Summary
En snabb och enkelt sätt att skapa humana cellinjer med inducerbar och reversibla cDNA överuttryck eller shRNA-medierad knock-down av genen av intresse. Denna metod gör det möjligt för forskare att tillförlitligt och mycket reproducerbart manipulera cellinjer som är svåra att förändra genom transient transfektion metoder eller konventionella knockdown / knockout strategier.
Abstract
En viktig metod inom området för däggdjurs cellbiologi är manipulation av uttrycket av gener av intresse i utvalda cellinjer, i syfte att avslöja ett eller flera av genens funktion (er) med användning av övergående / stabil överexpression eller ÖVERVÄLDIGANDE av genen av intresse. Tyvärr, för olika cellbiologiska undersökningar detta tillvägagångssätt är olämpligt när manipulationer av genuttryck resulterar i celltillväxt / spridning fel eller oönskad celldifferentiering. Därför har forskare anpassat Tetracyklin repressorprotein (TetR), som tagits från E. E. coli tetracyklinresistens operonet 1, för att generera mycket effektiva och tät regelsystem för att uttrycka cDNA i däggdjursceller 2,3. I korthet har TetR ändrats till antingen (1) blockera initiering av transkription genom bindning till Tet-operatören (TO) i promotorregionen vid tillsats av tetracyklin (benämnd Tet-off system) eller (2) binder till TO i tHan frånvaro av tetracyklin (kallas Tet-on-system) (figur 1). Med tanke på olägenheten att Tet-off system kräver kontinuerlig närvaro av tetracyklin (som har en halveringstid av ca 24 timmar i vävnadskultur cellodlingsmedium) Tet-på systemet har mer utförligt optimerats, vilket resulterar i utvecklingen av mycket snäva och effektiva vektorsystem för cDNA-uttryck som används här.
Strax efter inrättandet av RNA-interferens (RNAi) för gen ÖVERVÄLDIGANDE i däggdjursceller 4, vektorer som uttrycker korta hårnål RNA (shRNAs) beskrevs som fungerar mycket likt siRNA 5-11. Dessa shRNA-medierade knockdown metoder har samma begränsning som konventionella knockout strategier, eftersom en stabil utarmning är inte möjligt när genen mål är avgörande för cellulär överlevnad. För att övervinna denna begränsning, van de Wetering et al. 12 ändrade shRNA expressionsvektorn pSUPER 5
Här beskriver vi en metod för att effektivt generera en stabil human Tet-på cellinjer som tillförlitligt driver antingen inducerbar överuttryck eller utarmning av genen av intresse. Med denna metod har vi genererat framgång Tet-on cellinjer som avsevärt underlättade analysen av MST / hMOB / NDR kaskad i centrosome 13,14 och apoptos signalering 15,16. I denna rapport beskriver vi våra vektorer av val, förutom att beskriva de två på varandra följande manipulation steg som krävs för att effektivt generera mänskligt Tet-on cellinjer (Figur 2). Dessutom, förutom beskriver ett protokoll för generering av humana Tet-on cellinjer kommer vi att diskutera kritiska aspekter avseende de tekniska förfaranden och karakterisering av Tet-på celler.
Protocol
1. Kloning av pcDNA6_TetR_IRES_blast
- Såsom illustreras i figur 3, utför en partiell klyvning av plasmiden pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen) med restriktionsenzymerna Xbal och Ncol för att avlägsna TetR-genen och promotorn för blasticidin motståndet (BlastR) genen. Isolera 4,6 kb vektorfragmentet.
- För att ta bort polyadenyleringssekvens från TetR-genen, införs genom PCR ett Xhol-ställe omedelbart efter stoppkodonet av TetR-cDNA medan bevara Xbal-stället vid 5'-änden av cDNA. Subklona det resulterande fragmentet in i pMigR1 17 med användning av restriktionsenzymer Xbal och Xhol för att generera pMigR1_TetR plasmiden.
- Smälta pMigR1_TetR vektorn med restriktionsenzymerna Xbal och Ncol för att frigöra TetR_IRES fragmentet. Isolera 1,25 kb inlägget fragmentet.
- Ligera 4,6 kb pcDNA6/TR och 1,25 kb TetR_IRES fragment. Transform ligeringsprodukten i kompetent E. coli och identifiera den önskade pcDNA6_TetR_IRES_blast konstruktionen med molekylärbiologiska standardtekniker.
2. Generering av cellinjer som stabilt uttrycker TetR
- På dag 1, Seed 1x10 6 celler per 10-cm vävnadsodlingsplatta med vanliga tillväxtmedium (t.ex. DMEM med 10% FCS). Frö två plattor, en för transfektion med pcDNA6_TetR_IRES_blast, och den andra som en negativ kontroll för blasticidin val. Säkerställ att använda lägsta möjliga passagen och den rekommenderade tillväxtmediet.
- På dag 2, transfektera en skylt med 2 pg pcDNA6_TetR_IRES_blast med Fugene 6 (E2691, Promega) enligt tillverkarens anvisningar. Undvik transfektera inte den andra plattan.
- På dag 3, lägg standard tillväxtmedium innehållande 5 pg / ml blasticidin till båda plattorna. Observera att den optimala valet koncentrationen kan variera för en given cellinje och kanske nEed bestämmas i förväg.
- På dag 4, dela celler vid 1/5, 1/25, 1/50 och 1/100 med 10-cm plattor och standard tillväxtmedium innehållande 5 mg / ml blasticidin. Se till att korrekt märka plattor innehållande otransfekterade eller transfekterade celler. Bered två plattor per utspädning steg.
- Kolla celler dagligen och se till att alla celler på otransfekterade plattorna har dött under den första veckan. Ändra urval medier var 2-3 dagar.
- Efter 1-2 veckor bör blasticidin-resistenta kolonier börja visas. Välj därför plattor innehållande 5 till 50 kolonier för att enstaka kolonier kan plockas.
- När kolonier har nått en diameter av ungefär 5 mm (eller större), isolera minst 12 oberoende kloner med kloningscylindrar att plocka enskilda kolonier. Överför varje klon till en separat brunn i en 24-brunnars vävnadsodlingsplatta. När sammanflytande, dela cellerna från varje brunn i en enda brunn i en 6-brunnars vävnadsodlingsplatta.
- Fortsätt till kultur CLde i urval media. När sammanflytande, delade celler från varje brunn i två separata brunnar av en 6-brunnars vävnadsodlingsplatta.
- För varje klon som skulle testas, frysa en brunn av konfluenta celler och skörd i den andra bra för efterföljande testning genom immunoblotting.
- Detect TetR genom Western blotting med användning av mus-monoklonal anti-TET02 antikropp (Mobitec GmbH). Kom ihåg att inkludera ett lysat av den parentala cellinjen som en negativ kontroll.
- Välj 3 kloner med högsta TetR uttryck och expandera varje klonal kultur. Freeze lager av varje lovande klonen så snart som möjligt. Slutligen undersöka de molekylära och cellbiologiska parametrar av intresse genom att jämföra de föräldrarnas cellinjer med TetR-uttryckande kloner. Välj "bästa" klon med den högsta TetR uttryck som inte visar några förändringar i de molekylära och cellbiologiska parametrar av intresse.
3. Pilot Test av PTER och PT-Rex DEST30 vektorer Expressning shRNA eller cDNA, Respektive
- Generera PTER plasmiden med shRNA skär som beskrivs 12. Konstruera pT-Rex DEST30 vektorn (12.301-016, Invitrogen) innehållande cDNA av intresse med användning av Gateway teknik (Invitrogen). Vid cDNA-uttryck, kommer tillsats av en etikett till cDNA underlätta senare påvisande av exogent uttryckta proteinet.
- Tillfälligt transfektera föräldrarnas linje målcellen med PTER eller PT-Rex DEST30 plasmider (som uttrycker antingen shRNAs eller cDNA av intresse) genom att använda transfektionsreagens val. För testning av shRNA expressionsplasmider, säkerställa höga transfektionseffektiviteter kan uppnås.
- Skörd transfekterade celler och förfarande för immunblotting med användning av lämpliga antikroppar, förväntar sig att detektera en utarmning eller överexpression av din gen av intresse.
4. Generering av stabila cellinjer med tetracyklin-inducerbar (Tet-on) Uttryck av shRNAs eller cDNA Använda PTER eller pT-Rex DEST30 Vektorer
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett exempel på den första karakterisering av RPE-1-cellinjer som stabilt uttrycker TetR visas i figur 4. Notera att alla RPE-1 kloner uttrycker olika nivåer av TetR (jämför spår 2 och 5), medan den parentala cellinjen (som fungerar som negativ kontroll) inte uttrycker exogena TetR-proteinet (figur 4, spår 1). Denna variation i TetR uttryck bland RPE-1 Tet-on cellkloner förväntas, eftersom uttrycket av TetR uttryckande plasmider är starkt beroende plasmiden integrationsstället.
Karakteriseringen av stabila RPE-1 Tet-on cellkloner som uttrycker shRNAs riktade mot MST3 kinas visar att flera kloner måste testas för att fastställa cellinjer med den mest effektiva utarmningen av genen av intresse (Figur 5). I det illustrerade fallet (figur 5) cellkloner # 1, # 2 och # 3 valdes för ytterligare analys. Variationen iN utarmning effektivitet förväntas, eftersom uttrycket av shRNA expression är starkt beroende av plasmiden integrationsstället.
Figur 1. Skillnaderna mellan Tet-off och Tet-On system expressionssystem visas. Tetracyklin (Tet) repressorprotein (TetR) har modifierats för att antingen (1) blockera initiering av transkription genom bindning till Tet-operatören (TO) i promotorn regionen vid tillsats av tetracyklin (benämnd Tet-off system) eller (2) binder till den i frånvaro av tetracyklin (benämnd Tet-på systemet).
Figur 2. Beskrivning av de två på varandra följande manipulation nödvändiga åtgärder för att skapa mänsklig Tet-on cellinjer med inducerbart uttryck av shRNA eller cDNA av intresse. (t.ex. serumsvält svar, cell priser spridning, eller uttryck för markörproteiner) är den "bästa" TetR-positiv klon ut och lagras. Steg 2: Framställning av Tet-on cellinjer med inducerbar shRNA / cDNA uttryck. Den "bästa" TetR-positiva celler transfekteras med PTER 12 för shRNA uttryck eller med PT-Rex DEST30 (12.301-016, Invitrogen) för cDNA uttryck och Blast / Zeocin eller Blast/G418 resistenta kloner väljs, respektive. Flera enskilda cellkloner plockas, expanderas och screenas genom immunblotting för tetracyklin-inducerbar ÖVERVÄLDIGANDE eller uttryck av genen av intresse. Slutligen, kloner av intresseexpanderas, testas på nytt och lagras.
Figur 3. Generering av pcDNA6_TetR_IRES_blast vektorn. Det nyligen genererade pMigR1_TetR plasmiden digererades med Xbal och Ncol, och det frigjorda 1.25kb fragmentet innehållande TetR och IRES (inre ribosominträdesställe) var sekvenser klonades in i den visade Xbal och Ncol-ställena i pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen). Den resulterande pcDNA_TetR_IRES_blast vektorn uttrycker TetR och Blasticidin resistensgenen (BlastR) med användning av samma CMV-promotorn, vilket säkerställer att alla blasticidin resistenta celler också uttrycker TetR.
Figur 4. Analys av RPE-1-cellkloner stabilt transfekterade med pcDNA / TetR_IRES_blast.Föräldra RPE-1-celler jämfördes med RPE-1-celler som stabilt uttrycker TetR genom immunoblotting med användning av anti-TetR (övre panelen) och anti-alfa-tubulin-antikroppar (nedre panelen).
Figur 5. . Analys av RPE-1 TetR-positiva kloner stabilt transfekterade med pTER_shMST3 att identifiera celler med tetracyklin-inducerbar expression av shRNAs riktade MST3, kloner odlades i frånvaro (-) eller närvaro (+) av tetracyklin (Tet) under 72 timmar, före behandling för immunblotting med användning av anti-MST3 (övre panelen) och anti-alfa-tubulin-antikroppar (nedre panelen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi tror att Tet-on system i hög grad underlätta analysen av genfunktion, särskilt i cellsystem som är svåra att manipulera och / eller när den manipulerade genen är väsentlig för cellöverlevnad. Dessutom erbjuder möjligheten att kontrollera genuttryck genom högspecifika Tet-on system möjlighet att studera genfunktioner på olika stadier (t.ex. under cellcykelns framskridande eller väldefinierade differentieringsprocesser). Den metod som presenteras här gör det möjligt för forskare att generera den önskade stabila Tet-på cellinjer inom en rimlig tidsram (normalt 3-6 månader, till stor del beroende på omfattningen av molekylära och cellbiologiska profilering som är nödvändig för karakterisering av TetR-positiva cellinjer). En framgångsrik generering och tillämpning av Tet-på cellinjer, emellertid, är kritiskt beroende på flera faktorer.
Först, valet av celler med tillräckligt hög expression av TetRkrävs för att säkerställa strikt repression av transkription i frånvaro av tetracyklin. Lika viktigt bör första karakterisering av mål-celler som uttrycker TetR täcka alla möjliga molekylära och cellbiologiska parametrar som kommer att studeras på lång sikt. Enligt vår erfarenhet är en väl karakteriserad TetR-positiv cellinje en mycket bra utgångspunkt för många forskningsprojekt.
Det andra, är det nödvändigt att hålla den tetracyklin koncentrationen så låg som möjligt för att förhindra eventuella pleiotropa effekter när testning och analys Tet-on kloner för shRNA / cDNA-uttryck. Om möjligt bör den tetracyklin koncentrationen inte vara högre än 2 g / ml (företrädesvis lägre än 2 pg / ml). Eftersom tetracyklin har en halveringstid på cirka 24 timmar i vävnads cellkulturmedium, experiment som pågå i flera dagar bör överväga ytterligare rundor av tetracyklin tillägg. Doxycyklin, en syntetisk tetracyklin alternativ, Kan också övervägas när cytotoxiska nivåer av tetracyklin är av intresse.
Tredje bör tester tillämpas olika för cDNA och shRNA uttryck. Medan Tet-på celler som uttrycker cDNA kommer lätt ge mätbara mängder av proteiner inom 24 timmar, kan utarmning av endogena faktorer genom shRNA-medierad ÖVERVÄLDIGANDE ta mycket längre tid. Generellt rekommenderar vi att testa kloner som uttrycker shRNAs endast 96 timmar efter tetracyklin tillägg, vilket kommer att leda till minskade nivåer av din gen av intresse även om halveringstiden för ditt mål är 24 timmar. Exemplet som visas i figur 5 representerar ett "perfekt" screening resultat för shRNA-medierad utarmning och modifieringar av testprotokollet kan erfordras för att definiera den optimala knock villkor. Sist men inte minst, vill vi betona att väletablerade screening verktyg (QRT-PCR-prober, antikroppar) i hög grad kommer att underlätta identifieringen av önskade cellkloner. </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar alla medlemmar i vårt laboratorium för hjälp diskussioner. Vi tackar Joanna Lisztwan och Christina Gewinner för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöddes av BBSRC bidraget BB/I021248/1 och Wellcome Trust bidraget 090090/Z/09/ZAH är en Wellcome Trust Research Career Development fellow vid UCL Cancer Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Tested Tet-free |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratories | P31-011 | 100 mg/ml in media |
| anti-TET02 | MoBiTec GmbH | TET02 | Use at 1/1000 to 1/2000 for WB |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg/ml in ethanol |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg/ml in water |
| Cloning cylinders | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | re-useable |
References
- Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant. Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).
- Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268, 1766-1769 (1995).
- Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553 (2002).
- McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. A. Gene silencing using micro-RNA designed hairpins. RNA. 8, 842-850 (2002).
- Miyagishi, M., Taira, K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).
- Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., Conklin, D. S. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev. 16, 948-958 (2002).
- Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).
- Sui, G., et al. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).
- Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 6047-6052 (2002).
- van de Wetering, M., et al. Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector. EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).
- Hergovich, A., et al. The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation. Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).
- Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication. Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).
- Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases. Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).
- Vichalkovski, A., et al. NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis. Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).
- Pear, W. S., et al. Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow. Blood. 92, 3780-3792 (1998).
