast ile transfekte.Ebeveyn RPE-1 hücreleri, stabil bir şekilde anti-tetr (üst panel) ve anti-alfa-tubulin antikorlar (alt panel) ile immünoblot yoluyla Tetr ifade RPE-1 hücreleri ile karşılaştırılmıştır.
Şekil 5,. ., 72 saat için tetrasiklin (Tet) veya varlığında (+) (-) RPE-1-tetr pozitif klon analiz pTER_shMST3 stabil olarak transfekte edilmiş MST3 hedefleme shRNAs bir tetrasiklin ile indüklenebilir ifade hücreleri belirlemek için klonlar yokluğunda yetiştirildi önce anti-MST3 (üst panel) ve anti-alfa-tübülin antikorlarının (alt panel) kullanarak immunoblotting için işleme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz, Tet-on sistemi büyük ölçüde özellikle manipüle gen hücrenin hayatta kalması için gerekli olan zaman idare ve / veya zor olan hücre sistemleri, gen fonksiyonu analizini kolaylaştırmak inanıyoruz. Ayrıca, son derece spesifik Tet-on sistemi ile gen ekspresyonu kontrol etme yeteneği farklı aşamalarında (hücre siklus progresyonu veya iyi tanımlanmış farklılaşma süreçleri sırasında örneğin) genlerin fonksiyonlarının çalışma fırsatı sunuyor. Burada sunulan yöntem araştırmacılar oluşturmak sağlayacak istenen kararlı Tet-büyük ölçüde Tetr-pozitif karakterizasyonu için gerekli olan moleküler ve hücre biyolojisi profilleme ölçüde bağlı makul bir zaman çerçevesi (normalde 3-6 ay içinde hücre hatları hücre serileri). Başarılı bir şekilde üretilmesi ve uygulama üzerine, Tet-hücre hatları, bununla birlikte, çeşitli faktörlere kritik bağlıdır.
İlk olarak, Tetr yeterince yüksek bir ifade ile hücrelerin seçiminitetrasiklin yokluğunda transkripsiyon arasında sıkı baskı sağlamak için gereklidir. Aynı derecede önemli, Tetr ifade hedef hücrelerin başlangıç karakterizasyonu uzun vadede ele alınacaktır tüm olası moleküler ve hücre biyolojisi parametreleri kapsamalıdır. Bizim deneyim, iyi karakterize Tetr-pozitif hücre hattı çok sayıda araştırma projeleri için çok iyi bir başlangıç noktasıdır.
İkincisi, test ve shRNA / cDNA ifade klonlar Tet-analiz etmek mümkün olduğunda pleiotropik etkilerini önlemek için mümkün olduğunca düşük tetrasiklin konsantrasyonda tutabilmek için gereklidir. Eğer mümkünse, tetrasiklin konsantrasyonu 2 mg / ml (2 mcg / ml 'den tercihen düşük) daha yüksek olmamalıdır. Ayrıca, tetrasiklin doku hücre kültür ortamı, son birkaç gün tetrasiklin eklenmesi ek mermi düşünmelisiniz deneylerde yaklaşık 24 saat bir yarılanma ömrüne sahiptir beri. Doksisiklin, tetrasiklin sentetik bir alternatif, Tetrasiklin sitotoksik seviyeleri endişe olduğunda da kabul edilebilir.
Üçüncü olarak, test cDNA ve shRNA ifade için farklı şekilde uygulanabilir olmalıdır. Tet-on hücreleri ifade cDNAlarının kolay 24 saat içindeki proteinler saptanabilir miktarda üretecek olsa da, shRNA-aracılı knockdown endojen faktörlerin tükenmesi çok daha uzun sürebilir. Genel olarak, biz hedef yarı ömrü 24 saat bile ilgi gen düzeylerinin düşmesine yol açacaktır tetrasiklin eklenmesi sonrasında shRNAs sadece 96 saat ifade klonları test etmenizi öneririz. Şekil 5 'de gösterilen örnek shRNA-aracılı tükenmesi için bir "ideal" tarama sonucu temsil eder, ve test protokolü değişiklikler koşullar aşağı optimum vuruş tanımlamak için gerekli olabilir. Son fakat en az değil, biz iyi kurulmuş tarama araçları (qRT-PCR probları, antikorlar) büyük ölçüde istenilen hücre klonlarının belirlenmesini kolaylaştıracaktır gerçeği vurgulamak istiyorum. </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz yararlı tartışmalar için laboratuarımızda tüm üyelerine teşekkür ederim. Biz yazının eleştirel okuma Joanna Lisztwan ve Christina Gewinner ederim. Bu çalışma BBSRC hibe BB/I021248/1 tarafından desteklenen ve Wellcome Trust hibe 090090/Z/09/ZAH UCL Kanser Enstitüsü'nde Wellcome Trust Araştırma Kariyer Geliştirme akademisyendir edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Tested Tet-free |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratories | P31-011 | 100 mg/ml in media |
| anti-TET02 | MoBiTec GmbH | TET02 | Use at 1/1000 to 1/2000 for WB |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg/ml in ethanol |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg/ml in water |
| Cloning cylinders | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | re-useable |
References
- Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant. Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).
- Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268, 1766-1769 (1995).
- Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553 (2002).
- McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. A. Gene silencing using micro-RNA designed hairpins. RNA. 8, 842-850 (2002).
- Miyagishi, M., Taira, K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).
- Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., Conklin, D. S. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev. 16, 948-958 (2002).
- Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).
- Sui, G., et al. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).
- Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 6047-6052 (2002).
- van de Wetering, M., et al. Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector. EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).
- Hergovich, A., et al. The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation. Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).
- Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication. Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).
- Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases. Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).
- Vichalkovski, A., et al. NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis. Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).
- Pear, W. S., et al. Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow. Blood. 92, 3780-3792 (1998).
