Summary
誘導性と目的の遺伝子のcDNAを過剰発現可逆またはshRNA媒介ノックダウンしたヒト細胞株を生成するために迅速かつ簡単な方法です。この方法は、確実に研究を可能にし、高度な再現性一過性トランスフェクションの方法または従来のノックダウン/ノックアウト戦略によって変更することは困難である細胞株を操作します。
Abstract
哺乳類の細胞生物学の分野での主要なアプローチは、遺伝子の安定/一過性過剰発現またはノックダウンを使用して、1つ以上の遺伝子の機能のいくつか（複数可）を明らかにする目的で、選択された細胞株において、目的の遺伝子の発現の操作です興味のある。残念なことに、様々な細胞生物学的研究のためにこのアプローチは、細胞の成長/増殖欠陥や不要な細胞分化における遺伝子発現結果の不適切な操作です。したがって、研究者は、 大腸菌から取らテトラサイクリンリプレッサータンパク質（TetRを）、適応している大腸菌のテトラサイクリン耐性オペロン1、2,3、哺乳動物細胞でのcDNAを表現するために非常に効率的かつタイトな規制制度を生成する。要するに、TetRをINにするテトラサイクリン（Tet-オフシステムと呼ばれる）を添加した際のプロモーター領域におけるテト - オペレーター（TO）に結合すること、または（2）に結合することにより転写のブロック（1）開始のいずれかに変更されましたトンテトラサイクリンの彼が不在（システムテトオンと呼ばれる）（ 図1）。テトオフシステムは非常にタイトなの開発で、その結果、テトラサイクリンの連続的な存在（組織細胞培養培地中で約24時間の半減期を持っている）テトオンシステムがより広範囲に最適化されているが必要であることを不便与えとcDNA発現のための効率的なベクター系は、ここで使用される。
まもなく、哺乳動物細胞における4遺伝子ノックダウンのためのRNA干渉（RNAi）の設立後、ショートヘアピンRNA（shRNA）を発現ベクターは、siRNAは5月11日と非常によく似て、その関数を記述した。遺伝子標的は、細胞の生存に必須であるときに安定枯渇が現実的ではありませんので、しかし、これらのshRNAによるノックダウンのアプローチは、従来のノックアウト戦略と同じ制限があります。この制限を克服するために、バン·デ·ウェテリンクらは12のshRNA発現ベクターpSUPER 5変更
ここでは、効率的に安定した人間テトオンを生成するために、確実に目的の遺伝子の過剰発現誘導または枯渇のどちらかを駆動する細胞株の方法を説明します。この方法を使用すると、我々は正常に生成したテトオン著しく中心体13,14と15,16シグナリングアポトーシスのMST / hMOB / NDRカスケードの解析を容易にした細胞株。本稿では、選択した私たちのベクトルを記述し、効率的に生成するために必要な2つの連続した操作手順を記述することに加えて、人間テトオン細胞株（ 図2）。さらに、ヒトテトオン細胞株を樹立するためのプロトコルを概説に加えて、我々は技術的な手順およびTet-上の細胞の特性に関する重要な側面について説明します。
Protocol
1。 pcDNA6_TetR_IRES_blastのクローニング
- 図3に示すように、私はTetRを遺伝子とブラストサイジン耐性（BlastR）遺伝子のプロモーターを除去するために、制限酵素 XbaIとNCOとプラスミドpcDNA6/TRの部分ダイジェスト（V1025-20、Invitrogen）を実行します。 4.6kbのベクター断片を分離します。
- TetRを遺伝子からポリアデニル化配列を削除するには、すぐに、cDNAの5 '末端に節約XbaI部位間のcDNA TetRのストップコドンの後、PCRによりXhoI部位をご紹介します。サブクローンプラスミドpMigR1_TetRを生成するために、制限酵素 XbaI 及び XhoIを用いてpMigR1 17に得られた断片。
- 私はTetR_IRESの断片を放出するために、制限酵素 XbaIとNCOとpMigR1_TetRベクトルを消化。 1.25キロバイトの挿入断片を分離します。
- 4.6キロバイトpcDNA6/TRと1.25キロバイトTetR_IRESフラグメントをライゲーションする。 TR有能なE.coliにライゲーション産物をansformと標準的な分子生物学的技術を用いて、所望のpcDNA6_TetR_IRES_blastコンストラクトを識別します。
2。安定的TetRを発現する細胞株の生成
- 1日目、シード標準の成長培地（ 例えば、DMEM、10％FCSを補充した）を使用して、10cmの組織培養プレートあたり1×10 6細胞。シード2プレート、pcDNA6_TetR_IRES_blastを用いたトランスフェクションのためのもの、とブラストの選択のための陰性対照として他のを。可能な限り低い通路と推奨成長培地を使用することを確認します。
- 2日目に、製造元の指示に従ってFUGENE 6（E2691、Promega）を用いてpcDNA6_TetR_IRES_blast2μgのトランスフェクションと1プレート。第二のプレートをトランスフェクトしないでください。
- 3日目に、両方のプレートに5μg/ mlのブラストサイジンを含む標準的な増殖培地を追加します。最適な選択濃度が与えられた細胞株ごとに異なり、そしてnかもしれない場合がありますのでご了承くださいあらかじめ決定されてEED。
- 4日目に、10cmのプレートと5 mg / mlのブラストサイジンを含む標準的な増殖培地を用いて1/50、1/100、1/25、1/5でセルを分割する。正しく非トランスフェクトまたはトランスフェクトされた細胞を含むプレートにラベルを付けていることを確認してください。希釈段階ごとに2つのプレートを準備します。
- トランスフェクトされていないプレート上のすべてのセルが1週間以内に死亡していることを確認し、毎日の細胞をチェックしてください。 2〜3日ごとに選択培地を変更します。
- 1-2週間後、ブラストサイジン耐性コロニーが現れ始めるべきである。シングルコロニーをピックアップすることができることを保証するために5から50コロニーを含むプレートを選択します。
- コロニーは約5mm（またはより大きい）の直径に達したときは、シングルコロニーをピックアップするクローニングシリンダを使用して少なくとも12の独立したクローンを分離する。 24ウェル組織培養プレートの別々のウェルに各クローンを転送します。ときに合流、6ウェル組織培養プレートのウェル1つ1つに、各ウェルから細胞を分割します。
- 文化CLに続ける選択培地のもの。 6ウェル組織培養プレートの2つの単一のウェルに各ウェルからすると合流、分割細胞。
- 各クローンがテストされるためには、免疫ブロット法によるその後のテストのために他の井の中のコンフルエントの細胞と細胞の収穫だけでなく1を凍結。
- 西洋は、マウスモノクローナル抗TET02抗体（MoBiTec GmbH）を用いてブロッティングによりTetRを検出します。陰性対照として親細胞株のライセートを含めることを忘れないでください。
- 最高TetRを式を使って3つのクローンを選択し、各クローン培養を展開します。できるだけ早く各クローンの有望株を凍結。最後に、TetRを発現クローンと親細胞株を比較することにより、目的の分子および細胞生物学的パラメータを調べます。興味のある分子細胞生物学的パラメーターに変更を加える場合には表示されません最高TetRを発現と '最高'クローンを選択します。
3。 pTERとPT-レックスのパイロットテストDEST30ベクトルエクスプレスそれぞれるshRNAまたはcDNAは、
- 12に記載されているようにするshRNAインサートとプラスミドpTERを生成します。 PT-レックスDEST30ベクトル（12301から016、インビトロジェン）ゲートウェイ技術（Invitrogen）を用いて、目的のcDNAを含むを構築します。 cDNA発現の場合には、cDNAへのタグの追加は後で外因的に発現されたタンパク質の検出を容易にするでしょう。
- 一過性の選択のトランスフェクション試薬を用いpTERまたはPT-レックスDEST30プラスミド（shRNAのや目的のcDNAのいずれかを発現する）を持つ親の標的細胞系をトランスフェクト。 shRNA発現プラスミドのテストのために、高いトランスフェクション効率を達成することができることを確認してください。
- 収穫は、目的の遺伝子の枯渇または過剰発現を検出するために期待して、適切な抗体を用いたイムノブロッティング用の細胞およびプロセスをトランスフェクションした。
4。テトラサイクリン誘導性（テトオン）pTERまたはPT-レックスDEST30ベクトルを用いたshRNAまたはcDNAの発現で安定細胞株の作製
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Representative Results
安定TetRを発現し、RPE-1細胞株の初期特性の例を図4に示します。親細胞ラインは（ネガティブコントロールとしても機能します）外因TetRタンパク質を発現しない間、すべてのRPE-1クローンは（ 図4、レーン1）、（レーン2および5を比較）TetRのレベルを変えることで表現することに注意してください。発現プラスミドTetRの発現プラスミドの組込み部位に大きく依存しているので、TetRを発現におけるこの変化は、RPE-1の間でテトがオン細胞クローン、期待されています。
安定したRPE-1の特性は、テトオンMST3キナーゼに対して向けshRNAを発現する細胞クローンをいくつかのクローンが目的の遺伝子（ 図5）の最も効率的な枯渇を持つ細胞株を定義するためにテストする必要があることを示しています。図示された場合（ 図5）細胞クローン＃1、＃2、＃3、さらなる分析のために選択された。バリエーションIshRNA発現の発現プラスミドの組込み部位に大きく依存しているので、n個の枯渇の効率化が期待されている。
図1。テトオフおよびTet-上の発現系との違いが示されている。テトラサイクリン（Tet）リプレッサータンパク質（TetRを）はプロモーターでのTet-オペレータ（TO）に結合して転写のいずれか（1）ブロックの開始に変更されましたテトラサイクリン（Tetのオフと呼ばれるシステム）の添加時に領域またはテトラサイクリン（Tetのシステムオンと呼ばれる）が存在しないのTO〜（2）のバインド。
図2。生成するために必要な二つの連続操作手順の説明人間テトオンshRNAまたは目的のcDNAの誘導発現を持つ細胞株。 例えば、血清飢餓応答、細胞増殖率、またはマーカータンパク質の発現）のためのテストの後、 '最高' TetRを陽性クローンを拡大し、格納されています。ステップ2：誘導性shRNAを/ cDNA発現と細胞株テトオンの世代。 '最高' TetRを陽性細胞はshRNA発現用pTER 12でまたはcDNA発現用PT-レックスDEST30（12301から016、Invitrogen）を用いてトランスフェクトされ、ブラスト/ゼオシンまたはBlast/G418耐性クローンはそれぞれ、選択されています。いくつかの個々の細胞クローンを、拾っ拡大し、目的の遺伝子のテトラサイクリン誘導性ノックダウンまたは発現について免疫ブロット法によりスクリーニングされる。最後に、目的のクローン再試験と格納、展開されます。
図3。 pcDNA6_TetR_IRES_blastベクトルの生成。プラスミド新しく生成されたpMigR1_TetRはXbaIとのNco Iで消化し 、TetRをおよびIRES（内部リボソーム侵入部位）配列を含むリリース1.25キロバイトフラグメントが表示XbaIとの NCO I部位にクローニングしたpcDNA6/TR（V1025-20、Invitrogen社）。結果pcDNA_TetR_IRES_blastベクトルは、それによってすべてのブラストサイジン耐性細胞もTetRを発現していることを保証する、TetRを、同じCMVプロモーターを用いたブラストサイジン耐性遺伝子（BlastR）を発現する。
図4。安定フェクト/ TetR_IRES_blastでトランスフェクトしたRPE-1細胞クローンの解析。親のRPE-1細胞を安定的に抗TetRを（上のパネル）および抗α-チューブリン抗体（下パネル）を使用して免疫ブロッティングによってTetRを発現したRPE-1細胞と比較した。
図5。 。、72時間テトラサイクリン（Tet）のまたは存在下（+）（ - ）、RPE-1 TetRを陽性クローンの解析が安定pTER_shMST3でトランスフェ MST3を標的shRNAのテトラサイクリン誘導発現を有する細胞を同定するために、クローンは非存在下で培養した前抗MST3（トップパネル）、抗α-チューブリン抗体（ボトムパネル）を使用して免疫ブロッティングのための処理。
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Discussion
我々はテトオンシステムが大幅に特に操作遺伝子は細胞の生存に必須であるときに操作および/またはすることが困難である細胞系において、遺伝子機能の解析を容易にすると信じています。さらに、高度に特異的なテトオンシステムによって遺伝子発現を制御する能力は、様々な段階（細胞周期の進行や、明確に定義された分化プロセス中など）で遺伝子の機能を研究する機会を提供しています。ここで紹介する方法は、研究者が生成できるようになり所望の安定テトオン主としてTetRを陽性のキャラクタリゼーションのため必要である分子細胞生物学的プロファイリングの程度に応じて合理的な時間枠（通常3ヶ月から6ヶ月内の細胞株細胞株）。が正常に生成され、アプリケーションテトオンセルラインは、しかし、いくつかの要因に大きく依存する。
まず、TetRの十分に高発現細胞の選択テトラサイクリンの非存在下での転写の厳しい弾圧を保証するために必要です。同様に重要なのは、TetRを発現する標的細胞の初期特性は、長期的に検討される可能性のあるすべての分子細胞生物学的パラメータをカバーする必要があります。我々の経験では、十分に特徴付けTetRを陽性細胞株は、多数の研究プロジェクトのための非常に良い出発点です。
第二に、それはテストおよびTet-上のshRNA / cDNA発現用クローンを解析することが可能多面的な効果を防止するために可能な限り低くテトラサイクリン濃度を維持することが必要である。可能であれば、テトラサイクリン濃度は2μg/ mlの（2μg/ mlのより優先的に低い）よりも大きくすべきではない。最後の数日間は、テトラサイクリンに加え、追加のラウンドを考慮する必要がありますまた、テトラサイクリンは組織細胞培養培地中で約24時間の半減期を持っているので、実験。ドキシサイクリン、テトラサイクリン合成の代替、テトラサイクリンの細胞毒性のレベルが懸念される場合にも考慮することができる。
第三に、テストはcDNAおよびshRNAの発現のために異なって適用されるべきである。テトオンcDNAを発現している細胞の場合、24時間以内にタンパク質の検出可能な量を生成しますが、shRNAを媒介ノックダウンによる内在性因子の枯渇は時間がかかる場合があります。一般的に、我々は、shRNAのあなたの目標の半減期は24時間であっても、目的の遺伝子レベルの低下につながるテトラサイクリン添加後96時間のみを発現しているクローンをテストすることをお勧めします。 図5に示す例では、shRNAを媒介枯渇のための"理想的な"審査結果を表しており、試験プロトコルへの変更が条件ダウン最適ノックを定義するために必要になることがあります。最後に、しかし、我々は十分に確立されたスクリーニングツール（QRT-PCRプローブ、抗体）が大幅に所望の細胞クローンの同定を容易にするであろうという事実を強調したいと思います</ P>
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
我々は有用な議論のために、我々の研究室のすべてのメンバーに感謝。我々は、原稿の読み取りのために重要なジョアンナLisztwanとクリスティーナGewinnerに感謝します。この作品は、BBSRC助成BB/I021248/1とウェルカムトラスト助成090090/Z/09/ZAHによってサポートされていましたUCLのがん研究所でウェルカムトラスト·リサーチ·キャリア開発仲間です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Tested Tet-free |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratories | P31-011 | 100 mg/ml in media |
| anti-TET02 | MoBiTec GmbH | TET02 | Use at 1/1000 to 1/2000 for WB |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg/ml in ethanol |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg/ml in water |
| Cloning cylinders | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | re-useable |
References
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