Summary
Bu protokol, 96 kuyulu bir mikrotiter plaka kullanarak biyofilm in vitro oluşturabilen bakteriyel bir suş için planktonik ve biyofilm direnci arasında doğrudan bir karşılaştırma sağlar. Planktonik veya biyofilm bakterileri, tercih edilen antimikrobiyal ajanın seri seyreltmelerine maruz kalır. Canlılık, agar plakalarındaki büyüme ile test edilir.
Abstract
Bu protokol, bir biyofilm in vitrooluşturabilen bakteriyel bir suş için planktonik ve biyofilm direnci arasında doğrudan bir karşılaştırma sağlar. Bakteriler 96 kuyulu bir mikroter plakanın kuyularına aşılanır. Planktonik test durumunda, tercih ettiği antimikrobiyal ajanın seri seyreltmeleri bakteriyel süspansiyonlara eklenir. Biyofilm testinde, aşılandıktan sonra, bakteriler belirli bir süre boyunca bir biyofilm oluşturmak için bırakılır. Eklenmemiş hücreler kuyulardan çıkarılır, ortam yenilenir ve tercih edilen antimikrobiyal ajanın seri seyreltmeleri eklenir. Antimikrobiyal ajana maruz kaldıktan sonra, planktonik hücreler büyüme için test edilir. Biyofilm tahlili için, medya antimikrobiyal ajandan yoksun taze medya ile yenilenir ve biyofilm hücreleri iyileşmeye bırakılır. Biyofilm hücre canlılığı iyileşme döneminden sonra test edilir. Antimikrobiyal ajan için MBC-P, planktonik kültürdeki hücreleri öldüren en düşük ilaç konsantrasyonu olarak tanımlanır. Buna karşılık, bir suş için MBC-B, önceden biçimlendirilmiş biyofilmlerin 24 saat boyunca artan antimikrobiyal ajan konsantrasyonlarına maruz kalarak belirlenir. MBC-B, biyofilmdeki hücreleri öldüren en düşük antimikrobiyal ajan konsantrasyonu olarak tanımlanır.
Introduction
Antibiyotik direnci tahlilleri başlangıçta planktonik (serbest yüzme) bakteri kültürlerinin direncini test etmek için geliştirilmiştir. Birçok bakteriyel enfeksiyon biyofilmleri (yüzeye bağlı hücreler) içerdiğinden, biyofilme özgü antibiyotik direncini test etmek için bir yöntem geliştirmekle ilgileniyorduk. Bununla birlikte, antibiyotik direnci testlerinin çoğu biyofilmlerin direncini ölçmek için uygun değildir. Örneğin, minimum inhibitör konsantrasyonun (MIC) belirlenmesi, planktonik bakteri kültürlerinin antibiyotik direncini belirlemek için altın standarttır 1. Bu test, seyreltilmiş bir planktonik kültürün bir seyreltme antibiyotik serisi ile karıştırılmasını gerektirir. Planktonik hücrelerin görünür büyümesini engelleyen antibiyotik konsantrasyonu MIC'dir. Bu test büyümenin inhibisyonunu dayandığından, tanım olarak, önceden büyümüş bir biyofilmdeki hücrelerin antibiyotik duyarlılığını incelemeyi gerektiren biyofilm kültürleriyle çalışamaz. Burada açıklanan MBC-B tahlili, büyüme inhibisyonunu ölçmek yerine, bir biyofilmde zaten var olan hücreleri öldüren antibiyotik konsantrasyonunu belirler. Bu nedenle, bu test yerleşik biyofilm enfeksiyonlarının antibiyotik tedavilerini taklit etmeyi ve bakteriyelantibiyotik direncinin vivo daha alakalı bir görünümünü sağlamayı amaçlamaktadır.
Biyofilmler genellikle planktonik kültürlerden daha antibiyotik dirençli olduğundan 2-4 Bir biyofilmin antibiyotik direncini planktonik bir kültürünkiyle doğrudan ilişkilendiren bir yöntem tasarlamak gerekiyordu. Bu nedenle, bu yöntemin bir diğer amacı, planktonik ve biyofilm hücreleri arasındaki antibiyotik direnci seviyesini doğrudan karşılaştırabilmektir. Burada açıklanan MBC-P ve MBC-B tahlilleri bunu mümkün kilmektedir çünkü hücreler benzer koşullar altında kültürlenir. Biyofilme özgü antibiyotik direnci için önemli olan birkaç geni incelemek için bu yöntemi kullandık 5-8 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. MBC-B
-
Bir biyofilm yetiştirmek (O'Toole 9'danuyarlanmıştır).
- 37 °C'de zengin bir ortamda 16 saat boyunca vahşi tip ilgi ve mutant suşu kültürünü büyütün.
- Doymuş gece kültürlerini 1:100 antibiyotik direnci tahlilleri için taze ortama seyreltin. P. aeruginosa için standart bir ortam, magnezyum sülfat ve arginin ile desteklenmiş M63 minimal ortadır (bkz. Tablo 1). Bu ortam daha sağlam bir biyofilm oluşumunu uyarır.
- 96 kuyulu bir mikrotiter kabına kuyu başına 100 μl seyreltme ekleyin (bkz. Tablo 1). Bu tahliller tipik olarak her suş için üç taraflı olarak yapıldığı için, her suşun 24 kuyusu olmalıdır.
- Mikrotiter plakayı 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.
-
Önceden biçimlendirilmiş biyofilmin bir konsantrasyon gradyan antibiyotikine maruz getirilmesi
- 7 kuyu için 10x seyreltme antibiyotik serisi hazırlayın. Örnek: antibiyotik tobramycin için, kuyulardaki son konsantrasyonlar 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125 ve 0.006 mg/ml 5-8'dir. 25 mg/ml'lik bir stoktan 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 ve 0,06 mg/ml'lik 10x seyreltmeler hazırlayın. Buzun üzerinde bırak.
- Harcanan süpernatant (planktonik hücreler içeren) çok kanallı pipet kullanarak çıkarın (bkz. Tablo 1).
- Tüm kuyulara 90 μl M63 (Mg/Arg) ekleyin.
- İstenilen son konsantrasyonları elde etmek için her 10x antibiyotik konsantrasyonunun 10 μl'sini ekleyin. Her çoğaltma ve gerinim için son kuyuya 10 μl su (antibiyotik kontrolü yok) ekleyin.
- Mikrotiter plakayı 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.
-
Ortamı yenilemek ve canlı hücrelerin birliğine izin vermek.
- Harcanan süpernatant (planktonik hücreler içeren) çok kanallı pipet kullanarak çıkarın.
- Tüm kuyulara 115 μl M63 (Mg/Arg) ekleyin.
- Mikrotiter plakayı 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.
-
Canlı hücreler için test.
- 96 kuyulu mikroter plaka başına iki LB agar plakası etiketle.
- Uçları % 100 etanol içine batırarak ve uçları bir Bunsen brülörünün açık alevinden geçirerek çok ürünlü cihazı sterilize edin (bkz. Tablo 1). yinelemek. Uçları hafifçe soğumaya bırakın. Çok yönlü cihazı kullanarak, mikrotiter plakanın her kuyusundan lb agar plakasının yüzeyine planktonik kültürün ~3 μl'yi (tipik olarak uçlarda tutulan miktar) aktarın.
- LB agar plakalarını 37 °C'de 16 saat kuluçkaya yatırın.
- Bakteri üremesi için kesileni gözle tanımlayarak antibiyotiğin minimum bakterisidal konsantrasyonunu belirleyin (Şekil 1).
2. MBC-P
-
Bakteri suşlarının hazırlanması
- 37 °C'de zengin bir ortamda 16 saat boyunca vahşi tip ilgi ve mutant suşu kültürünü büyütün.
- Doymuş gece kültürlerini 1:100 antibiyotik direnci tahlilleri için taze ortama seyreltin. P. aeruginosa için standart bir ortam, magnezyum sülfat ve arginin ile desteklenmiş M63 minimal ortadır (bkz. Tablo 1).
- 96 kuyulu bir mikrotiter kabına kuyu başına 90 μl seyreltme ekleyin (bkz. Tablo 1). Bu tahliller tipik olarak her suş için üç taraflı olarak yapıldığı için, her suşun 24 kuyusu olmalıdır.
-
Planktonik hücreleri antibiyotik konsantrasyon gradyanine maruz kalma
- 7 kuyu için 10x seyreltme antibiyotik serisi hazırlayın. Örnek: Antibiyotik tobramycin için kuyulardaki son konsantrasyonlar 0.032, 0.016, 0.008, 0.004, 0.002, 0.001 ve 0.0005 mg/ml'dir. 25 mg/ml'lik bir stoktan 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 ve 0,005 mg/ml'lik seyreltmeler hazırlayın. Buzun üzerinde bırak.
- İstenilen son konsantrasyonları elde etmek için her 10x antibiyotik konsantrasyonunun 10 μl'sini ekleyin. Her çoğaltma ve gerinim için son kuyuya 10 μl su (antibiyotik kontrolü yok) ekleyin.
- Mikrotiter plakayı 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.
-
Canlı hücreler için test.
- 96 kuyulu mikroter plaka başına iki LB agar plakası etiketle.
- Uçları % 100 etanol içine batırarak ve uçları bir Bunsen brülörünün açık alevinden geçirerek çok ürünlü cihazı sterilize edin (bkz. Tablo 1). yinelemek. Uçları hafifçe soğumaya bırakın. Çok yönlü cihazı kullanarak, mikrotiter plakanın her kuyusundan lb agar plakasının yüzeyine planktonik kültürün ~3 μl'yi (tipik olarak uçlarda tutulan miktar) aktarın.
- LB agar plakalarını 37 °C'de 16 saat kuluçkaya yatırın.
- Bakteri üremesi için kesileni gözle tanımlayarak antibiyotiğin minimum bakterisidal konsantrasyonunu belirleyin (Şekil 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PA14 vahşi tipinin hassasiyetini PA14 ∆ndvBile karşılaştıran MBC-P ve MBC-B tahlilleri gerçekleştirildi. Antibiyotik olarak tobramycin kullanıldı. Adım 1.4.4 (Şekil 1) ve adım 2.3.4 (Şekil 2) 'ye karşılık gelen sonuçlar sunulmuştur. PA14 ve ∆ndvB üç taraflı olarak MBC-P ve MBC-B testlerine aşılandı. MBC-B protokolünün 1.0-1.4 ve MBC-P protokolünün 2.0-2.3. Hücrelerin solunda tobramycin(μg/ml) konsantrasyonları belirtilir. PA14 için MBC-B 100 μg/ml ve ∆ndvB için MBC-B 12,5 μg/ml'dir. Hem PA14 hem de ∆ndvB mutant için MBC-P 8 μg/ml'dir.
Şekil 1. PA14 vahşi tipine ve PA14 ∆ndvB ve tobramisine sahip bir MBC-B testinden temsili sonuçlar. Değerler son tobramisinin konsantrasyonuna (μg/ml) atıfta bulunur.
Şekil 2. PA14 vahşi tipine ve PA14 ∆ndvB ve tobramycin'e sahip bir MBC-P testinden temsili sonuçlar. Değerler son tobramycin konsantrasyonuna(μg/ml) atıfta bulunur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Planktonik hücrelerde antibiyotik direnci, hücrelerde kalıcı bir değişiklik (örneğin bir mutasyon) nedeniyle bir antibiyotiğin minimum inhibitör konsantrasyonunda (MIC) bir artış olaraktanımlanır. Bugüne kadar tanımlanan biyofilme özgü direnç veya tolerans mekanizmaları, biyofilmler içindeki vahşi tip genlerin ekspresyonunun sonucudur. Bu nedenle, klasik direnç tanımı biyofilmler için geçerli değildir. Bununla birlikte, başka bir tanım kümesi sunulmuştur: direnç mekanizmaları antibiyotiğin hedefine erişmesini engellerken, tolerans mekanizmaları antibiyotik hedeflerini kapatır10. Biyofilme özgü antibiyotik direnç mekanizmaları bu tanımların her ikisini de kapsar. Bu protokol boyunca "direnç" terimi kullanılmıştır, ancak bir genin dirence veya toleransa katkıda bulunup bulunmadığını belirlemek için daha fazla deney yapılmalıdır.
MBC-P ve MBC-B tahlilleri biyofilm oluşturan herhangi bir bakteri suşu ve herhangi bir bakterisidal antimikrobiyal ajan için uyarlanabilir. Bu testin diğer bakterilere ve diğer antimikrobiyal ajanlara uyarlanması için iki önemli kriter, biyofilm oluşumuna yol açan koşulları belirlemek ve ilgi çekici vahşi tip suşunu kullanarak antimikrobiyal ajan için uygun konsantrasyon aralığını belirlemektir. Uygun biyofilm oluşum koşulları George O'Toole9tarafından yayınlanan bir JoVE biyofilm oluşum protokolü kullanılarak belirlenebilir. MBC-B tahlili için uygun bir konsantrasyon aralığı belirlemek için, iyi bir kural, aralığın orta konsantrasyonu olarak 25 x MIC (minimum inhibitör konsantrasyon11)kullanmak ve buna göre ayarlamaktır. MBC-P tahlil için, MBC-B tahlili için tanımlanan değerlerin 1/10'unun kullanımını kullanın. Amaç, vahşi tip suşun MBC-B'si ile hassas bir mutant suşu arasında net bir fark sağlayacak bir dizi konsantrasyon tanımlamaktır. Bu nedenle, aralığın üst ucu vahşi tip suşun MBC-B'sine yakın olmalıdır. Bu deneyi en az üç kez tekrarlıyoruz ve gerinim başına en az 9 veri noktası veriyoruz.
Bu tahlillerin en kritik adımı kontaminasyonu önlemektir. Suşlar arasındaki kirlenmeyi önlemek için, suşlar arasında boş bir sütun bırakılmalıdır. Bir diğer kritik adım, çok yönlü cihazdaki metal çatalların yeterince soğuması için yeterli zaman tanımaktır. Bu, çatalları alevlendirerek, soğutma süresini zamanlayarak ve uçlara elleriyle hızlı bir şekilde dokunarak test edilebilir.
Antibiyotiklere maruz kaldıktan sonra hücrelerin biyofilmden ayırılması bir sorunsa, MBC-B yöntemi bir sonikasyon adımı içerecek şekilde değiştirilebilir. 1.3.3 adımını atlayın (taze ortam eklenmeden sonra 24 saat inkübasyon). Bunun yerine, 96 kuyulu mikroter plakanın kuyularını, 115 μl taze ortam (adım 1.3.2) ekledikten sonra, kuyuların duvarlarından biyofilm hücrelerini yerinden çıkarmak için steril yapışkan plaka contası ve sonicate plakası ile örtün. Su banyosu sonicator kullanın. Biyofilm hücrelerinin plastikten verimli bir şekilde uzaklaştırılması için özel koşullar (zaman, yoğunluk) önceden belirlenmelidir.
MBC-B'nin bir varyasyonu, biyofilme özgü antibiyotik direnci mutantları için P. aeruginosa'nın 4.000 transposon ekleme mutantının kütüphanesini taramak için kullanıldı. Vahşi tip biyofilm hücrelerini öldürmeyecek, ancak vahşi tip biyofilmden 3 kat daha hassas olan mutantların tanımlanmasına izin verecek bir tobramisin (50 μg/ml) konsantrasyonu seçildi. Kuyu sütunlarını belirli bir bakteri türüyle aşılamak yerine, her kuyu farklı bir mutantla aşılandı. Mutantlar, 50 μg/ml tobramycin'e maruz kalan bir biyofilm oluşturmak için bırakıldı, tobramycin maruziyetinden kurtulmak için bırakıldı ve daha sonra canlılık için test edildi. G/ml tobramycin maruziyeti μ 50'sinedayanamayan mutantlar aynı tarama koşullarında tekrar test edildi. Mutantların tobramisine duyarlı fenotiplerini doğrulamak için MBC-P ve MBC-B protokolleri kullanılmıştır.
Biyofilmlerde antibiyotik direncini test etmek için başka yöntemler de vardır, yani biyoreaktörlerde yetişen koloni biyofilmleri ve biyofilmler12,13. Bu yöntemler, kolayca test edilebilen suşların sayısında oldukça daha zahmetli ve sınırlıdır. Bu nedenle, MBC-B'nin bu diğer yöntemlere göre sahip olduğu bir avantaj, araştırmacının ekranları yönetmesine veya birkaç suşun yanı sıra aynı anda birkaç farklı antibiyotik konsantrasyonunu test etmesine izin veren yüksek verim olmasıdır.
| Reaktifin adı | şirket | Katalog numarası | Açıklamalar (isteğe bağlı) |
| 1x M63 | 15 g KH2PO4,35 g K 2 HPO 4 ve 10 g(NH 4 )2SO4'ü1L su içinde eriterek 5x M63 stok olarak hazırlanın. Bu stoğun otomatik olarak kapatılması gerekmez ve oda sıcaklığında saklanabilir. 5x stok 1:5 seyreltin, otoklav, soğutun, ardından istediğiniz bileşenleri ekleyin. | ||
| KH2PO4 | balıkçı | P285-500 | |
| K2HPO4 | balıkçı | P288-500 | |
| (NH4) 2 YANI4 | Sigma | A5132 | |
| Magnezyum sülfat | balıkçı | M63-500 | 1 mM son konsantrasyona ekleyin. Su ve otoklavda 1 M stok olarak hazırlanın. |
| Tobramycin | Sigma | 50 mg/ml stok hazırlayın. Aliquot ve -20 °C'de saklayın. | |
| arginin | Sigma | A5131 | % 0.4 son konsantrasyon ekleyin. Suda % 20 stok olarak hazırlayın ve sterilize edin. Bu alternatif karbon/enerji kaynağı glikoz ve casamino asitlerin yerini alabilir |
| 96 kuyulu mikroter plakalar | Corning | 3595 | Steril, düz tabanlı, düşük buharlaşma |
| Tranferpette (çok kanallı pipet) | BrandTech | 2703610 | 8 kanallı, 20-200 μl |
| Çok katmanlı aygıt | Dan-Kar | MC48 | 96 kuyulu bir mikrotiter plakanın 1/2'sine 48 çatal sığar |
Tablo 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazar, rakip finansal çıkarları olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Yazar li Zhang, Xian-Zhi Li, Aaron Hinz ve Clayton Hall'a bu makalenin editoryal yardımı için teşekkür eder. Bu test ilk olarak Dartmouth'taki Geisel Tıp Fakültesi George O'Toole'un laboratuvarında geliştirilmiştir. Dr. Mah'un laboratuvarındaki araştırmalar, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendisliği Araştırma Konseyi ve Kistik Fibrozis Kanada'nın hibeleriyle desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x M63 |
Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. |
||
| KH2PO4 |
Fisher | P285-500 |
|
| K2HPO4 |
Fisher | P288-500 |
|
| (NH4)2SO4 |
Sigma | A5132 |
|
| Magnesium sulfate |
Fisher | M63-500 |
Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
| Tobramycin |
Sigma | Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at -20°C. |
|
| Arginine |
Sigma | A5131 |
Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
| 96-well microtiter plates |
Corning | 3595 |
Sterile, flat-bottom, low evaporation |
| Tranferpette (multichannel pipette) |
BrandTech | 2703610 |
8-channel, 20-200 μl |
| Multiprong device |
Dan-Kar | MC48 |
48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate |
References
- Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard-eighth edition. , Ninth Edition, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2009).
- Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O.
- Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
- Mah, T. F.
- Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
- Zhang, L., Mah, T. F. The Involvement of a Novel Efflux System in Biofilm-Specific Resistance to Antibiotics. J. Bacteriol. 190 (13), 4447-4452 (2008).
- Zhang, L., Hinz, A. J., Nadeau, J. P., Mah, T. F. Pseudomonas aeruginosa tssC1 Links Type VI Secretion and Biofilm-specific Antibiotic Resistance. J. Bacteriol. 193 (19), 5510-5513 (2011).
- Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The Biofilm-Specific Antibiotic Resistance Gene, ndvB, is Important for Expression of Ethanol Oxidation Genes in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
- O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).
- Lewis, K. Multidrug tolerance of biofilms and persister cells. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 107-131 (2008).
- Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement. 31, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2011).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and Analyzing Static Biofilms. Curr. Protoc. Microbiol. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.1.1-1B.1.17 (2005).
- Ramey, B. E., Parsek, M. R. Chapter 1. Growing and analyzing biofilms in fermenters. Curr. Protoc. Microbiol. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.3.1-1B.3.14 (2005).
