הקמת הריכוז החיידקי המינימלי של סוכן מיקרוביאלית לתאים פלנקטוניים (MBC-P) ותאי ביופילם (MBC-B)

Summary

פרוטוקול זה מאפשר השוואה ישירה בין התנגדות פלנקטונית וביופילם לזן חיידקי שיכול ליצור ביופילם במבחנה באמצעות צלחת מיקרוטיטר 96 באר. חיידקי פלנקטוניים או ביופילם נחשפים לדילול סדרתי של הסוכן האנטי-מיקרוביאלי המועדף. הכדאיות נפגעת על ידי צמיחה על צלחות אגר.

Abstract

פרוטוקול זה מאפשר השוואה ישירה בין התנגדות פלנקטונית וביופילם לזן חיידקי שיכול ליצור ביופילם במבחנה. חיידקים מחוסנים לתוך בארות של צלחת מיקרוטיטר 96-היטב. במקרה של בדיקה פלנקטונית, דילול סדרתי של הסוכן מיקרוביאלית של בחירה מתווספים השעיות חיידקים. ב biofilm assay, פעם מחוסן, החיידקים נשארים ליצור biofilm על פני תקופה מוגדרת של זמן. תאים לא מחוברים מוסרים מן הבארות, התקשורת מתחדשת ודילול סדרתי של הסוכן מיקרוביאלית של בחירה מתווספים. לאחר חשיפה לסוכן מיקרוביאלית, התאים הפלנקטוניים הם assayed לצמיחה. עבור מבחני הביופילם, התקשורת מתרעננת עם מדיה טרייה חסרה את הסוכן מיקרוביאלית ותאי הביופילם נשארים להתאושש. הכדאיות של תאי הביופילם מתבצעת לאחר תקופת ההחלמה. MBC-P עבור הסוכן מיקרוביאלית מוגדר כריכוז הנמוך ביותר של סמים שהורג את התאים בתרבות הפלנקטונית.  לעומת זאת, MBC-B עבור זן נקבע על ידי חשיפת biofilms מעוצבים מראש לריכוזים הולכים וגדלים של חומר מיקרוביאלית במשך 24 שעות. MBC-B מוגדר כריכוז הנמוך ביותר של חומר מיקרוביאלית שהורג את התאים בביופילם.

Introduction

מבחני עמידות לאנטיביוטיקה פותחו בתחילה כדי לנסות עמידות של תרבויות פלנקטוניות (שחייה חופשית) של חיידקים. מכיוון שזיהומים חיידקיים רבים כרוכים בביופילמים (תאים המחוברים לפני השטח), התעניינו בפיתוח שיטה לעמידות לאנטיביוטיקה ספציפית לביופילם. עם זאת, רוב מבחני עמידות לאנטיביוטיקה אינם מתאימים למדידת ההתנגדות של biofilms. לדוגמה, קביעת הריכוז המעכב המינימלי (MIC) הוא תקן הזהב לקביעת עמידות לאנטיביוטיקה של תרביות חיידקים פלנקטוניים ¹. זה assay כרוך ערבוב תרבות פלנקטונית מדוללת עם סדרת דילול של אנטיביוטיקה.  ריכוז האנטיביוטיקה המעכבת את הצמיחה הנראית לעין של התאים הפלנקטוניים הוא ה- MIC. מאז בדיקה זו מסתמכת על עיכוב של צמיחה, מעצם הגדרתו, זה לא יכול לעבוד עם תרביות biofilm, אשר דורש בחינת הרגישות האנטיביוטית של תאים בביופילם גדל מראש. במקום למדוד עיכוב גדילה, מבחני MBC-B המתוארים כאן קובעים את ריכוז האנטיביוטיקה שהורג תאים שכבר קיימים בביופילם. לכן, זו assay שואפת לחקות טיפולים אנטיביוטיים של זיהומים biofilm הוקמה, ולספק תצוגה רלוונטית יותר של עמידות לאנטיביוטיקה חיידקי vivo.

מאז biofilms הם בדרך כלל עמידים יותר לאנטיביוטיקה מאשר תרבויות פלנקטוניות ^2-4 , היה צורך לתכנן שיטה המקשרת ישירות את עמידות לאנטיביוטיקה של biofilm לזה של תרבות פלנקטונית. לכן מטרה נוספת של שיטה זו היא להיות מסוגל להשוות ישירות את רמת עמידות לאנטיביוטיקה בין תאים פלנקטוניים וביופילם. מבחני MBC-P ו- MBC-B המתוארים כאן מאפשרים זאת מכיוון שהתאים מתרבתים בתנאים דומים. השתמשנו בשיטה זו כדי לחקור מספר גנים חשובים לעמידות לאנטיביוטיקה ספציפית לביופילם ^5-8 .

Protocol

1. MBC-B

1. גידול ביופילם (מותאם מאוטול^9).
   1. לגדל תרבות של זן סוג פראי של עניין זן מוטציה במשך 16 שעות במדיום עשיר ב 37 °C (69 °F).
   2. לדלל את תרבויות לילה רווי 1:100 לתוך מדיום טרי עבור בדיקות עמידות לאנטיביוטיקה. מדיום סטנדרטי עבור P. aeruginosa הוא M63 בינוני מינימלי בתוספת מגנזיום גופרתי ארגינין (ראה טבלה 1). מדיום זה מגרה היווצרות של ביופילם חזק יותר.
   3. מוסיפים 100 מיקרוליטר מהדילול לבאר בצלחת מיקרוטיטר של 96 באר (ראו טבלה 1). מאז מבחנים אלה מבוצעים בדרך כלל משולש עבור כל זן, צריך להיות 24 בארות של כל זן.
   4. דגירה צלחת microtiter במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
2. חשיפת הביופילם בעל המבנה הקדם-מעוצב לשיפוע ריכוזי של אנטיביוטיקה
   1. הכן סדרה 10x דילול של אנטיביוטיקה עבור 7 בארות. דוגמה: עבור אנטיביוטיקה tobramycin, הריכוזים הסופיים בבארות הם 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125, ו 0.006 מ"ג / מיליליטר ^5-8 . מתוך מלאי של 25 מ"ג / מ"ל, להכין 10x דילול של 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, ו 0.06 מ"ג / מיליליטר. תשאירו על הקרח.
   2. הסר את supernatant בילה (המכיל תאים פלנקטוניים) באמצעות פיפטה רב ערוצית (ראה טבלה 1).
   3. הוסף 90 μl M63 (Mg / Arg) לכל בארות.
   4. הוסף 10 μl של כל ריכוז אנטיביוטי 10x על מנת להשיג את הריכוזים הסופי הרצוי. הוסף 10 מים μl (ללא שליטה באנטיביוטיקה) לבאר הסופית עבור כל שכפול ומתח.
   5. דגירה צלחת microtiter במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
3. רענון המדיה ומתן אפשרות לניתוק תאים חיים.
   1. הסר את supernatant בילה (המכיל תאים פלנקטוניים) באמצעות פיפטה רב ערוצית.
   2. הוסף 115 μl M63 (Mg / Arg) לכל בארות.
   3. דגירה צלחת microtiter במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
4. מבחנים לתאים חיים.
   1. תווית שתי צלחות אגר LB לכל צלחת microtiter 96-גם.
   2. לעקר את המכשיר multiprong (ראה טבלה 1)על ידי טבילת שיניים 100% אתנול והעברת שיניים על פני הלהבה הפתוחה של מבער Bunsen. חוזר. תן לשיניים להתקרר מעט. באמצעות המכשיר multiprong, להעביר ~ 3 μl (סכום זה נשמר בדרך כלל על קצות השיניים) של תרבות פלנקטונית מכל באר של צלחת microtiter אל פני השטח של צלחת אגר LB.
   3. דגירה צלחות אגר LB במשך 16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
   4. לקבוע ריכוז בקטריצילי מינימלי של האנטיביוטיקה על ידי זיהוי, לפי עין, את הניתוק לצמיחת חיידקים (איור 1).

2. MBC-P

1. הכנת זנים חיידקיים
   1. לגדל תרבות של זן סוג פראי של עניין זן מוטציה במשך 16 שעות במדיום עשיר ב 37 °C (69 °F).
   2. לדלל את תרבויות לילה רווי 1:100 לתוך מדיום טרי עבור בדיקות עמידות לאנטיביוטיקה. מדיום סטנדרטי עבור P. aeruginosa הוא M63 בינוני מינימלי בתוספת מגנזיום גופרתי ארגינין (ראה טבלה 1).
   3. הוסף 90 μl של דילול לבאר בצלחת microtiter 96-היטב (ראה טבלה 1). מאז מבחנים אלה מבוצעים בדרך כלל משולש עבור כל זן, צריך להיות 24 בארות של כל זן.
2. חשיפת תאים פלנקטוניים לשיפוע ריכוז של אנטיביוטיקה
   1. הכן סדרת דילול 10x של אנטיביוטיקה עבור 7 בארות. דוגמה: עבור אנטיביוטיקה tobramycin, הריכוזים הסופיים בבארות הם 0.032, 0.016, 0.008, 0.004, 0.002, 0.001, ו 0.0005 מ"ג / מיליליטר. מתוך מלאי של 25 מ"ג / מ"ל, להכין דילול של 0.32, 0.16, 0.08, 0.04, 0.02, 0.01, ו 0.005 מ"ג / מיליליטר. תשאירו על הקרח.
   2. הוסף 10 μl של כל ריכוז אנטיביוטי 10x על מנת להשיג את הריכוזים הסופי הרצוי. הוסף 10 מים μl (ללא שליטה באנטיביוטיקה) לבאר הסופית עבור כל שכפול ומתח.
   3. דגירה צלחת microtiter במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
3. מבחנים לתאים חיים.
   1. תווית שתי צלחות אגר LB לכל צלחת microtiter 96-גם.
   2. לעקר את המכשיר multiprong (ראה טבלה 1)על ידי טבילת שיניים 100% אתנול והעברת שיניים על פני הלהבה הפתוחה של מבער Bunsen. חוזר. תן לשיניים להתקרר מעט. באמצעות המכשיר multiprong, להעביר ~ 3 μl (סכום זה נשמר בדרך כלל על קצות השיניים) של תרבות פלנקטונית מכל באר של צלחת microtiter אל פני השטח של צלחת אגר LB.
   3. דגירה צלחות אגר LB במשך 16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
   4. לקבוע ריכוז בקטריצילי מינימלי של האנטיביוטיקה על ידי זיהוי, לפי עין, את החתך לצמיחת חיידקים (איור 2).

Representative Results

מבחני MBC-P ו- MBC-B בוצעו, והשוו את הרגישות של סוג הפרא PA14 עם PA14 ∆ndvB. טוברמיצין שימש כאנטיביוטיקה. מוצגות תוצאות המתאימות לשלב 1.4.4 (איור 1) ולצעד 2.3.4 (איור 2). PA14 ו- ∆ndvB חוסנו לתוך מבחני MBC-P ו- MBC-B המשולש. לאחר השלמת שלבים 1.0-1.4 של פרוטוקול MBC-B ושלבים 2.0-2.3 של פרוטוקול MBC-P, התאים קיימא היו מצופים על צלחת אגר LB. ריכוזים של tobramycin(μg /ml) מסומנים בצד שמאל של התאים. MBC-B עבור PA14 הוא 100 μg /ml ו MBC-B עבור ∆ndvB הוא 12.5 μg /ml. MBC-P הן עבור PA14 והן מוטנטndvB ∆ הוא 8 μg /ml.

איור 1. תוצאות מייצגות מ- MBC-B עם סוג פראי PA14 לעומת PA14 ∆ndvB ו tobramycin. ערכים מתייחסים לריכוז הסופי של טוברמיצין (מיקרוגרם /מיליליטר).

איור 2. תוצאות מייצגות מ- MBC-P עם סוג פראי PA14 לעומת PA14 ∆ndvB ו tobramycin. ערכים מתייחסים לריכוז הסופי של טוברמיצין(μg/ml).

Discussion

עמידות לאנטיביוטיקה בתאים פלנקטוניים מוגדרת כעלייה בריכוז המעכב המינימלי (MIC) של אנטיביוטיקה עקב שינוי קבוע בתאים (למשל מוטציה). המנגנונים של התנגדות או סובלנות ספציפיים לביופילם שזוהו עד כה הם תוצאה של ביטוי של גנים מסוג בר בתוך biofilms. לפיכך, ההגדרה הקלאסית של התנגדות אינה חלה על ביופילמים. עם זאת, קבוצה נוספת של הגדרות הוצגה: מנגנוני התנגדות למנוע את האנטיביוטיקה גישה ליעדה, בעוד מנגנוני סובלנות לסגור את המטרות של^{אנטיביוטיקה 10}. מנגנוני עמידות לאנטיביוטיקה ספציפיים לביופילם מקיפים את שתי ההגדרות הללו. המונח "התנגדות" שימש לאורך פרוטוקול זה, אך יש לבצע ניסויים נוספים על מנת לקבוע אם גן תורם להתנגדות או לסובלנות.

מבחני MBC-P ו- MBC-B עשויים להיות מותאמים לכל זן חיידקי היוצר ביופילם ולכל סוכן מיקרוביאלית בקטריצילית. שני הקריטריונים החשובים להתאמת מבחנה זו לחיידקים אחרים וסוכנים מיקרוביאליים אחרים קובעים תנאים שמובילים להיווצרות ביופילם וקובעים את טווח הריכוזים המתאים לסוכן האנטי-מיקרוביאלי באמצעות זן העניין מסוג בר. תנאי היווצרות ביופילם נאותים ניתן לקבוע באמצעות פרוטוקול היווצרות biofilm JoVE שפורסם על ידי ג'ורג ' O'Toole⁹. על מנת לקבוע טווח ריכוז מתאים עבור MBC-B assay, כלל אצבע טוב הוא להשתמש 25 x MIC (ריכוז מעכבות מינימלי¹¹) כריכוז האמצעי של הטווח ולהתאים בהתאם. עבור ה- MBC-P assay, השתמש ב- 1/10 מהערכים שזוהו עבור ה- MBC-B. המטרה היא להגדיר מגוון של ריכוזים שיאפשרו הבדל ברור בין MBC-B של זן מסוג פראי זן מוטציה רגיש. לכן, הקצה העליון של הטווח צריך להיות קרוב MBC-B של זן מסוג פראי. אנו חוזרים על ניסוי זה לפחות שלוש פעמים, נותן מינימום של 9 נקודות נתונים לכל זן.

הצעד הקריטי ביותר של מבחנים אלה הוא למנוע זיהום. כדי למנוע זיהום בין זנים, עמודה ריקה צריכה להישאר בין זנים. צעד קריטי נוסף הוא לאפשר מספיק זמן עבור שיניים מתכת על המכשיר multiprong להתקרר מספיק. זה יכול להיבדק על ידי בוער שיניים, תזמון תקופת הקירור במהירות לגעת שיניים עם הידיים.

אם ניתוק התאים מהביופילם לאחר חשיפה לאנטיביוטיקה הוא בעיה, ניתן לשנות את שיטת MBC-B כך שתכלול שלב sonication. דלג על שלב 1.3.3 (דגירה של 24 שעות לאחר הוספת מדיה טרייה). במקום זאת, לכסות את בארות צלחת microtiter 96-well לאחר הוספת 115 μl של מדיה טרייה (שלב 1.3.2) עם חותם צלחת דבק סטרילי צלחת sonicate כדי לעקור תאים biofilm מקירות בארות. השתמש sonicator אמבט מים. תנאים ספציפיים (זמן, אינטנסיביות) להסרה יעילה של תאי ביופילם מהפלסטיק חייבים להיקבע מראש.

וריאציה של MBC-B שימשה כדי להקרין ספרייה של 4,000 מוטציות הכנסה טרנספוזון של P. aeruginosa עבור מוטנטים עמידות לאנטיביוטיקה ספציפי biofilm. נבחר ריכוז של טוברמיצין (50 מיקרוגרם/מ"ל) שלא יהרוג תאי ביופילם מסוג בר אלא יאפשר זיהוי של מוטנטים שהיו רגישים פי 3 מהביופילם מסוג הבר. במקום לחסן עמודות של בארות עם זן אחד ספציפי של חיידקים, כל באר חוסן עם מוטציה שונה. המוטנטים הושארו כדי ליצור biofilm, חשוף 50 μg / ml tobramycin, עזב להתאושש חשיפה tobramycin ולאחר מכן התחייב על הכדאיות. מוטנטים שלא שרדו 50 μחשיפה לטונרמיצין נבדקו מחדש באותם תנאי סינון. הפרוטוקולים MBC-P ו- MBC-B נוצלו כדי לאשר את הפנוטיפים הרגישים לטונומיצין של המוטנטים.

ישנן שיטות אחרות כדי לתעתע עמידות לאנטיביוטיקה בביופילמים, כלומר ביופילמים המושבה biofilms גדל bioreactors^12,13. שיטות אלה הן הרבה יותר מייגע ומוגבל במספר הזנים שניתן בקלות assayed. לכן, יתרון שיש ל- MBC-B על פני שיטות אחרות אלה הוא שהוא בעל תפוקה גבוהה, המאפשר לחוקר לנהל מסכים או לבצע מספר זנים, כמו גם מספר ריכוזי אנטיביוטיקה שונים בבת אחת.

שם הריאגנט	חברה	מספר קטלוג	הערות (אופציונלי)
1x M63			היכונו כמלאי 5x M63 על ידי המסת 15 גר' KH2PO4, 35 גר' K2HPO4 ו-10 גרם (NH4)2SO4 ב-1 ליטר מים. מלאי זה אינו צריך להיות autoclaved והוא יכול להיות מאוחסן בטמפרטורת החדר.  לדלל 5x מלאי 1:5, autoclave, מגניב, ולאחר מכן להוסיף את הרכיבים הרצויים.
KH2PO4	פישר	P285-500
K2HPO4	פישר	P288-500
(NH4) 2 מספר 2 אז4	סיגמא	A5132
מגנזיום גופרתי	פישר	M63-500	הוסף לריכוז הסופי של 1 מ"מ.  היכונו כמלאי של 1 מ' במים ובאוטובלאב.
טוברמיצין	סיגמא		מכינים 50 מ"ג/מ"ל. Aliquot ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
ארגינין (1992)	סיגמא	A5131	מוסיפים לריכוז הסופי של 0.4%.  היכונו כמלאי של 20% במים וחיטוי פילטרים.  מקור פחמן/אנרגיה חלופי זה יכול להחליף גלוקוז וחומצות קאסאמינו
צלחות מיקרוטיטר 96 באר	קורנינג	3595	אידוי סטרילי, שטוח למטה, נמוך
טרנפרפט (פיפטה רב ערוצית)	ברנדטק	2703610	8 ערוצים, 20-200 μl
התקן רב-תכליתי	דן-קאר	MC48	48 שיניים מתאימות ל-1/2 של צלחת מיקרוטיטר של 96 באר

שולחן 1. 

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x M63			Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature.  Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.
KH2PO4	Fisher	P285-500
K2HPO4	Fisher	P288-500
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
Magnesium sulfate	Fisher	M63-500	Add to 1 mM final concentration.  Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
Tobramycin	Sigma		Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at -20°C.
Arginine	Sigma	A5131	Add to 0.4% final concentration.  Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize.  This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids
96-well microtiter plates	Corning	3595	Sterile, flat-bottom, low evaporation
Tranferpette (multichannel pipette)	BrandTech	2703610	8-channel, 20-200 μl
Multiprong device	Dan-Kar	MC48	48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate