Формирование биомембрана Microarrays с Ракель основе метода Ассамблеи
Summary
Поддерживаемые липидных бислоев и природные частицы мембран являются удобными системы, которые можно аппроксимировать свойства клеточных мембран и быть включены в различных аналитических стратегий. Здесь мы показываем, способ получения микрочипов, состоящие из поддерживаемых липидных двухслойных покрытием SiO 2 бусины, фосфолипидов пузырьков или природных частицы оболочки.
Abstract
Липидного бислоя мембраны образуют плазменные мембраны клеток и определить границы субклеточных органелл. В природе эти мембраны гетерогенные смеси многих видов липидов, содержат мембраной белков и оформлены с углеводами. В некоторых экспериментах, желательно, чтобы отделить биофизических или биохимические свойства липидный бислой от тех природного мембраны. Такие случаи требуют использования модельных систем, таких как гигантские пузырьки, липосомы или поддерживаемых липидного бислоя (SLBS). Массивы SLBS особенно привлекательны для зондирования и подражая межклеточные взаимодействия. Здесь мы опишем новый способ формирования массивов SLB. Субмикронного диаметра SiO 2 гранулы сначала покрывают липидных бислоев с образованием сферических SLBS (SSLBs). Затем гранулы хранение в массив микролунок субмикронного диаметра микро-сфабрикованы. Методика подготовки использует "швабру" для очистки поверхности подложки, в то время оставляешьг за SSLBs, которые поселились в лунки. Этот метод не требует химической модификации микропланшетным субстрата, ни особых таргетинга лигандов на SSLB. Микролунки занимают отдельных шариков, поскольку диаметр хорошо настроен, чтобы быть просто больше, чем диаметр шарика. Как правило, более 75% скважин заняты, а остальные остаются пустыми. В буфере массивы SSLB отображения долгосрочную стабильность больше, чем за одну неделю. Несколько типов SSLBs могут быть размещены в одном массиве по последовательным осаждением, и массивы могут быть использованы для зондирования, который мы показали, характеризуя взаимодействие холерного токсина с ганглиозидов GM1. Показано также, что фосфолипидов пузырьки без бортов опор и биомембран от клеточных источников может быть облечена с тем же методом и клеточно-специфические липиды мембран могут быть идентифицированы.
Introduction
Липидов двухслойные мембраны являются важными структуры в природе. Сотовый плазменные мембраны и органелл мембраны состоят из липидного бислоя, которые включают ряд молекул, которые необходимы для жизни. Многие процессы поддержания жизни происходить на поверхности клеток или опосредованы молекул, ассоциированных с липид-двухслойных мембран. В самом деле, многие фармацевтические препараты целевые процессы или молекулы находятся на или в мембранах 1,2. Поэтому необходимо, чтобы аналитически исследовать процессы, такие, как химические реакции или нековалентными обязательных событий, которые происходят на поверхности мембраны. Потому что природные мембраны может быть трудно изолировать и / или интерфейс с датчиками, многие исследователи используют упрощенные модели мембраны проводить аналитические исследования. Ряд модельных мембранных систем описаны в литературе, начиная от гигантских везикул, которые могут быть от десятков до сотен микрон в диаметре до липосом с наноразмерными размеры 3,4. Alternнительно, плоский бислоев, нанесенные на твердых подложках, то есть поддерживается бислоев (SLBS), может быть сформирован на нескольких различных поверхностей и были широко использованы в биофизических, биохимических и аналитических приложений 5. Соединительная SLBS с электрическими или оптическими материалов позволяет исследовать мембранной биохимии и биофизики с использованием различных аналитических методик. Флуоресцентная микроскопия 6, электрохимии 7, оптическая спектроскопия 8, сканирующей зондовой микроскопии 9, поверхностного плазмонного резонанса 10, и масс-спектрометрии 11 все были использованы для изучения структуры и свойств SLBS.
Массивы SLB обеспечивают дополнительную гибкость при проектировании датчиков для мультиплексов анализов 12,13. Другие приложения используют массивы SLB, чтобы имитировать переход, который формирует между иммунными клетками 14. Методы обработки для массивов SLB менялись от microfluIDic подходы 15 тем, которые используют физические барьеры между соседними пятнами SLB. 16 Другие группы использовали методы печати 17, фотохимический рисунка 18 и различные наноинженерии приближается 19 для создания массивов SLB.
В данной работе и сопровождающей видео мы продемонстрируем способ формирования массивов SLB путем сдачи на хранение SLB-покрытием SiO 2 шарики в упорядоченных массивов лунок 20. Мы ссылаемся на SLB-покрытых SiO 2 шариков в виде сферических поддерживаемых липидного бислоя (SSLBs). Этот метод является расширением предыдущей работы, который создал массивы фосфолипидных везикул и биомембран, полученных из природных источников 21, из которого мы также показывают примеры результатов. Другие способы выстроив частицы биомембрана или везикулы полагались на моделях конкретных, ориентированных на лигандов на поверхности, которые связывают с дополнительными лигандами, содержащихся на поверхности пузырьков. Примеры включают биотин-авидин ассоциация 22,23 и гибридизации ДНК схемы 24. Наш подход требует только массив микролуночные без каких-либо таргетинга или распознавания фрагментов, необходимых. Размер SSLBs определяется диаметром SiO 2 бортовых опор, которые имеют низкую поли-дисперсность. Настраивая диаметр микролуночные просто больше, чем диаметр SSLB, только один SSLB оседает в каждую микролунку. Поли (диметилсилоксан) (PDMS) скребок затем удаляет с поверхности все SSLBs, которые не иммобилизованных в лунках. Микролунки и полученные массивы SSLB имеют высокую плотность (~ 10 5 SSLBs / мм 2) с 3 мкм от центра до центра расстояние и гексагональной периодичности. По серийно нанесения SSLBs с различными составами липидов, можно создать многокомпонентных массивов с случайно расположенных SSLBs. Чтобы продемонстрировать зондирования возможности массивов SSLB, мы использовали взаимодействие холерного токсина (CTX) с ганглиозида (GM1) включенного в SSLBs. Сприродные частицы мембран, мы смогли обнаружить клеточные специфические липиды в многокомпонентных массивов, содержащих мембранный материал из двух различных типов клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой работе показано, что монодисперсные SiO 2 шариков, покрытых поддерживаемых липидных бислоев могут быть выстроены в микротитровальных массивов без необходимости ориентации лигандов на липидных бислоев или поверхности подложки, и массивы могут быть использованы для определ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами шо от Национальных Институтов Здоровья (R01 GM092993), Национальный научный фонд (NSF КАРЬЕРА премии и DBI 0964216), Управление военно-морских исследований (ОНР) для молодых следователь Программа и премии Миннесота Партнерство для биотехнологии и медицинские геномики. Изготовление устройства была выполнена в университет Миннесоты Nanofabrication центра (NFC), которая получает поддержку от NSF через инфраструктурной сети Национальный Nanotechnology. Эта работа также была поддержана грантами в MR от Национальных Институтов Здоровья (NS048357, R21 NS073684), Национального общества рассеянного склероза (CA1060A11), Эпплбаум, Hilton, Петерсон и Sanford фондов и семьи McNeilus. Авторы хотели бы поблагодарить Hyungsoon Im для помощи с иллюстрациями и Shailabh Кумар об оказании помощи сканирующей электронной микроскопии.
Materials
| 4-inch silicon wafers | University Wafer | 425 | |
| Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist | MicroChem | SPR955-CM | |
| Shipley MICROPOSIT CD-26 developer | MicroChem | CD-26 | |
| i-line stepper | Canon | 2500 i3 stepper | |
| Vision 320 reactive ion etcher | Advanced Vacuum | Vision 320 RIE | |
| Deep trench reactive ion etcher | Plasma Therm | SLR-770 | |
| Atomic layer depostion system | Cambridge NanoTech | Savannah | |
| Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| egg phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt | Avanti Polar Lipids | 810158C | |
| monosialoganglioside GM1 | Avanti Polar Lipids | 860065P | |
| Silica beads | Bangs Laboratories | SS03N/4666 | Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter. |
| Cholera toxin B-subunit, Alexa 488 conjugate | Molecular Probes | C-34775 | |
| Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate | R&D Systems | NL1326R | |
| FM1-43 | Molecular Probes | T-3136 | |
| Eppendorf MiniSpin centrifuge | Fisher Scientific | 05-401-09 |
References
- Drews, J. Drug discovery: A Historical Perspective. Science. 287 (5460), 1960-1964 (1126).
- Cooper, M. A. Advances in Membrane Receptor Screening and Analysis. J. Mol. Recognit. 17 (4), 286-315 (2004).
- Voskuhl, J., Ravoo, B. J. Molecular Recognition of Bilayer Besicles. Chem. Soc. Rev. 38 (2), 495-505 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (1002).
- Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid Supported Lipid Bilayers: From Biophysical Studies to Sensor Design. Surf. Sci. Rep. 61 (10), 429-444 (2006).
- Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early Steps of Supported Bilayer Formation Probed by Single Vesicle Fluorescence Assays. Biophys. J. 83 (6), 3371-3379 (2002).
- Krysinski, P., Zebrowska, A., Michota, A., Bukowska, J., Becucci, L., Moncelli, M. R. Tethered Mono- and Bilayer Lipid Membranes on Au and Hg. Langmuir. 17 (13), 3852-3857 (2001).
- Li, L., Wang, H. F., Cheng, J. X. Quantitative Coherent anti-Stokes Raman Scattering Imaging of Lipid Distribution in Coexisting Domains. Biophys. J. 89 (5), 3480-3490 (2005).
- Richter, R. P., Brisson, A. R. Following the Formation of Supported Lipid Bilayers on Mica: A Study Combining AFM, QCM-D, and Ellipsometry. Biophys. J. 88 (5), 3422-3433 (2005).
- Dahlin, A., Zäch, M., Rindzevicius, T., Käll, M., Sutherland, D. S., Höök, F. Localized Surface Plasmon Resonance Sensing of Lipid-Membrane-Mediated Biorecognition Events. J. Am. Chem. Soc. 127 (14), 5043-5048 (2005).
- Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. Phase Separation of Lipid Membranes Analyzed with High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry. Science. 313 (5795), 1948-1951 (2006).
- Groves, J. T., Boxer, S. G. Micropattern Formation in Supported Lipid Membranes. Acc. Chem. Res. 35 (3), 149-157 (2002).
- Bally, M., Bailey, K., Sugihara, K., Grieshaber, D., Vörös, J., Stadler, B. Liposome and Lipid Bilayer Arrays Towards Biosensing Applications. Small. 6 (22), 2481-2497 (2010).
- Groves, J. T., Dustin, M. L. Supported Planar Bilayers in Studies on Immune Cell Adhesion and Communication. J. Immunol. Methods. 278 (1-2), 19-32 .
- Yang, T. L., Jung, S. Y., Mao, H. B., Cremer, P. S. Fabrication of Phospholipid Bilayer-Coated Microchannels for On-Chip Immunoassays. Anal. Chem. 73 (2), 165-169 (2001).
- Groves, J. T., Ulman, N., Boxer, S. G. Micropatterning Fluid Lipid Bilayers on Solid Supports. Science. 275 (5300), 651-653 (1997).
- Hovis, J. S., Boxer, S. G. Patterning and Composition Arrays of Supported Lipid Bilayers by Microcontact Printing. Langmuir. 17 (11), 3400-3405 (2001).
- Yee, C. K., Amweg, M. L., Parikh, A. N. Direct Photochemical Patterning and Refunctionalization of Supported Phospholipid Bilayers. J. Am. Chem. Soc. 126 (43), 13962-13972 (2004).
- Kelly, C. V., Craighead, H. G. Nanofabrication for the Analysis and Manipulation of Membranes. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1356-1366 (2012).
- Wittenberg, N. J., Johnson, T. W., Oh, S. H. High-Density Arrays of Submicron Spherical Supported Lipid Bilayers. Anal. Chem. 84 (19), 8207-8213 (2012).
- Wittenberg, N. J., et al. Facile Assembly of Micro- and Nanoarrays for Sensing with Natural Cell Membranes. ACS Nano. 5 (9), 7555-7564 (2011).
- Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels. Angew. Chem. Int. Ed. 42 (45), 5580-5583 (2003).
- Kalyankar, N. D., et al. Arraying of Intact Liposomes into Chemically Functionalized Microwells. Langmuir. 22 (12), 5403-5411 (2006).
- Dahlin, A. B., Jonsson, M. P., Höök, F. Specific Self-Assembly of Single Lipid Vesicles in Nanoplasmonic Apertures in Gold. Adv. Mater. 20 (8), 1436-1442 (2008).
- Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using Patterned Supported Lipid Membranes to Investigate the Role of Receptor Organization in Intercellular Signaling. Nat. Protoc. 6 (4), 523-539 (2011).
- Kuziemko, G. M., Stroh, M., Stevens, R. C. Cholera Toxin Binding Affinity and Specificity for Gangliosides Determined by Surface Plasmon Resonance. Biochemistry. 35 (20), 6375-6384 (1996).
- Moran-Mirabal, J. M., Edel, J. B., Meyer, G. D., Throckmorton, D., Singh, A. K., Craighead, H. G. Micrometer-Sized Supported Lipid Bilayer Arrays for Bacterial Toxin Binding Studies Through Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Biophys. J. 89 (1), 296-305 (2005).
- Shi, J. J., Yang, T. L., Kataoka, S., Zhang, Y. J., Diaz, A. J., Cremer, P. S. GM1 Clustering Inhibits Cholera Toxin Binding in Supported Phospholipid Membranes. J. Am. Chem. Soc. 129 (18), 5954-5961 (2007).
- Gill, D. M. The Arrangement of Subunits in Cholera Toxin. Biochemistry. 15 (6), 1242-1248 (1021).
- Weng, K. C., Kanter, J. L., Robinson, W. H., Frank, C. W. Fluid Supported Lipid Bilayers Containing Monosialoganglioside GM1: A QCM-D and FRAP study. Colloid Surface B. 50 (1), 76-84 (1016).
- Walt, D. R. Fibre Optic Microarrays. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 38-50 (2010).
- Bake, K. D., Walt, D. R. Multiplexed Spectroscopic Detections. Annu. Rev. Anal. Chem. 1 (1), 515-547 (2008).
- Kundu, J., Levin, C. S., Halas, N. J. Real-Time Monitoring of Lipid Transfer Between Vesicles and Hybrid Bilayers on Au Nanoshells Using Surface Enhanced Raman Scattering (SERS). Nanoscale. 1 (1), 114-117 (2009).
- Junesch, J., Sannomiya, T., Dahlin, A. B. Optical Properties of Nanohole Arrays in Metal-Dielectric Double Films Prepared by Mask-on-Metal Colloidal Lithography. ACS Nano. 6 (11), 10405-10415 (2012).
- Wu, M., Holowka, D., Craighead, H. G., Baird, B. Visualization of Plasma Membrane Compartmentalization with Patterned Lipid Bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (38), 13798-13803 (2004).
- Hatzakis, N. S., Bhatia, V. K., Larsen, J., Madsen, K. L., Bolinger, P. Y., Kunding, A. H., Castillo, J., Gether, U., Hedegard, P., Stamou, D. How Curved Membranes Recruit Amphipathic Helices and Protein Anchoring Motifs. Nat. Chem. Biol. 5 (11), 835-841 (2009).
- Roizard, S., Danelon, C., Hassaine, G., Piguett, J., Schulze, K., Hovius, R., Tampe, R., Vogel, H. Activation of G-Protein-Coupled Receptors in Cell-Derived Plasma Membranes Supported on Porous Beads. J. Am. Chem. Soc. 133 (42), 16868-16874 (2011).
