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Bioengineering

Bildung Biomembrane Microarrays mit einem Rakel-basierten Montageverfahren

Published: May 8, 2014 doi: 10.3791/51501

Summary

Unterstützten Lipiddoppelschichten und natürlichen Membran Teilchen sind praktisch Systeme, die die Eigenschaften von Zellmembranen annähern kann und in einer Vielzahl von Analysestrategien eingearbeitet werden. Hier zeigen wir ein Verfahren zur Herstellung von Mikroarrays der unterstützten Lipiddoppelschicht beschichtete SiO 2-Kugeln, Phospholipid-Vesikel oder natürlichen Membranpartikeln.

Abstract

Lipid-Doppelschichtmembranen zu bilden, die Plasmamembranen der Zellen und definieren die Grenzen der subzellulären Organellen. In der Natur werden diese Membranen sind heterogene Gemische von vielen Arten von Lipiden, enthalten membrangebundene Proteine ​​und sind dekoriert mit Kohlenhydraten. In einigen Experimenten, ist es wünschenswert, die biophysikalischen oder biochemischen Eigenschaften der Lipiddoppelschicht von denjenigen der natürlichen Membran entkoppeln. Solche Fälle erfordern die Verwendung von Modellsystemen, wie Riesen-Vesikel, Liposomen oder unterstützten Lipiddoppelschichten (SLBs). Arrays von SLBs sind für Sensoranwendungen und imitiert die Zell-Zell-Interaktionen besonders attraktiv. Hier beschreiben wir ein neues Verfahren zur Bildung SLB-Arrays. Submicron-Durchmesser SiO 2-Kugeln werden zunächst mit Lipid-Doppelschichten beschichtet, um sphärische SLBs (SSLBs) zu bilden. Die Kügelchen werden dann in einer Anordnung von Mikro hergestellt Submikron-Durchmesser Vertiefungen abgeschieden. Die Herstellung Technik verwendet eine "Rakel", um die Substratoberfläche zu reinigen, während leaving hinter SSLBs, die in Mikrovertiefungen niedergelassen haben. Dieses Verfahren erfordert keine chemische Modifikation des Mikrovertiefungs Substrat, noch eine besondere Zielliganden auf der SSLB. Mikrowells durch einzelne Perlen besetzt, weil der Durchmesser gut abgestimmt ist, nur größer als der Kugeldurchmesser sein. Typischerweise mehr 75% der Brunnen belegt sind, während der Rest leer bleiben. In Puffer SSLB Arrays anzuzeigen langfristige Stabilität von mehr als einer Woche. Mehrere Arten von SSLBs können in einem Array von seriellen Abscheidung gebracht werden, und die Anordnungen können zum Abtasten verwendet werden, was wir demonstrieren durch Charakterisierung der Wechselwirkung von Choleratoxin mit Gangliosid GM1. Wir zeigen auch, dass die Phospholipid-Vesikel ohne den Wulst Stützen und Biomembranen aus zellulären Quellen kann mit dem gleichen Verfahren angeordnet werden und Zell-spezifischen Membran-Lipide identifiziert werden.

Introduction

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Lipid-Doppelschicht-Membranen sind wesentliche Strukturen in der Natur. Zellplasmamembranen und Organellen-Membranen sind aus Lipid-Doppelschichten, die eine Reihe von Molekülen, die für das Leben notwendig sind, zusammengesetzt zu integrieren. Viele lebenserhaltenden Prozesse auf der Oberfläche von Zellen vorkommen oder durch Moleküle mit Lipid-Doppelschichtmembranen assoziiert vermittelt. In der Tat sind viele Arzneimittel Ziel Prozesse oder Moleküle auf oder in Membranen 1,2 gefunden. Es ist daher notwendig, analytisch untersuchen Prozesse wie chemische Reaktionen oder nichtkovalente Bindungsereignisse, die auf Membranoberflächen auftreten. Da die natürlichen Membranen kann schwierig sein, mit Sensoren zu isolieren und / oder eine Schnittstelle sein, viele Forscher beschäftigen vereinfachte Modellmembranen zur Durchführung von analytischen Studien. Eine Anzahl von Modellmembransysteme sind in der Literatur beschrieben, von Riesenvesikeln, die zehn bis hundert Mikrometer im Durchmesser, um Liposomen mit nanoskaligen Abmessungen 3,4 sein kann. Alternverhältnismäßig planaren Lipid-Doppelschichten auf festen Trägern abgeschieden, dh unterstützten Lipiddoppelschichten (SLBs), können auf einer Reihe von verschiedenen Oberflächen hergestellt werden und wurden vielfach in der biophysikalischen, biochemischen und analytischen Anwendungen 5 verwendet. Koppeln SLBs mit elektrischen oder optischen Materialien ermöglicht Untersuchung von Membran Biochemie und Biophysik durch die Verwendung von verschiedenen analytischen Techniken. Fluoreszenzmikroskopie 6, 7 der Elektrochemie, optische Spektroskopie 8, 9 der Rastersondenmikroskopie, Oberflächen-Plasmon-Resonanz 10 und Massenspektrometrie 11 wurden alle verwendet, um die Struktur und Eigenschaften von SLBs zu studieren.

SLB-Arrays bieten zusätzliche Flexibilität bei der Gestaltung von Sensoren für die Multiplex-Assays 12,13. Andere Anwendungen verwenden SLB-Arrays, um die Verbindung, die zwischen Immunzellen 14 bildet imitieren. Aufbereitungsmethoden für SLB-Arrays wurden aus microFlu variiertidic nähert sich 15 bis diejenigen, die physikalischen Barrieren zwischen benachbarten SLB-Patches zu verwenden. Andere Gruppen haben 16 Druckverfahren verwendet, 17, 18 und photochemischen Strukturierung verschiedener Nanotechnik nähert sich 19 bis SLB-Arrays erstellen.

In diesem Papier und begleitende Video zeigen wir ein Verfahren zur Bildung SLB-Arrays durch Aufbringen von SLB-beschichtete SiO 2-Kugeln in geordnete Reihen von Vertiefungen 20. Wir verweisen auf die SLB-beschichtete SiO 2-Kugeln als Kugel unterstützt Lipid-Doppelschichten (SSLBs). Diese Technik ist eine Erweiterung der früheren Arbeit, die Arrays von Phospholipid-Vesikeln und Biomembranen aus natürlichen Quellen, 21, aus dem wir zeigen auch, beispielsweise Ergebnisse abgeleitet erstellt. Andere Methoden zum Ordnen Biomembran Partikel oder Vesikel auf Mustern der spezifischen Targeting-Liganden auf Oberflächen, die mit komplementären Liganden auf der Vesikel-Oberfläche enthalten assoziieren verlassen. Beispiele sind Biotin-Avidin Verein 22,23 und DNA-Hybridisierungssysteme 24. Unser Ansatz erfordert nur eine Mikrowell-Array ohne Targeting oder Erkennungsgruppen erforderlich. Die Größe SSLBs wird durch den Durchmesser der SiO 2-Trägern Wulst, die eine geringe Polydispersität aufweisen definiert. Durch die Abstimmung der Mikrowell-Durchmesser, nur größer als der Durchmesser SSLB, setzt sich nur eine einzige SSLB in jede Vertiefung. Ein Poly (dimethylsiloxan) (PDMS) Rakel entfernt dann von der Oberfläche SSLBs alle, die nicht in Mikro immobilisiert sind. Die Streifen und die daraus resultierende SSLB Arrays hoher Dichte (~ 10 5 SSLBs / mm 2) mit 3 um Mitte-zu-Mitte-Abstand und Sechskant Periodizität. Abscheiden von seriell SSLBs mit unterschiedlichen Lipidzusammensetzungen ist es möglich, Mehrkomponenten-Arrays mit zufällig positionierten SSLBs erstellen. Um die Erfassungsfähigkeit SSLB Arrays zeigen, haben wir die Wechselwirkung von Choleratoxin (CTX) mit einem Gangliosid (GM1) in die SSLBs aufgenommen. Mitnatürlichen Membranpartikel, waren wir in der Lage, zellspezifische Lipide im Mehrkomponenten-Arrays enthalten Membranmaterial aus zwei unterschiedlichen Zelltypen zu detektieren.

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Protocol

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1. Microfabrication von Microwell-Array-Substrat

  1. Beginnen mit einem 4-Zoll-Siliziumwafer mit 100 nm thermisch aufgewachsenes Oxid.
  2. Spin SPR-955 0,7 Photoresist auf dem Wafer bei 4000 Upm für 30 Sekunden.
  3. Backen auf einer Heizplatte bei 115 ° C für 90 sek.
  4. Expose Photolack.
    1. Verwenden Sie eine Maske, die ein um Löcher in einem sechseckigen Feld mit einer 3 um Zeit, wo das Array umfasst eine 2 mm x 2 mm Bereich angeordnet schaffen wird.
    2. Aussetzen Wafer in einem i-Linien-Steppers mit einer Schrittweite von 6 mm und einer Belichtung von 200 mJ / cm 2.
  5. Backen auf einer Heizplatte bei 115 ° C für 90 sek.
  6. Entwickeln Sie mit Hilfe eines Spin-Entwickler zu 2 Pfützen von CD-26 auf dem Wafer für eine Gesamtentwicklungszeit von 90 Sekunden zu hinterlegen.
  7. Gründlich mit Reinstwasser DI-Wasser und trocken mit N 2 spülen.
  8. Ätzen des Oxids in einer Blind Ionenätzer für 6 min mit 50 sccm Ar, 25 sccm CF 4, und 50 sccm von CHF 3 floFlügel bei einem Druck von 75 mTorr.
  9. Ätzen der Silizium in einem ICP-Deep-Trench-reaktiven Ionenätzer für 2 min mit 63 sccm C 4 F 8, 27 sccm SF &sub6;, 40 sccm Ar und 10 sccm O 2 bei einem Druck von 14 mTorr fließt.
  10. Spülen in Aceton, Methanol und Isopropanol zu entfernen, widerstehen.
  11. In ein Bad aus H 2 SO 4: H 2 O 2 1:1 für 10 min, um die Oberfläche zu reinigen.
  12. Gründlich mit Reinstwasser DI-Wasser und trocken mit N 2 spülen.
  13. Abzuscheiden 1.080 Å von Al 2 O 3 durch Atomlagenabscheidung bei 250 º C

2. Herstellung von Poly (dimethylsiloxan) Rakel

  1. Wenn möglich, arbeiten in einem Reinraum. Ansonsten in der saubersten Umgebung möglich zu arbeiten.
  2. Besorgen Sie sich eine Kunststoff-Petrischale (oder andere saubere Einweg-Container) mit ≥ 13 mm Seiten.
  3. In diesem Gericht, gieße 5 g PDMS Härter, gefolgt von 50 g PDMS basE-Agent (oder irgendetwas mit einem Verhältnis von 1:10, die meist füllen wird die Petrischale). Mischen Sie gründlich mit einem Einweg-Kunststoff-Pipette oder Stange.
  4. Blasen entfernen, indem man die Misch PDMS in einer Kammer mit einer Vakuumleitung, Anlegen von Vakuum bis Blasen mehr aus Gemisch (ca. 30 min).
  5. Falls nicht bereits in der Petrischale gießen PDMS in Petrischalen, die Vermeidung Erzeugung von Luftblasen.
  6. Heilung über Nacht auf einer Heizplatte bei> 50 ° C (höhere Wärme für weniger Zeit geht auch).
  7. Mit neuen / sauberen Rasierklinge vorsichtig schneiden Sie ein rechteckiges Stück ca. 2,5 x 2,5 cm, halten Oberfläche so sauber wie möglich. Ziehen Sie mit einer sauberen Pinzette. Schneiden Sie eine Kante (bis 1,5 cm), indem Sie unten auf Rasierklinge in einer Bewegung, bis Oberkante so scharf wie möglich zu machen (dies wird der in der Rakelverfahren verwendet Kante sein).
  8. Reinigen mit Aceton, Methanol, Isopropylalkohol und Reinstwasser DI-Wasser, und dann föhnen mit sauberem Stickstoffgas. Bewahren Sie in einem sauberen Petrischale.

3. Herstellung von Vesikeln

  1. Sammeln Lipidstammlösungen von 25 mg / ml Ei-Phosphatidylcholin (PC) und 1 mg / ml 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-Phosphoethanolamin-N - (Lissamingrün Rhodamin B sulfonyl) Ammoniumsalz (Rho-DPPE) in Chloroform und eine 0,5 mg / ml Stammlösung von Monosialogangliosid GM1 in Chloroform / Methanol (2:1 v / v).
  2. In einem kleinen Glasfläschchen stellen eine Mischung, die 97 Mol-% PC führt, 2 mol% GM1 und 1 Mol-% DPPE-Rho durch Zugabe von 18,9 &mgr; l von 25 mg / ml PC, 39,6 ul 0,5 mg / ml GM1 und 7,9 ul 1 mg / ml Rho-DPPE mit Glasspritzen.
  3. Hinweis:. Das Zusatzmaterial für Nair et al 25 eine ausgezeichnete anpassbare Excel-Tabelle für die Berechnung der Mengen von Lipiden erforderlich, um Vesikel beliebiger Zusammensetzung erstellen, enthält.
  4. Zeigen Fläschchen im Vakuumtrockenschrank und das Lösemittel durch Verlassen der Ampulle unter Vakuum für 6 Stunden.
  5. Stellen einer wässrigen Lösung von 0,1M NaCl. 0,5 ml der 0,1 M NaCl-Lösung in das Fläschchen, das das getrocknete Lipidfilm.
  6. Lassen Sie die wässrigen Lipid-Mischung über Nacht ruhen.
  7. Vortexen mischen, um eine Vesikelsuspension schaffen, dann beschallen für 20 min in einem Ultraschallbad bei Raumtemperatur.
  8. Extrudieren der Vesikel Suspension durch eine Polycarbonatmembran mit 100 nm Porengröße. Übergeben Sie die Vesikelsuspension durch den Filter 17x.
  9. Speichern der extrudierten Vesikel in einem Glasfläschchen bei 4 ° C

4. Bildung von sphärischen Unterstützte Lipiddoppelschichten

  1. Sammeln Sie 700 nm Durchmesser SiO 2-Kugeln. Die Perlen werden in destilliertem Wasser mit einer Stammkonzentration von 1,4 x 10 11 Perlen / ml geliefert.
  2. In einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen bereiten eine 1 ml Partikelsuspension mit einer Konzentration von 1,5 x 10 10 Perlen / ml durch Zugabe von 107 ul Wulst Stammlösung auf 893 ul 0,1 M NaCl.
  3. Mischen Sie den Suspension, um sicherzustellen, es ist gut, mixen.
  4. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 1700 g für 20 min dann den Überstand verwerfen. Resuspendieren der Kügelchen in 1 ml 0,1 M NaCl. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal gründlich waschen die Perlen.
  5. Die SSLBs bilden, in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen werden 25 ul der SiO 2-Partikelsuspension zu 200 ul von 1 mg / ml Vesikel-Suspension. Vortex die Mischung und lassen Sie stehen für 1 h bei Raumtemperatur. In dieser Phase sollte die Konzentration SSLB 1,7 x 10 9 SSLBs / ml.
  6. Zentrifuge bei 1700 g für 20 min, um die SSLBs zu pelletieren. Das Pellet sollte rosa aufgrund der Ruptur der Vesikel mit Rho-DPPE auf den Perlen erscheinen.
  7. Verwerfen des Überstandes und Resuspension in 225 &mgr; l phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH = 7,4. Wiederholen Sie die Schritte 4,6-4,7 zwei weitere Male, um alle unruptured Vesikel von der SSLB Suspension zu entfernen.

5. Versammlung SSLB Array

  1. Cleave Wafer von Mikrowell-Arrays was in rechteckige Stücke mit 4-6 microwell Arrays pro Stück.
  2. Vortex mischen SSLB Aufhängung, dann legen 10 ul SSLB Suspension auf jede Mikroarrays. Lest Rest für 1 Stunde, damit SSLBs, an die Oberfläche zu begleichen.
  3. Waschen Sie vorsichtig die Mikrowell-Array-Chip mit PBS aus einer Waschflasche, dann in einem PBS-Bad in einer flachen Schale vorbereitet einzutauchen.
  4. Während untergetaucht ist, setzen die PDMS Rakel bündig auf dem Mikrowell-Array-Chip und ziehen Sie sie vorsichtig entlang der Oberfläche 5x bis SSLBs, die nicht in Mikro immobilisiert sind zu entfernen.
  5. Fassen Sie die Mikrowell-Array-Chip mit einer Pinzette und schütteln in der PBS-Bad, um überschüssige SSLBs entfernen.
  6. Schnelles Entfernen des Chips von der Rakel Bad und in ein frisches PBS-Bad bis zur weiteren Verwendung. Achten Sie darauf, die Oberfläche des Chips, um die nassen SSLBs erhalten bleibt.

Hinweis: Die oben beschriebene Montageverfahren kann verwendet werden, um Arrays von natürlichen Membran-Teilchen zu erzeugen, wie Myelin Partikel aus Maushirn oder pho isoliertspholipid Vesikel ohne die SiO 2-Träger Perle. Diese Arbeit wird im Detail in Wittenberg et al. 21 beschrieben und repräsentative Ergebnisse sind unten dargestellt.

6. Cholera Toxin-Bindungsassay

  1. Vorbereitung einer 2 mg / ml Lösung von Rinderserumalbumin (BSA) in PBS.
  2. Es wird eine Lösung mit der gewünschten Konzentration von Alexa 488-konjugierten Choleratoxin B-Untereinheit in PBS mit 2 mg / ml BSA.
  3. Entfernen Sie die SSLB-Array-Chip aus dem PBS-Bad und Docht meisten der PBS-Lösung entfernt mit einem Labor zu wischen. Lassen Sie gerade genug PBS auf dem Chip zu halten, der SSLB Array mit Feuchtigkeit versorgt.
  4. Um nichtspezifische Bindung zu verhindern, 200 ul 2 mg / ml BSA Lösung des SSLB Array-Chip. Ruhen lassen für 1 Stunde in einer feuchten Box.
  5. Mit einer Mikropipette entfernen 200 ul-Lösung von der Spitze der SSLB Array-Chips.
  6. In 200 ul von Choleratoxin Lösung des SSLB Array Chip und ruhen lassen für 1 Stunde in einer feuchten Box.
  7. Waschen Sie vorsichtig die SSLB-Array-Chip mit PBS aus einer Waschflasche um ungebundenes Cholera-Toxin zu entfernen.
  8. Wick überschüssige PBS mit einem Labor zu wischen. Vor Bildgebung Abdeckung Chip mit einem 24 mm x 40 mm Deckglas.
  9. Bild-Arrays mit einem aufrechten Mikroskop mit Filtersätze für die Fluorophore von Interesse angemessen.
  10. Analysieren Sie die Fluoreszenzintensität einzelner SSLBs in einem Array mit der automatisierten Partikelanalyse-Funktion von ImageJ Software.
  11. Kompilieren mittleren Fluoreszenzintensitäten von einzelnen SSLBs in Histogramme, die die Intensitäten der SSLBs auf einem bestimmten Array gefunden zusammenzufassen.

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Representative Results

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Wenn SiO 2-Kugeln werden mit einer Lösung von Vesikeln aus Phospholipiden, fluoreszierende Lipide und andere Lipide, wie Gangliosiden zusammen gemischt, reißen die Vesikel auf der SiO 2-Oberflächen SSLBs Wulst zu bilden, wie schematisch in Fig. 1a gezeigt. Nach dem Waschen der SSLBs wird ein Tropfen der Lösung SSLB auf einer Mikrowell-Array platziert, und die Perlen dürfen an der Oberfläche absetzen. (Fig. 1B1) Dies kann auch mit einer Suspension von Phospholipid-Vesikeln oder natürlichen Membranpartikel, die in Fig. 1b2 dargestellt sind, durchgeführt werden. Ein Fluoreszenzbild von Phospholipid-Vesikeln mit einem Mikrotiterplatten-Array-Substrats adsorbiert ist in Fig. 1b3 dargestellt. Dann wird die PDMS Rakel wird, um sanft über die Oberfläche gleiten, um alle SSLBs (Abbildung 1c1), Bläschen oder natürlichen Membranpartikeln (Abbildung 1c2), die nicht in Mikrovertiefungen hat begleichen zu entfernen. Dies führt zu einer SSLB Array, in dem jedesMikrotiterplatten höchstens eine SSLB (Fig. 1d1) oder eine Anordnung, in der mehrere Bläschen oder natürlichen Membran Teilchen in jeder Vertiefung (Fig. 1d2). Ein Bild von einem Mikroarray von fluoreszenzmarkierten Vesikeln besteht, ist in Figur 1D3 gezeigt ist.

Figur 1
.. Abbildung 1 Bildung SSLBs und SSLB Array-Anordnung (a) Illustration eines SSLB von 3 Arten von Lipiden auf einem SiO 2-Perle aus: Ei-PC (schwarz), Rho-DPPE (rot) und GM1 (blau). (B1-D1) Ablauf zur Montage einer Anordnung, die SSLB SSLBs auf einer Vertiefungsanordnung (b1) gestreut wird, die Verwendung eines PDMS Rakel auf die Oberfläche der SSLBs klar nicht in Vertiefungen (c1) abgewickelt, und die endgültige SSLB Array (d1 ). (B2-d2 (B3) ein Fluoreszenzbild von Phospholipid-Vesikel auf einen Mikrotiterplatten-Substrat entsprechend der Darstellung in (b2) adsorbiert. (D3) ein Fluoreszenzbild eines Mikroarrays von Phospholipid-Vesikeln entsprechend der Darstellung in (d2) besteht. Von Referenzen 20 und 21 angepasst und mit Genehmigung der American Chemical Society verwendet.

Individuelle SiO 2-Kugeln unterstützt für SSLBs in Mikro wurden mit Rasterelektronenmikroskopie (SEM) sowohl aus dem abgewinkelten Draufsicht und Querschnitts Perspektiven abgebildet. Eine Draufsicht auf eine Fläche von etwa 15 um x 15 um ist in Fig. 2a gezeigt, während Fig. 2b eine Querschnittsansicht von einem einzelnen Kügelchen in eine immobilisierteMikrowell. Die leichtere Schicht Beschichten der Mikrotiterplatten werden 100 nm Al 2 O 3 durch Atomlagenabscheidung abgeschieden, um die Melodie und Durchmesser, so dass die Vertiefungen in der Lage sind Aufnahme nur einzelne Kügelchen.

Figur 2
2. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von SSLB Arrays. (A) Eine elektronenmikroskopische Aufnahme einer 15 mm x 15 mm Fläche zeigt SSLB Wulst Träger in Mikrowell-Arrays immobilisiert sind. (B) Eine einzelne 700 nm Durchmesser SSLB in einer Mikrowell. Die Mikrowell-Beschichtung ist Al 2 O 3, das aufgebracht, um die Mikrowell schrumpfen, so dass nur einzelne Kügelchen im Inneren passen wird. Von Referenz 20 angepasst und mit Genehmigung der American Chemical Society verwendet.

Sobald die SSLB Arrays hergestellt werden, können sie durch Fluoreszenzmikroskopie abgebildet werden. 3b zeigt eine Fläche mit Mikrovertiefungen 550 und 416 SSLBs für eine Belegungsrate von 76%.

Sequentielle Abscheidung von verschiedenen Arten von SSLBs wurde verwendet, um Anordnungen mit mehr als einem Typ von SSLB, wobei die Identität der einzelnen SSLBs wurde durch das Fehlen oder Vorhandensein eines Toxin-Rezeptor (GM1) bestimmt, und seine Bindung von Choleratoxin (CTX) zu erstellen. Montageverfahren war das gleiche wie für eine einzelne Art, sondern SSLB wurde ein zweites Mal mit einer anderen Identität SSLB geführt. Die Ausgangskonzentration von SSLBs war 10-fach niedrigeren Belegung der ersten Art von SSLB zu reduzieren und damit mehr freie Stellen, die von der zweiten Art von SSLB besetzt werden. In den Figuren 3c-3e wird ein SSLB Anordnung mit zwei Arten von SSLBs gezeigt. All der SSLBs enthalten rote Fluoreszenz Rho-DPPE (3c), aber nur einige der SSLBs GM1 enthalten, ein Gangliosid, die den Rezeptor für das B-Untereinheit des ctx. Wenn sie grün fluoreszierenden Alexa 488-konjugierten CTx ausgesetzt werden nur die SSLBs enthaltend GM1 Fluoreszenz im grünen Kanal (Fig. 3d). Wenn die roten und grünen Bilder werden zusammengeführt, ist es möglich zu bestimmen, welche SSLBs enthalten GM1 (gelb) und die nicht (rot) (Fig. 3e).

Fig. 3
Abbildung 3. Fluoreszenz-Imaging von SSLB Arrays. (A) Ein 100 &mgr; m × 100 &mgr; m-Bereich, enthaltend 936 Rho-DPPE-markiertem Ei-PC SSLBs. (B) Ein Hellfeld-und Fluoreszenzüberlagerung, die eine SSLB mit 76% der Mikrovertiefungen besetzt. (Ce) Ein Array mit SSLB SSLBs, die Rho-DPPE enthalten(C) eine Fraktion davon enthalten GM1, das von Alexa-488-konjugierten CTx (d) gebunden ist. (E) Verschmelzung von roten und grünen Kanäle, wo colokalisiert Fluoreszenz zeigt die Anwesenheit von GM1 auf der SSLB. Die blauen Kreise zeigen SSLBs, die nur rot fluoreszieren, also fehlt GM1. Von Referenz 20 angepasst und mit Genehmigung der American Chemical Society verwendet.

Fluoreszenzdaten aus SSLB Arrays wurde durch Messen der Intensität der einzelnen SSLBs in einem Bild analysiert. Die SSLB Intensitätsdaten von Arrays wurden in Histogramme erstellt. 4a zeigt ein solches Histogramm aus der Analyse der Rho-DPPE Fluoreszenz von einem SSLB Array ausschließlich SSLBs enthält Ei-PC und 1 Mol-% DPPE-Rho besteht. Die Daten in Fig. 4a durch Analysieren des Bildes in 3a erfasst. Wir fanden die SSLB Arrays robust und stabil für mindestens eine Woche, wenn ein Kühlnd in Puffer eingetaucht. Die Arrays fanden keine Fluoreszenzintensität zu verlieren, noch die Belegung der Felder im Laufe von einer Woche (Abbildung 4b) zu ändern.

Fig. 4
4. (A) Das Histogramm zeigt die Verteilung der Fluoreszenzintensitäten für die in Fig. 3a gezeigt SSLB Array. Die Durchschnittsintensität für jeden SSLB in der Anordnung verwendet, um das Histogramm zu erstellen. Die durchgezogene Linie ist eine Gaußsche Anpassung an die Daten. (B) Mittlere Reihe Belegung (schwarze Kreise) und Fluoreszenzintensität (rote Quadrate) für eine SSLB Array im Laufe von einer Woche überwacht. Von Referenz 20 angepasst und mit Genehmigung der American Chemical Society verwendet.

Wir haben Anordnungen von SSLBs zusammen mit verschiedenen Konzentrationen von GM &sub1; (0, 0,5, 1 and 2 mol%) und setzte sie auf einen festen Konzentration von CTx sowie Arrays mit SSLBs mit Konzentrationen von GM1 und setzten sie unterschiedlichen Konzentrationen von CTx. Das Experiment wurde später verwendet, um die Gleichgewichts-Dissoziationskonstante (Kd) für GM1/CTx Bindung zu bestimmen. Die SSLB Arrays mit unterschiedlichen GM1-Konzentration wurden zu 50 nM Alexa-488 markierten CTx für 1 Stunde dann gewaschen und abgebildet ausgesetzt. Die Intensitätshistogramme für SSLB Arrays mit 0,5 bis 2 Mol-% GM1 bis 50 nM Alexa 488-konjugierten CTx belichtet man in Fig. 5a ersichtlich, Fig. 5b zeigt die lineare Abhängigkeit der mittleren Fluoreszenzintensität auf GM1-Konzentration.. Die Bindungsreaktion, wenn die Konzentration des GM1 in SSLBs auf 2 Mol-% festgelegt und die SSLB Arrays zu CTx Bereich von 16 pM bis 158 nM ausgesetzt folgt sigmoidale Kurven, wie in Fig. 5c dargestellt. Die Kurven fit zu diesen Daten werden auf zwei verschiedene Bindungsmodelle auf Basis: die Langmuir-Isotherme (Gleichung 1) und der Hill-Modus Waudl (Gleichung 2). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Gleichung 1 (1)

Gleichung 2 (2)

Wobei F die Fluoreszenzintensität bei einer gegebenen Konzentration CTx, F max die Fluoreszenzintensität bei der Bindung gesättigt ist, [CTx] ist die Konzentration CTx, K D und K H sind die Dissoziationskonstanten von Langmuir und Hill-Waud passt bzw. und n Kooperativität Koeffizienten in der Hill-Waud-Modell. Die Kooperativität Koeffizient (n) schätzt die Menge der multivalente Bindung, wobei ein n größer alszeigt an, dass ein jeder CTx-Molekül bindet mehr als eine GM1. Die Konzentration von CTx bei 0,5 x F max die K D oder K H für die GM1/CTx Interaktion. In unseren Experimenten haben wir berechnet einen K D von 1,6 ± 0,2 nM und K H von 1,4 ± 0,2 nM mit einem n-Wert von 1,3, was auf eine kooperative Bindung. Die Dissoziationskonstanten für die Wechselwirkung GM1/CTx variieren in der Literatur breit und reicht über 5 Grössenordnungen von 4,5 pM bis 370 nM 26,27.

Figur 5
5. CTx/GM1 Bindungsassays auf SSLB Arrays. (A) Histogramme der Fluoreszenzintensität der einzelnen SSLBs innerhalb SSLB Arrays. Die Anordnungen enthalten SSLBs mit 0,5, 1 oder 2 mol% GM1 und wurden zu 50 nM Alexa 488-konjugierten CTx ausgesetzt. Diegezogenen Linien sind Gauß passt. (B) Auftragung der Verteilungsmittel aus (a) als Funktion der GM1-Konzentration. (C) Bindungskurven, die die Verteilung Mittel von Arrays mit SSLBs mit 2 mol% GM1 nach Exposition mit Alexa-488-konjugierten CTx variierend von 16 pM bis 158 nM. Die Linien sind Anpassungen an die Langmuir-Isotherme (rot) und Hill-Waud (blau) Bindungsmodelle. Die Fehlerbalken in (bc) stellen die Standardabweichungen der Verteilungen der Fluoreszenzintensität, die jedem Datenpunkt. Von Referenz 20 angepasst und mit Genehmigung der American Chemical Society verwendet.

Wie bereits erwähnt, ist es auch möglich, Arrays mit Biomembran Material aus natürlichen Quellen stamm 21 bilden. Die Arrays werden in der gleichen Weise gebildet, durch Dispergieren Membran Teilchen auf einem Mikrowell-Substrat, dann die Reinigung der Oberfläche mit der Rakel hinter Membranpartikel in das Mikrofon zu verlassenRowells. Abbildung 6 zeigt Beispiele von Myelin und neuronalen Lipid Raft-Mikroarrays. In 6a sind Myelin Teilchen mit dem lipophilen Fluorophor FM1-43 bezeichnet. Lipidflößen ist bekannt, Cholesterin und Ganglioside wie GM1 angereichert werden; Somit Alexa 488-konjugierten CTx bindet stark an Lipidfloß-Mikroarrays, wie in Fig. 6b gezeigt, während fluoreszierend markiertem Streptavidin (SAPE) nicht auf dem Array binden. (6c) Wir haben auch Streifen Arrays erstellt durch die Bereitstellung von Myelin und Lipid Raft Partikel auf die Mikrowell-Substrat mit einem Mikrofluidik-Chip mit 250 um breiten Kanälen. Nach Partikel Lieferung, wurde die Mikrofluid-Chip aus der Mikrowell-Substrat abgelöst und die Rakel-Prozess durchgeführt, wie üblich. Die Streifenanordnungen wurden dann mit einem fluoreszierenden Anti-Oligodendrozyten-IgM-Antikörper (IgM O4), das Sulfatid in Myelin bindet gefunden ausgesetzt. (Abbildung 7) Das Myelin und Lipid Raft Streifen-Microarrays in Fig. 7 sind in zunehmenden Vergrößerung dargestellt, und auf dem höchsten Niveau der Vergrößerung ist es leicht ersichtlich, dass O4 IgM bindet nur an den Myelin-Mikroarrays, weil Sulfatid fehlt den Lipidflößen.

Fig. 6
Abbildung 6. Myelin Partikel und neuronalen Lipid Raft Partikel-Arrays. (A) eine Partikel Myelin-Mikroarray, wo die Myelin Partikel durch die lipophile Fluoreszenz Fluorophor FM1-43 gemacht. Die gestrichelte Linie zeigt den Rand des Feldbereich. (B) Lipid-Mikroarray, das Floß CTx Bindung an die Lipidpartikel Floß. (C) Lipid Raft-Mikroarray zu fluoreszierenden Streptavidin-Phycoerythrin (SAPE), die wenig bis gar keine unspezifische Bindung ausgesetzt. Von Referenz 21 angepasst und mit Genehmigung der American Chemical Socfalt.

Fig. 7
Abbildung 7. Mehrkomponenten-Arrays von Mikrofluid-Lieferung von Myelin und neuronalen Floß Membranen gebildet. (A) Fluoreszenzbild nach Myelin und Flöße wurden über mikrofluidische Kanäle auf dem Microarray-Substrat abgeschieden. Die linken und rechten Streifen enthalten Myelin und der Mittelstreifen enthält Floß neuronalen Membranen. Die Membranen werden mit FM1-43, die alle Lipidmaterial Etiketten gefärbt. Der Maßstab beträgt 250 um. (B) Fluoreszenzbild die gleichen drei Streifen nach der Anwendung des PDMS Rakel und Inkubation mit IgM O4. Der Maßstab beträgt 250 um. (CE) vergrößerte Bilder von den drei Streifen zeigt, daß IgM O4 bindet nur an den Myelin-Microarrays: (c) Reststreifen und (e) rechte Streifen. Die Maßstabsbalken in panels ce 30 um. Von Referenz 21 angepasst und mit Genehmigung der American Chemical Society verwendet.

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Discussion

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In dieser Arbeit wird gezeigt, dass monodisperse SiO 2-Kugeln mit unterstützten Lipiddoppelschichten überzogen werden können, ohne die Notwendigkeit von Zielliganden auf den Lipid-Doppelschichten und der Substratoberfläche in Mikrotiterplatten Arrays angeordnet werden, und die Anordnungen können zur Charakterisierung von Toxin-Lipid-Wechselwirkungen verwendet werden. Die Dissoziationskonstante wir CTx/GM1 Bindung berechnet vergleicht vorteilhaft, da die großen Unterschiede der Werte in der Literatur, mit einem früheren Bericht von Winter et al., Wobei kolloidale Anordnung von Lipid-beschichteten Kügelchen wurde eine Dissoziationskonstante von etwa berechnen 30 nM. Durch die Anpassung der Daten an die Hill-Waud Bindungsmodell haben wir festgestellt, dass die CTx/GM1 Interaktion ist wahrscheinlich multivalenten, die mit früheren Berichten 28 stimmt zu. Die B (Gangliosidbindung) Untereinheit von CTx existiert als Pentamer, die mit jedem der fünf Einheiten zur Bindung eines Moleküls GM1 29; somit ist es nicht verwunderlich, dass mehr als eine Untereinheit gebundenes gegeben werden den Unterschiedusive Mobilität von GM1 in SLBs 30.

Arrays von chemisch funktionalisierte Kügelchen wurden in anderen analytischen Studien 31 verwendet worden. Bei diesen Arten von Experimenten werden typischerweise in Mikrokügelchen in dem Ende der geätzten optischen Fasern geschaffen immobilisiert. Multiplex-Fluoreszenz-Assays kann in dieser Konfiguration durch Mischen von Subpopulationen von Kügelchen und gleichzeitig immobilisiert sie auf das Ende der optischen Faser 32 durchgeführt werden. In unserem Multiplex-Assays (3c-3e), sequentiell immobilisiert wir optisch codierten SSLBs weil Lipide auf SSLBs frei in Lösung könnte von einer Art zu einer anderen SSLB 33 übertragen werden. Während dies fügt zusätzliche Schritte bei der Herstellung des Arrays SSLB es nicht übermäßig zeitaufwendig und ist die effizienteste Vorgehensweise für die Lipid-funktionalisierten Kügelchen. Wir haben auch räumlich codierten Arrays durch Aufbringen von unterschiedlichen Populationen SSLB in benachbarten Mikrovertiefungsanordnungen, und es gibt keine beobachtbare Cross Sprechen zwischen den Arrays 20. Um Probenvorbereitungszeiten zu reduzieren, können SSLB Arrays im Voraus vorbereitet und auf Wunsch verwendet werden. Wir testeten die Stabilität des Arrays innerhalb einer Woche und fand keine signifikante Verschlechterung der Anordnungen in Bezug auf die Fluoreszenzintensität, die anzeigt, daß die Menge des Lipidmaterials auf den SSLBs nicht mit der Zeit ändern. Auch dann, wenn das Array Belegung über die Zeit nicht ändern, was suggeriert, dass, sobald SSLBs immobilisiert werden, werden sie nicht von den Kavitäten (Abbildung 4b) zu lösen.

Neben den Perlen mit synthetischen Lipiddoppelschichten überzogen, haben wir auch diese Methode verwendet, um Arrays von natürlichen Membranpartikeln 21 erstellen. In dieser Arbeit haben wir immobilisiert Myelin Teilchen, wie Lipidfloß Fraktion aus Mäusehirn sowie neuronalen Membran Teilchen abgeleitet. Wir waren in der Lage, die Arrays zu verwenden, um Zell-spezifische Membran-Oberfläche Moleküle, die durch Antikörper Bindi identifizierenng (6 und 7). Weiterhin wird, wenn die Größe der Mikrovertiefungen auf der Nanometerskala und der oberen Oberfläche des Arrays verringert wurde mit Gold beschichtet waren wir in der Lage, Oberflächenplasmonresonanz ohne die Verwendung von fluoreszierenden Markierungen zu verwenden, um zu überwachen Bindung der Antikörper an Myelin Membranpartikel. Der Hauptunterschied zwischen der Verwendung SSLB und Vesikel oder natürlichen Membranpartikel-Arrays zu bilden, ist, dass im Fall von SSLBs die genaue Menge an Membranmaterial in jeder Vertiefung ist bekannt, weil nur ein einzelnes Kügelchen können in jeder Vertiefung zu passen. Mit Bläschen oder natürlichen Membranpartikeln, gibt es keine Möglichkeit, die Menge an Material in jedem Mikrowell, andere als die Ausgangskonzentration von Vesikeln oder Teilchen einzustellen steuern. Jedoch ist die wohl gut Variabilität der Anzahl der Bläschen nicht sehr groß im Vergleich zu der Verteilung der Vesikel Durchmesser 21.

Schließlich kann dieses Verfahren haben divERSE zukünftige Anwendungen. Junesch und Mitarbeiter haben eine Rakel verwendet, um Nanopartikel während kolloidale Lithographie Nanofabrikation 34 zu entfernen. Membrananordnungen können gebildet werden, um Zell-Zell-Kontakte zu imitieren, um zelluläre focal adhesion 35 sucht oder überprüft die Bindung der Membrankrümmung Fühl Proteine ​​36. Darüber hinaus würde die Verwendung von porösen Kügelchen die Aufnahme von Transmembranproteinen in die Lipid-Doppelschichten 37 oder die lokale Übermittlung der gespeicherten Ladung auf Zellen in einer Biomembran-Array-Substrat kultiviert erleichtern. Die Mikrowell-Plattform wird durch Photolithographie, die für die Design-Flexibilität ermöglicht hergestellt. Hier unsere Arrays hexagonale Geometrie, aber quadratisch, linear oder anderen Geometrien können mit unterschiedlicher Periodizität Array und Mikrowell-Dimensionen, die räumlichen Auswirkungen der focal adhesion untersuchen erstellt werden.

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Disclosures

Die Autoren haben keine finanziellen Interessen im Wettbewerb offen zu legen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse an SHO von den National Institutes of Health (R01 GM092993) unterstützt, der National Science Foundation (NSF Career Award und DBI 0964216), dem Office of Naval Research (ONR) Young Investigator Programm und die Minnesota Partnership Award für Biotechnologie und Medical Genomics. Geräte-Fertigung wurde an der Universität von Minnesota und Nanofabrikation Center (NFC), die Unterstützung von der NSF durch die National Nanotechnology Infrastructure Netzwerk empfängt. Diese Arbeit wurde auch durch Zuschüsse zu MR von den National Institutes of Health (NS048357, R21 NS073684), der National Multiple Sclerosis Society (CA1060A11), der Applebaum, Hilton, Peterson und Sanford Stiftungen und der Familie McNeilus unterstützt. Die Autoren möchten Hyungsoon Im für die Unterstützung bei Abbildungen und Shailabh Kumar für die Unterstützung bei der Rasterelektronenmikroskopie danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4 inch silicon wafers University Wafer 425
Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist MicroChem SPR955-CM
Shipley MICROPOSIT CD-26 developer MicroChem CD-26
i-line stepper Canon 2500 i3 stepper
Vision 320 reactive ion etcher Advanced Vacuum Vision 320 RIE
Deep trench reactive ion etcher Plasma Therm SLR-770
Atomic layer depostion system Cambridge NanoTech Savannah
Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Egg phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 840051C
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt Avanti Polar Lipids 810158C
Monosialoganglioside GM1 Avanti Polar Lipids 860065P
Silica beads Bangs Laboratories SS03N/4666 Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter.
Cholera toxin B-subunit, Alexa 488-conjugate Molecular Probes C-34775
Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate R&D Systems NL1326R
FM1-43 Molecular Probes T-3136
Eppendorf MiniSpin centrifuge Fisher Scientific 05-401-09

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Bildung Biomembrane Microarrays mit einem Rakel-basierten Montageverfahren
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Wittenberg, N. J., Johnson, T. W., Jordan, L. R., Xu, X., Warrington, A. E., Rodriguez, M., Oh, S. H. Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method. J. Vis. Exp. (87), e51501, doi:10.3791/51501 (2014).More

Wittenberg, N. J., Johnson, T. W., Jordan, L. R., Xu, X., Warrington, A. E., Rodriguez, M., Oh, S. H. Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method. J. Vis. Exp. (87), e51501, doi:10.3791/51501 (2014).

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