Summary

Planktonik Hücreler (MBC-P) ve Biyofilm Hücreleri (MBC-B) için Bir Antimikrobiyal Ajanın Minimal Bakterisidal Konsantrasyonunun Oluşturulması

Published: January 02, 2014
doi:

Summary

Bu protokol, 96 kuyulu bir mikrotiter plaka kullanarak biyofilm in vitro oluşturabilen bakteriyel bir suş için planktonik ve biyofilm direnci arasında doğrudan bir karşılaştırma sağlar. Planktonik veya biyofilm bakterileri, tercih edilen antimikrobiyal ajanın seri seyreltmelerine maruz kalır. Canlılık, agar plakalarındaki büyüme ile test edilir.

Abstract

Bu protokol, bir biyofilm in vitrooluşturabilen bakteriyel bir suş için planktonik ve biyofilm direnci arasında doğrudan bir karşılaştırma sağlar. Bakteriler 96 kuyulu bir mikroter plakanın kuyularına aşılanır. Planktonik test durumunda, tercih ettiği antimikrobiyal ajanın seri seyreltmeleri bakteriyel süspansiyonlara eklenir. Biyofilm testinde, aşılandıktan sonra, bakteriler belirli bir süre boyunca bir biyofilm oluşturmak için bırakılır. Eklenmemiş hücreler kuyulardan çıkarılır, ortam yenilenir ve tercih edilen antimikrobiyal ajanın seri seyreltmeleri eklenir. Antimikrobiyal ajana maruz kaldıktan sonra, planktonik hücreler büyüme için test edilir. Biyofilm tahlili için, medya antimikrobiyal ajandan yoksun taze medya ile yenilenir ve biyofilm hücreleri iyileşmeye bırakılır. Biyofilm hücre canlılığı iyileşme döneminden sonra test edilir. Antimikrobiyal ajan için MBC-P, planktonik kültürdeki hücreleri öldüren en düşük ilaç konsantrasyonu olarak tanımlanır.  Buna karşılık, bir suş için MBC-B, önceden biçimlendirilmiş biyofilmlerin 24 saat boyunca artan antimikrobiyal ajan konsantrasyonlarına maruz kalarak belirlenir. MBC-B, biyofilmdeki hücreleri öldüren en düşük antimikrobiyal ajan konsantrasyonu olarak tanımlanır.

Introduction

Antibiyotik direnci tahlilleri başlangıçta planktonik (serbest yüzme) bakteri kültürlerinin direncini test etmek için geliştirilmiştir. Birçok bakteriyel enfeksiyon biyofilmleri (yüzeye bağlı hücreler) içerdiğinden, biyofilme özgü antibiyotik direncini test etmek için bir yöntem geliştirmekle ilgileniyorduk. Bununla birlikte, antibiyotik direnci testlerinin çoğu biyofilmlerin direncini ölçmek için uygun değildir. Örneğin, minimum inhibitör konsantrasyonun (MIC) belirlenmesi, planktonik bakteri kültürlerinin antibiyotik direncini belirlemek için altın standarttır 1. Bu test, seyreltilmiş bir planktonik kültürün bir seyreltme antibiyotik serisi ile karıştırılmasını gerektirir.  Planktonik hücrelerin görünür büyümesini engelleyen antibiyotik konsantrasyonu MIC’dir. Bu test büyümenin inhibisyonunu dayandığından, tanım olarak, önceden büyümüş bir biyofilmdeki hücrelerin antibiyotik duyarlılığını incelemeyi gerektiren biyofilm kültürleriyle çalışamaz. Burada açıklanan MBC-B tahlili, büyüme inhibisyonunu ölçmek yerine, bir biyofilmde zaten var olan hücreleri öldüren antibiyotik konsantrasyonunu belirler. Bu nedenle, bu test yerleşik biyofilm enfeksiyonlarının antibiyotik tedavilerini taklit etmeyi ve bakteriyelantibiyotik direncinin vivo daha alakalı bir görünümünü sağlamayı amaçlamaktadır.

Biyofilmler genellikle planktonik kültürlerden daha antibiyotik dirençli olduğundan 2-4 Bir biyofilmin antibiyotik direncini planktonik bir kültürünkiyle doğrudan ilişkilendiren bir yöntem tasarlamak gerekiyordu. Bu nedenle, bu yöntemin bir diğer amacı, planktonik ve biyofilm hücreleri arasındaki antibiyotik direnci seviyesini doğrudan karşılaştırabilmektir. Burada açıklanan MBC-P ve MBC-B tahlilleri bunu mümkün kilmektedir çünkü hücreler benzer koşullar altında kültürlenir. Biyofilme özgü antibiyotik direnci için önemli olan birkaç geni incelemek için bu yöntemi kullandık 5-8 .

Protocol

1. MBC-B Bir biyofilm yetiştirmek (O’Toole 9’danuyarlanmıştır). 37 °C’de zengin bir ortamda 16 saat boyunca vahşi tip ilgi ve mutant suşu kültürünü büyütün. Doymuş gece kültürlerini 1:100 antibiyotik direnci tahlilleri için taze ortama seyreltin. P. aeruginosa için standart bir ortam, magnezyum sülfat ve arginin ile desteklenmiş M63 minimal ortadır (bkz. Tablo 1). Bu ortam daha sağlam bir biyofilm…

Representative Results

PA14 vahşi tipinin hassasiyetini PA14 ∆ndvBile karşılaştıran MBC-P ve MBC-B tahlilleri gerçekleştirildi. Antibiyotik olarak tobramycin kullanıldı. Adım 1.4.4 (Şekil 1) ve adım 2.3.4 (Şekil 2) ‘ye karşılık gelen sonuçlar sunulmuştur. PA14 ve ∆ndvB üç taraflı olarak MBC-P ve MBC-B testlerine aşılandı. MBC-B protokolünün 1.0-1.4 ve MBC-P protokolünün 2.0-2.3. Hücrelerin solunda tobramycin(μ…

Discussion

Planktonik hücrelerde antibiyotik direnci, hücrelerde kalıcı bir değişiklik (örneğin bir mutasyon) nedeniyle bir antibiyotiğin minimum inhibitör konsantrasyonunda (MIC) bir artış olaraktanımlanır. Bugüne kadar tanımlanan biyofilme özgü direnç veya tolerans mekanizmaları, biyofilmler içindeki vahşi tip genlerin ekspresyonunun sonucudur. Bu nedenle, klasik direnç tanımı biyofilmler için geçerli değildir. Bununla birlikte, başka bir tanım kümesi sunulmuştur: direnç mekanizmaları an…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazar li Zhang, Xian-Zhi Li, Aaron Hinz ve Clayton Hall’a bu makalenin editoryal yardımı için teşekkür eder. Bu test ilk olarak Dartmouth’taki Geisel Tıp Fakültesi George O’Toole’un laboratuvarında geliştirilmiştir. Dr. Mah’un laboratuvarındaki araştırmalar, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendisliği Araştırma Konseyi ve Kistik Fibrozis Kanada’nın hibeleriyle desteklenmektedir.

Materials

1x M63

Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature.  Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.

KH2PO4

Fisher

P285-500

K2HPO4

Fisher

P288-500

(NH4)2SO4

Sigma

A5132

Magnesium sulfate

Fisher

M63-500

Add to 1 mM final concentration.  Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.

Tobramycin

Sigma

Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at 20°C.

Arginine

Sigma

A5131

Add to 0.4% final concentration.  Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize.  This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids

96-well microtiter plates

Corning

3595

Sterile, flat-bottom, low evaporation

Tranferpette (multichannel pipette)

BrandTech

2703610

8-channel, 20-200 μl

Multiprong device

Dan-Kar

MC48

48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate

References

  1. Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
  2. Mah, T. F., O’Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
  3. Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
  4. Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O’Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
  5. Zhang, L., Mah, T. F. The Involvement of a Novel Efflux System in Biofilm-Specific Resistance to Antibiotics. J. Bacteriol. 190 (13), 4447-4452 (2008).
  6. Zhang, L., Hinz, A. J., Nadeau, J. P., Mah, T. F. Pseudomonas aeruginosa tssC1 Links Type VI Secretion and Biofilm-specific Antibiotic Resistance. J. Bacteriol. 193 (19), 5510-5513 (2011).
  7. Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The Biofilm-Specific Antibiotic Resistance Gene, ndvB, is Important for Expression of Ethanol Oxidation Genes in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
  8. O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).
  9. Lewis, K. Multidrug tolerance of biofilms and persister cells. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 107-131 (2008).
  10. Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O’Toole, G. A. Growing and Analyzing Static Biofilms. Curr. Protoc. Microbiol. 1, 1B.1.1-1B.1.17 (2005).
  11. Ramey, B. E., Parsek, M. R. Chapter 1. Growing and analyzing biofilms in fermenters. Curr. Protoc. Microbiol. 1, 1B.3.1-1B.3.14 (2005).

Play Video

Cite This Article
Mah, T. Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells (MBC-P) and Biofilm Cells (MBC-B). J. Vis. Exp. (83), e50854, doi:10.3791/50854 (2014).

View Video