Summary

Выделение и культуры эндотелиальных клеток из эмбриональных переднего мозга

Published: January 23, 2014
doi:

Summary

Это видео демонстрирует простой и надежный стратегию подготовки чистых культур эндотелиальных клеток из эмбриональных переднего мозга в течение 10-12 дней и будет полезна для исследования сосредоточены на многие аспекты мозговой ангиогенеза.

Abstract

Эмбриональные мозг эндотелиальные клетки могут служить в качестве важного инструмента в изучении ангиогенеза и развития нервно-сосудистого и взаимодействий. Два сосудистые сети эмбрионального переднего мозга, мягкой мозговой оболочки и Перивентрикулярная, пространственно отличительные и имеют различное происхождение и динамику роста. Эндотелиальных клеток из мягкой мозговой оболочки и перивентрикулярных сосудистых сетей имеют уникальные профили экспрессии генов и функции. Здесь мы представляем шаг за шагом протокол для изоляции, культуры и проверки чистых популяций эндотелиальных клеток из перивентрикулярном сосудистой сети (PVECs) эмбрионального переднего мозга (конечный мозг). При таком подходе конечный мозг лишен пиальных мембраны, полученной из эмбриональных день 15 мышей фарш, расщепляли коллагеназы / диспазы, и диспергировали механически в суспензии отдельных клеток. PVECs очищают от клеточной суспензии с использованием позитивного выделение anti-CD-31/PECAM-1 антитела, конъюгированного с микросферы с помощью сильного магнитногометод разделения. Очищенные клетки культивируют на коллаген 1 покрытых чашек для культивирования в эндотелиальной клеточной культуральной среды, пока они не сливаться и далее субкультивировали. PVECs получены с этого протокола выставочная булыжник и шпинделя форме фенотипов, как визуализируется фазового контраста световой микроскопии и флуоресцентной микроскопии. Чистоту PVEC культур был создан с маркеров эндотелиальной клетки. В наших руках, этот метод надежно и последовательно дает чистые популяции PVECs. Этот протокол принесет пользу исследований, направленных на получение механистические понимание переднего мозга ангиогенеза, понимая PVEC взаимодействия и перекрестные переговоры с нейронных типов клеток и имеет огромный потенциал для терапевтического ангиогенеза.

Introduction

Ангиогенеза, нейрогенез и миграция нейронов являются важнейшими событиями в центральной нервной системе (ЦНС) развития, восстановления и регенерации. Несколько элегантные исследования показали, что эндотелиальные клетки стимулируют пролиферацию нейронов и наоборот посредством выпуска растворимых факторов и при непосредственном контакте. Мы обнаружили, что любопытно, что в большинстве этих исследований 1-3, в то время как нейронные предшественниках / нервные стволовые клетки выделяют из эмбрионального мозга, они культивировали совместно с эндотелиальных клеток из мозга взрослого человека, других источников для взрослых тканей или с эндотелиальных клеточных линий. Это может быть частично из-за технических трудностей, связанных с ОД и культивирования чистые популяции эндотелиальных клеток из эмбриональных мозга. Однако, ангиогенез, нейрогенез и миграция нейронов являются одновременно события, происходящие в порядков более надежной в эмбриональном мозге, чем в нормальном взрослом мозге. Перивентрикулярная сосудистая сеть из embryoniс переднего мозга (конечный мозг) происходит от судна, расположенного в базальных ганглиев зачатка и развивается в виде упорядоченной градиентом от вентральной спинного конечного мозга на эмбриональный день 11 (Е11) 4,5. Это сплетение сосудов перивентрикулярном сосудистой сети отличаются от мягкой мозговой оболочки сосудов на основе происхождения, анатомического расположения, характер роста, и регулирование развития 4,5. Направление распространения перивентрикулярном ангиогенеза градиента соответствует конечного мозга поперечную нейрогенного градиент. В конечном мозге, перивентрикулярная ангиогенез градиент и градиент ГАМК нейронов мигрируют по касательной перекрывает пространственно, а 6. Что касается сроков, ангиогенез градиент в преддверии нейрогенного градиента и ГАМК нейронов градиентом примерно на сутки. Таким образом, перивентрикулярные эндотелиальные клетки в пространстве и времени и возможности для предоставления критических сигналы для поддержки конечного мозга нейрогенез имиграции нейронов 4,6. Таким образом, использование эмбриональных перивентрикулярных эндотелиальных клеток в сокультивирования экспериментов с нейронных клеток-предшественников и / или нейронов обеспечит более благоприятные модель для изучения нейроваскулярные взаимодействия и разработки новых путей для лечения нейродегенеративных заболеваний или ишемического / черепно-мозговой травмой.

Мы подчеркиваем важность устранения пиальных мембрану, не только для ограничения загрязнения эпителиальных клеток, но и отделить пиальных эндотелиальные клетки, которые на молекулярном уровне и функционально отличается от эндотелиальных клеток перивентрикулярном сосудистой сети 4,6 (называемые PVECs отличить от пиальных ECS) . Здесь мы описываем метод, который мы обычно используем в нашей лаборатории, чтобы получить богатый и чистый выход PVECs. Эти эндотелиальные клетки получают из эмбриональных переднего мозга, выделенных из одного тайм-беременной мыши. Они могут быть расширены, субкультивировали, и замораживали успешно для использования в будущем.

Protocol

1. Подготовка реагентов и решения Покрытие 35 мм чашки для культивирования: Коллаген типа 1 раствор подается в виде водного раствора в 20 мМ уксусной кислоты (~ 100 мг белка / пробирку). Развести соответствующий объем раствора коллагена в рабочей концентрации 0,01% с использованием стери?…

Representative Results

Фенотипическое характеристика PVECs от дня 1-12 показана фазового контраста световой микроскопии (рис. 2). Клетки, прикрепленные к блюду на день 1 показать морфологии характеристики клеточного деления (рис. 2а). Между 5-8 дней, PVECs переход от булыжник на шпиндель образный морф…

Discussion

PVEC являются более физиологически актуальным, чем взрослых эндотелиальных клетках головного мозга и ЭК из других источников тканей для исследований, посвященных сосудисто-нервных взаимодействий, а также имеют терапевтический потенциал. Для подготовки PVEC, очень важно начало с рассече?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальным альянсом по изучению шизофрении и депрессии (NARSAD) премия для молодых следователь и Национальных Институтов Здоровья предоставляют R01NS073635 к AV.

Materials

DNase I Sigma D-4527
Collagen, Type 1 solution from rat tail Sigma C3867
DPBS Quality Biologicals 114057-131
EDTA Fisher Scientific M4055
BSA Sigma A2058
MS column Miltenyi Biotech 130-042-201
CD31 microbeads Miltenyi Biotech 130-097-418
MACS separator Miltenyi Biotech 130-042-102
MACS multi stand Miltenyi Biotech 130-042-303
Cell strainer 70 µm BD Bioscience 352350
Antibiotic and antimycotic solution Sigma A5955
FBS Sigma F4135
Collagenase/Dispase Roche 10269638001
DMEM Lonza 12-604F
35 mm culture dish BD Bioscience 353001
15 ml falcon tube BD Bioscience 352097
50 ml falcon tube BD Bioscience 352098
ECCM kit BD Bioscience 355054 Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF and Soybean Trypsin Inhibitor
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) BD Bioscience 354006
RBECGM Cell applications R819-500
DMEM F12 Life Technologies 10565-018
glutamax Life Technologies 305050-061
tissue culture grade water Life Technologies 15230162
0.25% Trypsin Life Technologies 15050
Soyabean trypsin inhibitor BD Bioscience 5425
Matrigel BD Bioscience 354234
Qtracker 655 Cell Labeling Kit Life Technologies Q25021
CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0 Life Technologies C10608
Biotinylated Isolectin B4 antibody Sigma L2140
Anti-Von Willebrand factor Sigma F3520
Anti-CD31/PECAM-1 BD Pharmingen 550274
Vectashield Hardset Mounting media with DAPI Vector Laboratories H-1500
Ketamine Butler Schein Animal Health Supply 44028
Xylazine Lloyd Laboratories 1009
Stereomicroscope Motic SMZ-168
hemocytometer Fisher Scientific 267110
inverted microscope Olympus CK-40 CK-40
Flouroscent microscope Olympus FSX-100 FSX-100
Fine forceps Roboz surgical instrument 7 inox
Fine microtip scissors Roboz surgical instrument RS5611

References

  1. Shen, Q., S, G., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
  2. Milner, R. A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system. BMC Neurosci. 8, 3 (2007).
  3. Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo. 19, 1469-1485 (2008).
  4. Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).
  5. Vasudevan, A., Bhide, P. G. Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale. Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).
  6. Won, C. K., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).
  7. Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).
  8. Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6, (2011).
  9. Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain. 2, 461-466 (1999).
  10. Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
  11. Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).

Play Video

Cite This Article
Kumar T., P., Vasudevan, A. Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain. J. Vis. Exp. (83), e51021, doi:10.3791/51021 (2014).

View Video