Summary
이 프로토콜은 96웰 마이크로티터 플레이트를 사용하여 체외에서 생물막을 형성할 수 있는 세균균에 대한 플랑크토닉 과 생물막 내성을 직접 비교할 수 있게 한다. 플랑크토닉 또는 생물막 박테리아는 선택의 항균제의 직렬 희석에 노출된다. 생존력은 한천 판의 성장에 의해 분석됩니다.
Abstract
이 프로토콜은 시험관 내에서생물막을 형성할 수 있는 세균균에 대한 플랑크토닉과 생물막 저항을 직접 비교할 수 있게 한다. 박테리아는 96 웰 마이크로티터 플레이트의 우물에 접종됩니다. 판자 분석의 경우, 선택의 항균제의 직렬 희석이 세균 현탁액에 첨가된다. 생물막 분석에서, 한 번 접종, 박테리아는 시간의 설정 된 기간 동안 생물 막을 형성하기 위해 남아있다. 부착되지 않은 세포는 우물에서 제거되고, 미디어는 보충되고 선택의 항균제의 직렬 희석이 첨가된다. 항균제에 노출된 후, 판자 세포는 성장을 위해 분석된다. 생물막 분석의 경우, 매체는 항균제가 결여된 신선한 매체로 리프레시되고 생물막 세포는 회복상태로 남겨집니다. 생물막 세포 생존가능성은 회복 기간 이후에 분석된다. 항균제에 대한 MBC-P는 판자 배양에서 세포를 죽이는 약물의 가장 낮은 농도로 정의된다. 반면, MBC-B는 24시간 동안 항균제의 농도를 높이기 위해 미리 형성된 생물막을 노출시킴으로써 결정된다. MBC-B는 생물막내세포를 죽이는 항균제의 가장 낮은 농도로 정의된다.
Introduction
항생 저항 분석은 처음에 박테리아의 판자 (자유 수영) 문화의 저항을 분석하기 위하여 개발되었습니다. 많은 세균성 감염은 생물막 (표면 부착 된 세포)를 포함하기 때문에, 우리는 생물막 특정 항생제 내성을 분석하는 방법을 개발하는 데 관심이 있었다. 그러나, 대부분의 항생 저항 분석은 생물막의 저항을 측정하기 위해 제대로 적합합니다. 예를 들어, 최소한의 억제 농도(MIC)를 결정하는 것은 판자 세균 배양1의항생제 내성을 결정하기 위한 금본위제이다. 이 분석은 희석 된 판자 문화를 항생제의 희석 시리즈와 혼합하는 것을 수반합니다. 판자 세포의 눈에 보이는 성장을 억제하는 항생제의 농도는 MIC입니다. 이 분석법은 성장 억제에 의존하기 때문에, 정의에 의해, 그것은 미리 자란 생물막에서 세포의 항생제 감도를 검사해야 하는 생물막 배양과 함께 작동할 수 없습니다. 여기에 설명된 MBC-B 분석법은 성장 억제를 측정하는 대신 생물막에 이미 존재하는 세포를 죽이는 항생제의 농도를 결정합니다. 따라서, 이러한 분석법은 확립된 생물막 감염의 항생제 치료를 모방하고 생체 내에서세균성 항생제 내성의 보다 관련성이 있는 관점을 제공하는 것을 목표로 한다.
생물막은 일반적으로 판자 배양보다 항생제 내성이 2-4이기 때문에, 생물막의 항생제 내성을 직접 적으로 플랑크토닉 배양의 항생제 내성을 포함하는 방법을 고안할 필요가 있었다. 따라서 이 방법의 또 다른 목표는 판자 세포와 생물막 세포 사이의 항생 저항 수준을 직접 비교할 수 있다는 것입니다. 여기에 설명된 MBC-P와 MBC-B 의 소는 세포가 비슷한 조건에서 배양되기 때문에 이를 가능하게 합니다. 우리는 생물막 특이적 항생제 저항 5-8에 중요한 몇몇 유전자를 연구하기 위하여 이 방법을 이용했습니다.
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Protocol
1. MBC-B
-
생물막 을 성장 (O'Toole9에서적응).
- 37°C에서 풍부한 배지에서 16시간 동안 관심 및 돌연변이 균주의 야생형 균주의 배양을 성장시다.
- 포화 하룻밤 문화를 1:100을 항생제 내성 분석용 신선한 배지로 희석시. P. aeruginosa에 대 한 표준 매체는 M63 최소 매체 마그네슘 황 산 과 아르기닌으로 보충 (표 1참조). 이 매체는 보다 견고한 바이오필름의 형성을 자극합니다.
- 96웰 마이크로티터 접시에 잘 당 희석 100 μl을 추가합니다(표 1참조). 이러한 애술은 일반적으로 각 변형에 대해 삼중에서 수행되기 때문에 각 변형의 24 개의 우물이 있어야합니다.
- 37°C에서 24시간 동안 마이크로티터 플레이트를 배양한다.
-
항생제의 농도 그라데이션에 미리 형성된 생물막을 노출
- 7 개의 우물에 대한 항생제의 10 배 희석 시리즈를 준비합니다. 예: 항생제 토브라마이신의 경우, 우물의 최종 농도는 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125 및 0.006 mg/ml 5-8이다. 25 mg/ml의 육수에서 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 및 0.06 mg/ml의 10배 희석을 준비하십시오. 얼음 위에 두십시오.
- 멀티채널 파이펫을 사용하여 소비된 상체(판자 세포 포함)를 제거합니다(표 1참조).
- 모든 우물에 90 μl M63(Mg/Arg)를 추가합니다.
- 원하는 최종 농도를 달성하기 위해 각 10x 항생제 농도의 10 μl을 추가합니다. 각 복제 및 변형에 대해 최종 우물에 10 μl 물 (항생제 통제 없음)을 추가하십시오.
- 37°C에서 24시간 동안 마이크로티터 플레이트를 배양한다.
-
미디어를 새로 고침하고 살아있는 세포의 분리를 허용합니다.
- 멀티채널 파이펫을 사용하여 소비된 상체(판자 세포 포함)를 제거합니다.
- 모든 우물에 115 μl M63(Mg/Arg)를 추가합니다.
- 37°C에서 24시간 동안 마이크로티터 플레이트를 배양한다.
-
라이브 셀에 대한 분석.
- 96웰 마이크로티터 플레이트당 LB 한천 플레이트 2개를 라벨로 지정합니다.
- 100% 에탄올에 갈구를 찍어 분젠 버너의 불꽃에 걸쳐 갈구를 전달하여 다중 prong 장치 (표 1참조)를 살균합니다. 반복하다. 갈매기를 약간 식힙니다. 다중prong 장치를 사용하여, 마이크로티터 플레이트의 각 웰에서 LB 천판의 표면으로 판자 배양의 ~3 μl (일반적으로 갈래의 끝에 유지되는 양)을 전송합니다.
- 37°C에서 16시간 동안 LB 한천 플레이트를 배양합니다.
- 항생제의 최소한의 살균 농도를 식별하여, 눈으로, 세균 성장을 위한 컷오프(도1)를결정한다.
2. MBC-P
-
세균균 제고
- 37°C에서 풍부한 배지에서 16시간 동안 관심 및 돌연변이 균주의 야생형 균주의 배양을 성장시다.
- 포화 하룻밤 문화를 1:100을 항생제 내성 분석용 신선한 배지로 희석시. P. aeruginosa에 대 한 표준 매체는 M63 최소 매체 마그네슘 황 산 과 아르기닌으로 보충 (표 1참조).
- 96웰 마이크로티터 접시에 잘 당 희석 90 μl을 추가합니다(표 1참조). 이러한 애술은 일반적으로 각 변형에 대해 삼중에서 수행되기 때문에 각 변형의 24 개의 우물이 있어야합니다.
-
항생제의 농도 그라데이션에 판자 세포를 노출
- 7 개의 우물에 대한 항생제의 10 배 희석 시리즈를 준비합니다. 예: 항생제 토브라마이신의 경우, 우물의 최종 농도는 0.032, 0.016, 0.008, 0.004, 0.002, 0.001 및 0.0005 mg/ml이다. 25 mg/ml의 주식에서 0.32, 0.16, 0.08, 0.04, 0.02, 0.01 및 0.005 mg/ml의 희석을 준비하십시오. 얼음 위에 두십시오.
- 원하는 최종 농도를 달성하기 위해 각 10x 항생제 농도의 10 μl을 추가합니다. 각 복제 및 변형에 대해 최종 우물에 10 μl 물 (항생제 통제 없음)을 추가하십시오.
- 37°C에서 24시간 동안 마이크로티터 플레이트를 배양한다.
-
라이브 셀에 대한 분석.
- 96웰 마이크로티터 플레이트당 LB 한천 플레이트 2개를 라벨로 지정합니다.
- 100% 에탄올에 갈구를 찍어 분젠 버너의 불꽃에 걸쳐 갈구를 전달하여 다중 prong 장치 (표 1참조)를 살균합니다. 반복하다. 갈매기를 약간 식힙니다. 다중prong 장치를 사용하여, 마이크로티터 플레이트의 각 웰에서 LB 천판의 표면으로 판자 배양의 ~3 μl (일반적으로 갈래의 끝에 유지되는 양)을 전송합니다.
- 37°C에서 16시간 동안 LB 한천 플레이트를 배양합니다.
- 항생제의 최소한의 살균 농도를 식별하여, 눈으로, 세균 성장을 위한차단(도 2)을결정한다.
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Representative Results
MBC-P와 MBC-B 는 PA14 와일드 타입의 감성을 PA14 ∆ndvB와비교하며 진행되었다. 토브라마이신은 항생제로 사용되었다. 단계 1.4.4(도 1)및 단계 2.3.4(도 2)에해당하는 결과가 제시된다. MBC-P와 MBC-B 의 한 미수구는 '∆'에 접종을 했다. MBC-B 프로토콜의 1.0-1.4 단계와 MBC-P 프로토콜의 2.0-2.3 단계를 완료한 후 실행 가능한 세포는 LB 한천판에 도금되었습니다. 토브라마이신의농도(μg/ml)는 세포의 왼쪽에 표시된다. PA14의 MBC-B는 100 μ g/ml,∆NDvB의 MBC-B는 12.5 μ g/ml이다. PA14와 ∆NDvB 돌연변이모두 MBC-P는 8 μg/ml이다.
그림 1. PA14 와일드 타입과 PA14 ∆ndvB와 토브라마이신을 가진 MBC-B 분석의 대표 결과. 값은 토브라마이신(μg/ml)의 최종 농도를 참조합니다.
그림 2. PA14 와일드 타입 과 PA14 ∆ndvB및 토브라마이신을 가진 MBC-P 분석의 대표 결과. 값은 토브라마이신 (g /ml μ)의최종 농도를 참조하십시오.
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Discussion
판자 세포내 항생 저항성은 세포의 영구적인변화(예를 들어 돌연변이)로 인한 항생제의 최소 억제 농도(MIC)의 증가로 정의된다. 현재까지 확인된 생물막 특이적 저항 또는 내성의 메커니즘은 생물막 내의 야생 형 유전자의 발현의 결과입니다. 따라서, 저항의 고전적인 정의는 생물막에 적용되지 않습니다. 그러나, 정의의 또 다른 세트가 제시되었습니다: 저항 기계장치는 항생제가 그것의 표적에 접근하는 것을 방지하고, 내성 기계장치는 항생제의 표적을 종료하는 동안10. 생물막 특이적 항생 저항 메커니즘은 이러한 정의를 모두 포괄합니다. 용어 "저항"이 프로토콜 을 통해 사용되었습니다, 그러나 유전자가 저항 또는 내성에 기여하는지 결정하기 위하여 추가 실험이 수행되어야 합니다.
MBC-P와 MBC-B 의 소법은 생물막 형성 세균균균및 모든 살균항균제에 적응할 수 있다. 다른 박테리아 및 기타 항균제에 이 분석체를 적응시키기 위한 두 가지 중요한 기준은 바이오필름 형성으로 이어지는 조건을 결정하고 관심의 야생형 균주를 사용하여 항균제에 대한 적절한 농도 범위를 결정하는 것이다. 적절한 생물막 형성 조건은 조지 오툴9에의해 간행된 JoVE 생물막 형성 프로토콜을 사용하여 결정될 수 있다. MBC-B 분석에 적합한 농도 범위를 결정하기 위해, 엄지 손가락의 좋은 규칙은 범위의 중간 농도로 25 x MIC (최소 억제 농도11)를사용하고 그에 따라 조정하는 것입니다. MBC-P 분석의 경우 MBC-B 분석에서 식별된 값 1/10을 사용한다. 목표는 야생형 균주의 MBC-B와 민감한 돌연변이 균주 사이의 명확한 차이를 허용하는 농도범위를 정의하는 것입니다. 따라서, 범위의 상단은 야생 형 변형의 MBC-B에 가깝어야합니다. 이 실험을 최소 세 번 반복하여 변형당 최소 9개의 데이터 포인트를 제공합니다.
이러한 검사의 가장 중요한 단계는 오염을 방지하는 것입니다. 균주 간의 오염을 방지하기 위해 균주 사이에 빈 열을 두어야 합니다. 또 다른 중요한 단계는 다중 prong 장치의 금속 갈래가 충분히 냉각될 수 있도록 충분한 시간을 허용하는 것입니다. 이것은 갈래를 불태우고, 냉각 기간을 타이밍하고, 빠르게 자신의 손으로 갈구를 만져서 테스트 할 수 있습니다.
항생제에 노출된 후 생물막으로부터 세포를 분리하는 것이 문제가 되는 경우, MBC-B 방법은 초음파 처리 단계를 포함하도록 수정될 수 있다. 스킵 1.3.3 (신선한 미디어를 추가 한 후 24 시간 인큐베이션). 대신, 멸균 접착제 플레이트 씰과 신선한 매체 (단계 1.3.2)의 115 μl을 추가 한 후 96 웰 마이크로 티터 플레이트의 우물을 덮고 우물의 벽에서 생물 막 세포를 배출하는 초음파 플레이트를 초음파 처리하십시오. 수조 초음파 를 사용하십시오. 플라스틱으로부터 생물막 세포의 효율적인 제거를 위한 특정 조건(시간, 강도)은 사전에 결정되어야 한다.
MBC-B의 변형은 생물막 특이적 항생제 내성 돌연변이를 위한 P.aeruginosa의 4,000개의 트랜스포슨 삽입 돌연변이체라이브러리를 스크린하는 데 사용되었습니다. 토브라마이신(50 μg/ml)의 농도는 야생형 생물막 세포를 죽이지 않고 야생형 생물막보다 3배 더 민감한 돌연변이의 식별을 허용하는 것으로 선택되었다. 박테리아의 한 특정 변형과 우물의 열을 접종 하는 대신, 각 잘 다른 돌연변이와 접종 했다. 돌연변이는 50 μ g/ml토브라마이신에 노출된 생물막을 형성하기 위해 방치되었고, 토브라마이신 노출에서 회복한 다음 생존가능성을 분석했습니다. 50 g/ml 토브라마이신 노출을 μ살아남지 못한 돌연변이는 동일한 선별 조건하에서 재검사되었다. MBC-P와 MBC-B 프로토콜은 돌연변이의 토브라마이신에 민감한 표현형을 확인하는 데 활용되었다.
생물막, 즉 생물 반응기12,13에서자란 식민지 생물막 및 생물막에서 항생제 내성을 분석하는 다른 방법이 있다. 이러한 방법은 훨씬 더 힘들고 쉽게 분석 할 수있는 균주의 수에 제한됩니다. 따라서, MBC-B가 이러한 다른 방법에 비해 가지고 있다는 장점은 연구원이 스크린을 수행하거나 여러 균주를 분석할 수 있도록 하는 높은 처리량이며, 한 번에 여러 가지 항생제 농도를 분석할 수 있다는 것이다.
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글(선택 사항) |
| 1x M63 | 15g KH2PO4,35g K2HPO4 및 10g(NH4)2SO4를 1L의 물에 용해시켜 5x M63 재고로 준비한다. 이 재고는 자동 으로 사용할 필요가 없으며 실온에서 보관 할 수 있습니다. 5배 스톡을 1:5로 희석하고, 오토클레이브를 원하게 한 다음 원하는 구성 요소를 추가합니다. | ||
| KH2PO4 | 어부 | P285-500 | |
| K2HPO4 | 어부 | P288-500 | |
| (NH4) 2 그래서4 | 시그마 | A5132 | |
| 황산 마그네슘 | 어부 | M63-500 | 1 mM 최종 농도에 추가합니다. 물과 오토클레이브에 1M 스톡으로 준비하십시오. |
| 토브라마이신 | 시그마 | 50 mg/ml 스톡을 준비합니다. 알리쿼트와 -20°C에 보관하십시오. | |
| 아르기닌 | 시그마 | A5131 | 최종 농도0.4%를 추가합니다. 물에 20 %의 재고로 준비하고 필터 살균. 이 대체 탄소 /에너지 원은 포도당과 카산산을 대체 할 수 있습니다 |
| 96웰 마이크로티터 플레이트 | 코 닝 | 3595 | 멸균, 평평한 바닥, 낮은 증발 |
| 트란퍼펫(멀티채널 파이펫) | 브랜드테크 | 2703610 | 8채널, 20-200 μl |
| 멀티프로옹 장치 | 댄 카 | MC48 | 96웰 마이크로티터 플레이트의 1/2에 맞는 48개의 갈래 |
표 1.
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Disclosures
저자는 그녀가 경쟁 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 이 원고에 대한 편집 적 도움을 리 장, 시안 지 리, 아론 힌츠, 클레이튼 홀에게 감사드립니다. 이 분석은 처음에 조지 O'Toole의 실험실에서 개발되었다, 다트머스에서 의학의 가이젤 학교. Mah 박사의 실험실에 있는 연구는 캐나다와 낭포성 섬유증 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구 위원회의 보조금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x M63 |
Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. |
||
| KH2PO4 |
Fisher | P285-500 |
|
| K2HPO4 |
Fisher | P288-500 |
|
| (NH4)2SO4 |
Sigma | A5132 |
|
| Magnesium sulfate |
Fisher | M63-500 |
Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
| Tobramycin |
Sigma | Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at -20°C. |
|
| Arginine |
Sigma | A5131 |
Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
| 96-well microtiter plates |
Corning | 3595 |
Sterile, flat-bottom, low evaporation |
| Tranferpette (multichannel pipette) |
BrandTech | 2703610 |
8-channel, 20-200 μl |
| Multiprong device |
Dan-Kar | MC48 |
48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate |
References
- Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard-eighth edition. , Ninth Edition, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2009).
- Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
- Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
- Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
- Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
- Zhang, L., Mah, T. F. The Involvement of a Novel Efflux System in Biofilm-Specific Resistance to Antibiotics. J. Bacteriol. 190 (13), 4447-4452 (2008).
- Zhang, L., Hinz, A. J., Nadeau, J. P., Mah, T. F. Pseudomonas aeruginosa tssC1 Links Type VI Secretion and Biofilm-specific Antibiotic Resistance. J. Bacteriol. 193 (19), 5510-5513 (2011).
- Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The Biofilm-Specific Antibiotic Resistance Gene, ndvB, is Important for Expression of Ethanol Oxidation Genes in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
- O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).
- Lewis, K. Multidrug tolerance of biofilms and persister cells. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 107-131 (2008).
- Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement. 31, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2011).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and Analyzing Static Biofilms. Curr. Protoc. Microbiol. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.1.1-1B.1.17 (2005).
- Ramey, B. E., Parsek, M. R. Chapter 1. Growing and analyzing biofilms in fermenters. Curr. Protoc. Microbiol. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.3.1-1B.3.14 (2005).
