Summary
Un modo rapido e semplice per generare linee cellulari umane di inducibile e reversibile sovraespressione cDNA o shRNA-mediata knock-down del gene di interesse. Questo metodo consente ai ricercatori di linee cellulari altamente affidabile e riproducibile manipolare che sono difficili da modificare con metodi di trasfezione transiente o convenzionali atterramento / knockout strategie.
Abstract
Un approccio importante nel campo della biologia cellulare di mammifero è la manipolazione dell'espressione dei geni di interesse in linee cellulari selezionate, con lo scopo di rivelare una o più funzione del gene (s) con sovraespressione transiente / stabile o knockdown del gene di interesse. Purtroppo, per le indagini cellulari diversi biologici questo approccio non è adatto quando le manipolazioni del risultato dell'espressione genica in cellule di crescita / proliferazione difetti o differenziazione cellulare indesiderata. Pertanto, i ricercatori hanno adattato la proteina repressore tetraciclina (tetR), tratto dal E. coli resistenza alla tetraciclina operone 1, per generare sistemi di regolazione molto efficienti e stretto per esprimere cDNA in cellule di mammifero 2,3. In breve, tetR è stato modificato a uno (1) blocco di inizio trascrizione legandosi al Tet-operatore (TO) nel promotore per aggiunta di tetraciclina (Tet-off definito sistema) o (2) si legano al TO in tegli assenza di tetraciclina (Tet-definito sul sistema) (Figura 1). Data l'inconveniente che il Tet-off sistema richiede la presenza continua di tetraciclina (che ha una emivita di circa 24 ore in terreno di coltura cellulare tissutale) il Tet-il sistema è stato più ampiamente ottimizzata, con conseguente sviluppo di molto stretto ed efficienti sistemi vettore di espressione di cDNA come usato qui.
Poco dopo la creazione di RNA interference (RNAi) per atterramento gene in cellule di mammifero 4, vettori che esprimono breve hairpin RNA (shRNA) sono stati descritti che funzione molto simile a siRNA 5-11. Tuttavia, questi approcci shRNA-mediati atterramento presenta la stessa limitazione come strategie knockout convenzionali, in quanto l'esaurimento stabile non è fattibile se gli obiettivi di geni sono essenziali per la sopravvivenza cellulare. Per superare questa limitazione, van de Wetering et al 12. Modificato l'espressione shRNA vettore pSUPER 5
Qui, si descrive un metodo per generare efficientemente umana stabile Tet-on linee cellulari che guidano affidabile iperespressione inducibile o deplezione del gene di interesse. Utilizzando questo metodo, siamo riusciti generato Tet-on linee cellulari che hanno notevolmente facilitato l'analisi del MST / hMOB / NDR cascata in centrosoma 13,14 e apoptosi segnalazione 15,16. In questo rapporto, descriviamo i nostri vettori di scelta, oltre a descrivere i due passaggi consecutivi di manipolazione che sono necessari per generare efficientemente umana Tet-on linee cellulari (Figura 2). Inoltre, oltre a delineare un protocollo per la generazione di umana Tet-on linee cellulari, discuteremo aspetti critici riguardanti le procedure tecniche e la caratterizzazione di cellule Tet-on.
Protocol
1. Clonazione di pcDNA6_TetR_IRES_blast
- Come illustrato in figura 3, eseguire un digest parziale del pcDNA6/TR plasmide (V1025-20, Invitrogen) con gli enzimi di restrizione Xba I e Nco I per rimuovere il gene tetR e il promotore della resistenza blasticidina (BlastR) gene. Isolare il vettore frammento di 4,6 kb.
- Per rimuovere la sequenza di poliadenilazione del gene tetR, introdurre mediante PCR un sito Xho I subito dopo il codone di stop del cDNA tetR conservando il sito Xba I alla estremità 5 'del cDNA. Subclonare il frammento risultante in pMigR1 17 usando enzimi di restrizione Xba I e Xho I per generare il plasmide pMigR1_TetR.
- Digerire il vettore pMigR1_TetR con gli enzimi di restrizione Xba I e Nco I per liberare il frammento TetR_IRES. Isolare l'inserto 1,25 kb frammento.
- Legare il 4,6 kb pcDNA6/TR e le 1,25 kb frammenti TetR_IRES. Transform il prodotto legatura in competente E.coli e identificare il costrutto pcDNA6_TetR_IRES_blast desiderato utilizzando le normali tecniche di biologia molecolare.
2. Generazione di linee cellulari che esprimono stabilmente tetR
- Il giorno 1, Seed 1x10 6 celle per 10 cm di piastra di coltura con il supporto di standard di crescita (ad es DMEM supplementato con 10% FCS). Seed due piastre, una per trasfezione con pcDNA6_TetR_IRES_blast, e l'altro come controllo negativo per la selezione blasticidina. Assicurarsi di utilizzare il passaggio più basso possibile e il mezzo di crescita consigliato.
- Il giorno 2, transfect una piastra con 2 mg di pcDNA6_TetR_IRES_blast utilizzando Fugene 6 (E2691, Promega) seguendo le istruzioni del produttore. Non transfettare la seconda piastra.
- Il giorno 3, aggiungere mezzo standard di crescita contenente 5 mg / ml blasticidina ad entrambe le lastre. Si prega di notare che la concentrazione scelta ottimale può variare per una linea cellulare, e di conseguenza potrebbe need da determinare in anticipo.
- Il giorno 4, dividere le celle a 1/5, 1/25, 1/50 e 1/100 con 10 cm di piatti e terreno di coltura standard contenente 5 mg / ml blasticidina. Assicurarsi di etichettare correttamente piastre contenenti cellule non trasfettate o trasfettate. Preparare due piastre per fase di diluizione.
- Controllare le cellule ogni giorno, in modo che tutte le celle sulle piastre non trasfettate sono morti entro la prima settimana. Modificare i media di selezione ogni 2-3 giorni.
- Dopo 1-2 settimane, blasticidina resistenti colonie dovrebbe iniziare a comparire. Selezionare piastre contenenti 5-50 colonie per assicurare che singole colonie possono essere raccolti.
- Quando le colonie hanno raggiunto un diametro di circa 5 mm (o maggiore), isolare almeno 12 cloni indipendenti utilizzando cilindri di clonazione per raccogliere singole colonie. Trasferire ciascun clone in un pozzo separato di una piastra a 24 pozzetti di coltura. Quando confluenti, dividere le cellule di ogni pozzetto in un singolo pozzetto di una piastra da 6 pozzetti di coltura.
- Continuare a cl culturaquelli in mezzi di selezione. Quando confluenti, le cellule di ogni pozzetto divise in due singoli pozzetti di una piastra da 6 pozzetti di coltura.
- Per ogni clone da testare, congelare un pozzetto di cellule confluenti e cellule raccolto nel pozzetto altro per le prove successive mediante immunoblotting.
- Rileva tetR mediante Western blotting utilizzando l'anticorpo monoclonale murino anti-TET02 anticorpo (Mobitec GmbH). Di includere un lisato della linea cellulare parentale come controllo negativo.
- Selezionare 3 cloni con l'espressione più alta tetR ed espandere ogni cultura clonale. Congelare le scorte di ciascun clone promettente appena possibile. Infine, esaminare i parametri molecolari e cellulari biologici di interesse confrontando le linee cellulari parentali con i tetR-cloni che esprimono. Selezionare il 'migliore' clone con l'espressione più alta tetR che non visualizza alcuna modifica nei parametri molecolari e biologiche delle cellule di interesse.
3. Test pilota di pter e pT-Rex DEST30 vettori EsprimiING shRNA o cDNA, rispettivamente,
- Generare pter plasmide con inserti shRNA come descritto 12. Costruire pT-Rex DEST30 vettore (12.301-016, Invitrogen) contenente il cDNA di interesse utilizzando la tecnologia Gateway (Invitrogen). In caso di espressione di cDNA, l'aggiunta di un tag al cDNA sarà poi facilitare l'individuazione di esogenamente proteina espressa.
- Transitoriamente transfettare la linea cellulare parentale bersaglio con pter o pT-Rex DEST30 plasmidi (che ha espresso shRNAs o cDNA di interesse) con il reagente di trasfezione di scelta. Per il test di shRNA plasmidi di espressione, garantire elevate efficienze di trasfezione possono essere raggiunti.
- Harvest cellule trasfettate e procedimenti per immunoblotting usando gli anticorpi appropriati, in attesa di rilevare un esaurimento o sovraespressione del gene di interesse.
4. Generazione di linee cellulari stabili con tetraciclina-inducibile (Tet-on) Espressione di shRNAs o cDNA utilizzando pter o pT-Rex DEST30 vettori
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Representative Results
Un esempio per la caratterizzazione di RPE-1 linee cellulari che esprimono stabilmente tetR è mostrato in Figura 4. Si noti che tutti i cloni RPE-1 esprimono diversi livelli di tetR (confronta corsie 2 e 5), mentre la linea cellulare parentale (che serve come controllo negativo) non esprime la proteina esogena tetR (Figura 4, corsia 1). Questa variazione nell'espressione tetR tra RPE-1 Tet-on cloni cellulari è previsto, poiché l'espressione del tetR esprimere plasmidi è altamente dipendente dal sito di integrazione plasmide.
La caratterizzazione di stabile RPE-1 Tet-on cloni cellulari esprimenti shRNAs diretti contro la chinasi MST3 mostra che diversi cloni devono essere testati per definire le linee cellulari con la deplezione più efficiente del gene di interesse (Figura 5). Nel caso illustrato (Figura 5) cloni # 1, # 2 e # 3 sono state scelte per ulteriori analisi. La variazione iefficienza deplezione n è previsto, poiché l'espressione di espressione shRNA dipende fortemente dal sito di integrazione plasmide.
Figura 1. Le differenze tra Tet-off e Tet-sui sistemi di espressione sono mostrati. L'(Tet) Tetraciclina proteina repressore (tetR) è stato modificato a uno (1) blocco di inizio trascrizione legandosi al Tet-operatore (TO) nel promotore regione dopo aggiunta di tetraciclina (Tet-off definito sistema) o (2) si legano al TO in assenza di tetraciclina (Tet-definito sul sistema).
Figura 2. Descrizione dei due passaggi consecutivi di manipolazione necessarie per generare umano Tet-on linee cellulari con espressione inducibile di shRNA o cDNA di interesse. esempio, la risposta inedia del siero, i tassi di proliferazione cellulare, o l'espressione di proteine marker), la 'migliore' tetR-clone positivo è espanso e memorizzato. Fase 2: Generazione di Tet-on linee cellulari con shRNA inducibile / espressione di cDNA. I "migliori" tetR-positive cellule sono trasfettate con pter 12 per l'espressione shRNA o con pT-Rex DEST30 (12301-016, Invitrogen) per l'espressione cDNA, e Blast / Zeocin o Blast/G418 cloni resistenti sono selezionati, rispettivamente. Diversi cloni cellulari individuali vengono raccolte, espanse e schermato da immunoblotting per tetraciclina inducibile knockdown o espressione del gene di interesse. Infine, cloni di interessesono espanse, nuovamente analizzati e memorizzati.
Figura 3. Generazione del vettore pcDNA6_TetR_IRES_blast. La pMigR1_TetR appena generato plasmide è stato digerito con Xba I e Nco I, e il frammento rilasciato 1.25kb contenente il tetR e IRES (sito interno voce ribosoma) sequenze è stato clonato nel visualizzata Xba I e I siti di NCO pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen). Il vettore risultante pcDNA_TetR_IRES_blast esprime la tetR e il gene di resistenza blasticidina (BlastR) utilizzando il promotore CMV stessa, garantendo così che tutte le cellule resistenti anche blasticidina express tetR.
Figura 4. Analisi di RPE-1 cloni cellulari stabilmente trasfettate con pcDNA / TetR_IRES_blast.Parentale RPE-1 cellule sono stati confrontati RPE-1 cellule stabilmente esprimenti tetR da immunoblotting usando anti-tetR (pannello superiore) e anti-alfa-tubulina anticorpi (pannello inferiore).
Figura 5. . Analisi di RPE-1-positive tetR cloni stabilmente trasfettate con pTER_shMST3 Per identificare cellule con tetraciclina inducibile espressione di shRNAs rivolte MST3, cloni sono stati coltivati in assenza (-) o presenza (+) di tetraciclina (Tet) per 72 ore, prima elaborazione per immunoblotting usando anticorpi anti-MST3 (pannello superiore) e anti-alfa-tubulina (pannello inferiore).
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Discussion
Crediamo che Tet-sui sistemi facilitare notevolmente l'analisi della funzione genica, in particolare in sistemi cellulari che sono difficili da manipolare e / o quando il gene manipolato è essenziale per la sopravvivenza cellulare. Inoltre, la capacità di controllare l'espressione genica altamente specifici Tet-sui sistemi offre l'opportunità di studiare funzioni geniche in diverse fasi (per esempio durante la progressione del ciclo cellulare o ben definiti processi di differenziazione). Il metodo qui presentato permetterà ai ricercatori di generare la stabilità desiderata Tet-on linee cellulari in un arco di tempo ragionevole (normalmente 3-6 mesi, ampiamente a seconda del grado di profiling molecolare e cellulare biologico che è necessario per la caratterizzazione di tetr-positive linee cellulari). La generazione e l'applicazione di successo Tet-on linee cellulari, tuttavia, è criticamente dipendente da diversi fattori.
Primo, la selezione di cellule con espressione sufficientemente alta della tetRè necessaria per garantire la repressione della trascrizione stringenti in assenza di tetraciclina. Ugualmente importante, la caratterizzazione delle cellule bersaglio esprimenti il tetR dovrebbe coprire tutti i possibili parametri molecolari e cellule biologiche che saranno studiate a lungo termine. Nella nostra esperienza, un ben caratterizzato tetR-positivo linea cellulare è un ottimo punto di partenza per numerosi progetti di ricerca.
In secondo luogo, è necessario mantenere la concentrazione della tetraciclina più bassa possibile per evitare eventuali effetti pleiotropici quando testare ed analizzare Tet-on per cloni shRNA / espressione cDNA. Se possibile, la concentrazione della tetraciclina non deve essere superiore a 2 mg / ml (preferibilmente inferiore a 2 ug / ml). Inoltre, poiché tetraciclina ha una emivita di circa 24 ore in terreno di coltura cellulare dei tessuti, esperimenti che più giorni dovrebbe considerare cicli aggiuntivi di addizione tetraciclina. Doxiciclina, tetraciclina un'alternativa sintetica, Può essere considerato anche quando i livelli citotossici di tetraciclina sono di preoccupazione.
In terzo luogo, i test devono essere applicate in modo diverso per l'espressione di cDNA e shRNA. Mentre Tet-su cellule esprimenti cDNA sarà facilmente produrre quantità rilevabili di proteine entro 24 ore, l'esaurimento dei fattori endogeni di shRNA-mediata knockdown può richiedere molto più tempo. In generale, si consiglia di testare i cloni che esprimono shRNA solo 96 ore dopo l'aggiunta di tetraciclina, che porterà alla diminuzione dei livelli di vostro gene di interesse, anche se il tempo di dimezzamento del bersaglio è di 24 ore. L'esempio mostrato in Figura 5 rappresenta un risultato 'ideale' screening per shRNA-mediata deplezione, e modifiche al protocollo di prova potrebbe essere necessario per definire il knock condizioni ottimali. Ultimo, ma non meno importante, vorremmo sottolineare il fatto che gli strumenti di screening consolidati (RT-PCR sonde, anticorpi) permette di facilitare l'identificazione dei cloni di cellule desiderate. </ P>
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo tutti i membri del nostro laboratorio per le discussioni utili. Ringraziamo Joanna Lisztwan e Christina Gewinner per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione BBSRC BB/I021248/1 e il Wellcome Trust concessione 090090/Z/09/ZAH è un Wellcome Trust Research fellow presso il Career Development UCL Cancer Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Tested Tet-free |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratories | P31-011 | 100 mg/ml in media |
| anti-TET02 | MoBiTec GmbH | TET02 | Use at 1/1000 to 1/2000 for WB |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg/ml in ethanol |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg/ml in water |
| Cloning cylinders | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | re-useable |
References
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