Summary
Denne protokollen muliggjør en direkte sammenligning mellom planktonisk og biofilmmotstand for en bakteriestamme som kan danne en biofilm in vitro ved hjelp av en 96-brønns mikrotiterplate. Planktoniske eller biofilmbakterier er utsatt for serielle fortynninger av det antimikrobielle middelet du velger. Levedyktighet er analysert av vekst på agarplater.
Abstract
Denne protokollen gir en direkte sammenligning mellom planktonisk og biofilmmotstand for en bakteriestamme som kan danne en biofilm in vitro. Bakterier inokulerer i brønnene til en 96-brønns mikrotiterplate. Når det gjelder den planktoniske analysen, legges serielle fortynninger av det antimikrobielle middelet til bakterielle suspensjoner. I biofilmanalysen, når de er inokulert, blir bakteriene igjen for å danne en biofilm over en bestemt tidsperiode. Uattrerte celler fjernes fra brønnene, mediet etterfylles og serielle fortynninger av det antimikrobielle middelet som velges, tilsettes. Etter eksponering for det antimikrobielle middelet blir de planktoniske cellene analysert for vekst. For biofilmanalysen oppdateres mediene med friske medier som mangler det antimikrobielle middelet, og biofilmcellene blir igjen for å komme seg. Biofilmcelle levedyktighet er analysert etter gjenopprettingsperioden. MBC-P for det antimikrobielle middelet er definert som den laveste konsentrasjonen av stoff som dreper cellene i den planktoniske kulturen. I motsetning bestemmes MBC-B for en stamme ved å utsette preformerte biofilmer for å øke konsentrasjonen av antimikrobielt middel i 24 timer. MBC-B er definert som den laveste konsentrasjonen av antimikrobielt middel som dreper cellene i biofilmen.
Introduction
Antibiotisk resistensanalyser ble opprinnelig utviklet for å analyseresistens av planktoniske (frisvømming) kulturer av bakterier. Siden mange bakterielle infeksjoner involverer biofilmer (overflatetilknyttet celler), var vi interessert i å utvikle en metode for å analyse biofilmspesifikk antibiotikaresistens. Imidlertid er de fleste antibiotikaresistensanalyser dårlig egnet for å måle motstanden til biofilmer. For eksempel er det å bestemme den minimale hemmende konsentrasjonen (MIC) gullstandarden for å bestemme antibiotikaresistens av planktoniske bakteriekulturer 1. Denne analysen innebærer å blande en fortynnet planktonisk kultur med en fortynningsserie av antibiotika. Konsentrasjonen av antibiotika som hemmer den synlige veksten av de planktoniske cellene er MIC. Siden denne analysen er avhengig av inhibering av vekst, kan den per definisjon ikke fungere med biofilmkulturer, noe som krever å undersøke antibiotikafølsomheten til celler i en forgrodd biofilm. I stedet for å måle veksthemming, bestemmer MBC-B-analysen som er beskrevet her konsentrasjonen av antibiotika som dreper celler som allerede eksisterer i en biofilm. Dermed har denne analysen som mål å etterligne antibiotikabehandlinger av etablerte biofilminfeksjoner, og gi et mer relevant syn på bakteriell antibiotikaresistens in vivo.
Siden biofilmer generelt er mer antibiotikaresistente enn planktoniske kulturer 2-4 , var det nødvendig å utarbeide en metode som direkte relaterer antibiotikaresistensen til en biofilm til en planktonisk kultur. Dermed er et annet mål med denne metoden å kunne sammenligne nivået av antibiotikaresistens direkte mellom planktoniske og biofilmceller. MBC-P- og MBC-B-analysene som er beskrevet her, gjør dette mulig fordi cellene dyrkes under lignende forhold. Vi har brukt denne metoden til å studere flere gener som er viktige for biofilmspesifikk antibiotikaresistens 5-8 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. MBC-B
-
Voksende en biofilm (tilpasset fra O'Toole9).
- Vokse en kultur av vill type stamme av interesse og mutant belastning for 16 timer i et rikt medium ved 37 °C.
- Fortynn de mettede nattkulturene 1:100 i friskt medium for antibiotikaresistensanalyser. Et standardmedium for P. aeruginosa er M63 minimalt medium supplert med magnesiumsulfat og arginin (se tabell 1). Dette mediet stimulerer dannelsen av en mer robust biofilm.
- Tilsett 100 μl av fortynning per brønn i en 96-brønns mikrotiterfat (se tabell 1). Siden disse analysene vanligvis utføres i triplikat for hver stamme, bør det være 24 brønner av hver stamme.
- Inkuber mikrotiterplaten i 24 timer ved 37 °C.
-
Utsette den forhåndsformede biofilmen for en konsentrasjonsgradient av antibiotika
- Forbered en 10x fortynningsserie med antibiotika for 7 brønner. Eksempel: For antibiotika tobramycin er de endelige konsentrasjonene i brønnene 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 og 0,006 mg/ml 5-8 . Fra et lager på 25 mg/ml, lag 10x fortynning på 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 og 0,06 mg/ml. La det stå på is.
- Fjern den brukte supernatanten (som inneholder planktoniske celler) ved hjelp av en flerkanals pipette (se tabell 1).
- Tilsett 90 μl M63 (Mg/Arg) i alle brønnene.
- Tilsett 10 μl av hver 10x antibiotikakonsentrasjon for å oppnå de ønskede endelige konsentrasjonene. Tilsett 10 μl vann (ingen antibiotikakontroll) til den endelige brønnen for hver replikering og belastning.
- Inkuber mikrotiterplaten i 24 timer ved 37 °C.
-
Forfriskende media og tillater løsrivelse av levende celler.
- Fjern den brukte supernatanten (som inneholder planktoniske celler) ved hjelp av en flerkanals pipette.
- Tilsett 115 μl M63 (Mg/Arg) i alle brønnene.
- Inkuber mikrotiterplaten i 24 timer ved 37 °C.
-
Analyse for levende celler.
- Merk to LB agarplater per 96-brønns mikrotiterplate.
- Steriliser multiprong-enheten (se tabell 1) ved å dyppe pinnene i 100 % etanol og føre pinnene over den åpne flammen til en Bunsen-brenner. gjenta. La pinnene avkjøles litt. Bruk multiprong-enheten, overfør ~ 3 μl (mengde som vanligvis beholdes på spissene på pinnene) av planktonisk kultur fra hver brønn på mikrotiterplaten til overflaten av en LB agarplate.
- Inkuber LB agarplatene i 16 timer ved 37 °C.
- Bestem minimal bakteriedrepende konsentrasjon av antibiotika ved å identifisere, for øyet, avskjæringen for bakterievekst (figur 1).
2. MBC-P
-
Forbereder bakteriestammer
- Vokse en kultur av vill type stamme av interesse og mutant belastning for 16 timer i et rikt medium ved 37 °C.
- Fortynn de mettede nattkulturene 1:100 i friskt medium for antibiotikaresistensanalyser. Et standardmedium for P. aeruginosa er M63 minimalt medium supplert med magnesiumsulfat og arginin (se tabell 1).
- Tilsett 90 μl av fortynning per brønn i en 96-brønns mikrotiterfat (se tabell 1). Siden disse analysene vanligvis utføres i triplikat for hver stamme, bør det være 24 brønner av hver stamme.
-
Utsette planktoniske celler for en konsentrasjonsgradient av antibiotika
- Forbered 10x fortynningsserie av antibiotika for 7 brønner. Eksempel: For antibiotika tobramycin er de endelige konsentrasjonene i brønnene 0,032, 0,016, 0,008, 0,004, 0,002, 0,001 og 0,0005 mg/ml. Fra et lager på 25 mg/ml, lag fortynning på 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 og 0,005 mg/ml. La det stå på is.
- Tilsett 10 μl av hver 10x antibiotikakonsentrasjon for å oppnå de ønskede endelige konsentrasjonene. Tilsett 10 μl vann (ingen antibiotikakontroll) til den endelige brønnen for hver replikering og belastning.
- Inkuber mikrotiterplaten i 24 timer ved 37 °C.
-
Analyse for levende celler.
- Merk to LB agarplater per 96-brønns mikrotiterplate.
- Steriliser multiprong-enheten (se tabell 1) ved å dyppe pinnene i 100 % etanol og føre pinnene over den åpne flammen til en Bunsen-brenner. gjenta. La pinnene avkjøles litt. Bruk multiprong-enheten, overfør ~ 3 μl (mengde som vanligvis beholdes på spissene på pinnene) av planktonisk kultur fra hver brønn på mikrotiterplaten til overflaten av en LB agarplate.
- Inkuber LB agarplatene i 16 timer ved 37 °C.
- Bestem minimal bakteriedrepende konsentrasjon av antibiotika ved å identifisere, for øyet, avskåret for bakterievekst (Figur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MBC-P- og MBC-B-analyser ble utført, og sammenlignet følsomheten til PA14 vill type med PA14 ∆ndvB. Tobramycin ble brukt som antibiotika. Resultater som tilsvarer trinn 1.4.4 (figur 1) og trinn 2.3.4 (figur 2) presenteres. PA14 og ∆ndvB ble inokulert i MBC-P- og MBC-B-analysene i triplikat. Etter å ha fullført trinn 1.0-1.4 i MBC-B-protokollen og trinn 2.0-2.3 i MBC-P-protokollen, ble de levedyktige cellene belagt på en LB-agarplate. Konsentrasjoner av tobramycin(μg/ml) er indikert til venstre for cellene. MBC-B for PA14 er 100 μg/ml og MBC-B i ∆ndvB er 12,5 μg/ml. MBC-P for både PA14 og ∆ndvB mutant er 8 μg/ml.
Figur 1. Representative resultater fra en MBC-B-analyse med PA14 wild type vs. PA14 ∆ndvB og tobramycin. Verdier refererer til den endelige konsentrasjonen av tobramycin (μg/ml).
Figur 2. Representative resultater fra en MBC-P-analyse med PA14 wild type vs. PA14 ∆ndvB og tobramycin. Verdier refererer til den endelige konsentrasjonen av tobramycin (μg/ml).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Antibiotikaresistens i planktoniske celler er definert som en økning i minimum hemmende konsentrasjon (MIC) av et antibiotikum på grunn av en permanent endring i cellene(f.eks. en mutasjon). Mekanismene for biofilmspesifikk motstand eller toleranse som hittil er identifisert, er et resultat av uttrykket av ville gen i biofilmer. Dermed gjelder den klassiske definisjonen av motstand ikke biofilmer. Imidlertid har et annet sett med definisjoner blitt presentert: motstandsmekanismer hindrer antibiotika i å få tilgang til målet, mens toleransemekanismer stenger målene for antibiotika10. Biofilmspesifikke antibiotikaresistensmekanismer omfatter begge disse definisjonene. Begrepet "motstand" har blitt brukt gjennom hele denne protokollen, men videre eksperimentering må utføres for å avgjøre om et gen bidrar til motstand eller toleranse.
MBC-P- og MBC-B-analysene kan tilpasses enhver biofilmdannende bakteriestamme og eventuelt bakteriedrepende antimikrobielt middel. De to viktige kriteriene for å tilpasse denne analysen til andre bakterier og andre antimikrobielle midler er å bestemme forhold som fører til biofilmdannelse og bestemme riktig konsentrasjonsområde for det antimikrobielle middelet ved hjelp av den ville typen interessestamme. Riktige biofilmformasjonsforhold kan bestemmes ved hjelp av en JoVE biofilmformasjonsprotokoll publisert av George O'Toole9. For å bestemme et passende konsentrasjonsområde for MBC-B-analysen, er en god tommelfingerregel å bruke 25 x MIC (minimal hemmende konsentrasjon11) som midtkonsentrasjon av området og justere tilsvarende. For MBC-P-analysen bruker du 1/10 av verdiene som er identifisert for MBC-B-analysen. Målet er å definere en rekke konsentrasjoner som vil gi en klar forskjell mellom MBC-B av villtypestammen og en sensitiv mutantstamme. Dermed bør den øverste enden av området være nær MBC-B av villtypestammen. Vi gjentar dette eksperimentet minst tre ganger, noe som gir minst 9 datapunkter per belastning.
Det mest kritiske trinnet i disse analysene er å unngå forurensning. For å forhindre forurensning mellom stammer, bør en tom kolonne stå mellom stammer. Et annet kritisk trinn er å gi nok tid til at metallpinnene på multiprong-enheten avkjøles nok. Dette kan testes ved å brenne pinnene, timing kjøleperiode og raskt berøre pinnene med hendene.
Hvis løsrivelse av cellene fra biofilmen etter eksponering for antibiotika er et problem, kan MBC-B-metoden endres for å inkludere et sonikeringstrinn. Hopp over trinn 1.3.3 (24 timers inkubasjon etter tilsetning av ferske medier). Dekk i stedet brønnene til den 96-brønns mikrotiterplaten etter å ha tilsatt 115 μl ferske medier (trinn 1.3.2) med steril klebeplatetetning og sonikeringsplate for å løsne biofilmceller fra brønnens vegger. Bruk en vannbad soniker. Spesifikke forhold (tid, intensitet) for effektiv fjerning av biofilmceller fra plasten må bestemmes på forhånd.
En variant av MBC-B ble brukt til å screene et bibliotek med 4000 transposoninnsettingsmutanter av P. aeruginosa for biofilmspesifikke mutanter for antibiotikaresistens. En konsentrasjon av tobramycin (50 μg/ml) ble valgt som ikke ville drepe biofilmceller av vill type, men som ville tillate identifisering av mutanter som var 3 ganger mer følsomme enn den ville biofilmen. I stedet for å inokulere kolonner med brønner med en bestemt bakteriestamme, ble hver brønn inokulert med en annen mutant. Mutantene ble igjen for å danne en biofilm, utsatt for 50 μg/ml tobramycin, igjen for å komme seg etter tobramycineksponering og deretter analysert for levedyktighet. Mutanter som ikke overlevde 50 μg/ml tobramycineksponering ble testet på nytt under de samme screeningforholdene. Protokollene MBC-P og MBC-B ble brukt til å bekrefte mutantenes tobramycinfølsomme fenotyper.
Det finnes andre metoder for å analyse antibiotikaresistens i biofilmer, det vil si kolonibiofilmer og biofilmer dyrket i bioreaktorer12,13. Disse metodene er betydelig mer arbeidskrevende og begrenset i antall stammer som lett kan analysees. Dermed er en fordel som MBC-B har over disse andre metodene at det er høy gjennomstrømning, slik at forskeren kan gjennomføre skjermer eller å analyse flere stammer, samt flere forskjellige antibiotikakonsentrasjoner på en gang.
| Navn på reagenset | firma | Katalognummer | Kommentarer (valgfritt) |
| 1x M63 | Forbered deg som en 5x M63 lager ved å oppløse 15 g KH2PO4,35 g K2HPO4 og 10 g (NH4)2SO4 i 1 liter vann. Denne bestanden trenger ikke å autoklaveres og kan lagres ved romtemperatur. Fortynn 5x lager 1: 5, autoklav, avkjøl, og legg deretter til de ønskede komponentene. | ||
| KH2Po4 | fisker | P285-500 | |
| K2HPO4 | fisker | P288-500 | |
| (NH4) 2 SÅ4 | Sigma | A5132 | |
| Magnesiumsulfat | fisker | M63-500 | Legg til 1 mM endelig konsentrasjon. Forbered deg som en 1 M bestand i vann og autoklav. |
| Tobramycin | Sigma | Forbered 50 mg/ml lager. Aliquot og oppbevar ved -20 °C. | |
| Arginine | Sigma | A5131 | Legg til 0,4% endelig konsentrasjon. Forbered deg som 20% lager i vann og filtrer steriliser. Denne alternative karbon-/energikilden kan erstatte glukose- og casaminosyrer |
| 96-brønns mikrotiterplater | Corning | 3595 | Steril, flatbunn, lav fordampning |
| Tranferpette (flerkanals pipette) | BrandTech | 2703610 | 8-kanals, 20-200 μl |
| Multiprong-enhet | Dan-Kar | MC48 | 48 pinner passer inn i 1/2 av en 96-brønns mikrotiterplate |
Tabell 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren erklærer at hun ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatteren vil takke Li Zhang, Xian-Zhi Li, Aaron Hinz og Clayton Hall for redaksjonell hjelp med dette manuskriptet. Denne analysen ble opprinnelig utviklet i laboratoriet til George O'Toole, Geisel School of Medicine i Dartmouth. Forskning i Dr. Mahs laboratorium støttes av tilskudd fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada og Cystic Fibrosis Canada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x M63 |
Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. |
||
| KH2PO4 |
Fisher | P285-500 |
|
| K2HPO4 |
Fisher | P288-500 |
|
| (NH4)2SO4 |
Sigma | A5132 |
|
| Magnesium sulfate |
Fisher | M63-500 |
Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
| Tobramycin |
Sigma | Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at -20°C. |
|
| Arginine |
Sigma | A5131 |
Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
| 96-well microtiter plates |
Corning | 3595 |
Sterile, flat-bottom, low evaporation |
| Tranferpette (multichannel pipette) |
BrandTech | 2703610 |
8-channel, 20-200 μl |
| Multiprong device |
Dan-Kar | MC48 |
48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate |
References
- Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard-eighth edition. , Ninth Edition, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2009).
- Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
- Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
- Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
- Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
- Zhang, L., Mah, T. F. The Involvement of a Novel Efflux System in Biofilm-Specific Resistance to Antibiotics. J. Bacteriol. 190 (13), 4447-4452 (2008).
- Zhang, L., Hinz, A. J., Nadeau, J. P., Mah, T. F. Pseudomonas aeruginosa tssC1 Links Type VI Secretion and Biofilm-specific Antibiotic Resistance. J. Bacteriol. 193 (19), 5510-5513 (2011).
- Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The Biofilm-Specific Antibiotic Resistance Gene, ndvB, is Important for Expression of Ethanol Oxidation Genes in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
- O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).
- Lewis, K. Multidrug tolerance of biofilms and persister cells. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 107-131 (2008).
- Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement. 31, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2011).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and Analyzing Static Biofilms. Curr. Protoc. Microbiol. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.1.1-1B.1.17 (2005).
- Ramey, B. E., Parsek, M. R. Chapter 1. Growing and analyzing biofilms in fermenters. Curr. Protoc. Microbiol. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.3.1-1B.3.14 (2005).
