Summary
Desteklenen ikili lipid tabakalarıdır ve doğal zar parçacıkları hücre zarlarının özelliklerini yaklaşık ve analitik çeşitli stratejiler dahil edilmesi uygun sistemlerdir. Burada destekli lipid iki katmanlı kaplı SiO 2 boncuklar, fosfolipid vezikülleri ya da doğal zar parçacıklarının oluşan mikrodizileri hazırlanması için bir yöntemi göstermektedir.
Abstract
Lipid iki katmanlı membranlar hücrelerin plazma membranları formu ve hücre içi organellerin sınırlarını tanımlar. Doğada bu membranlar, lipidler, çok çeşitli heterojen karışımlarıdır zara bağlı proteinleri içeren ve karbonhidrat ile süslenmiştir. Bazı deneylerde, doğal membran olanlardan iki lipid tabakasının biyo-fiziksel ya da biyokimyasal özellikleri ayrılması için tercih edilir. Bu gibi durumlarda, dev vesiküller, lipozom ya da taşıyıcı lipid iki katmanlı (SLBS) gibi model sistemlerinin kullanımı gerektirir. SLBS Diziler uygulamaları algılamak ve hücre-hücre etkileşimleri taklit için özellikle çekicidir. Burada SLB dizileri oluşturmak için yeni bir yöntem tarif eder. Mikrondan daha küçük çaplı SiO 2 boncuk birinci küresel SLBS (SSLBs) oluşturmak için, lipid çift tabakaları ile kaplanmıştır. Boncuklar daha sonra mikro-fabrikasyon submikron çaplı mikro oyuk bir diziye yatırılır. Ayrılmayı ise hazırlama tekniği, alt-tabaka yüzeyini temizlemek için bir "sileceği" kullanmaktadırmikro oyuk içine yerleşmiş SSLBs arkasında g. Bu yöntem, mikro alt-tabakanın herhangi bir kimyasal modifikasyonu, ne de SSLB üzerinde herhangi bir hedefleme ligandı gerektirir. Kuyu çap tane çapı biraz daha büyük olmak için ayarlanmıştır çünkü Mikrodelikler tek boncuk tarafından işgal edilmiştir. Geri kalan boş kalır Tipik olarak, kuyuların daha fazla% 75, işgal edilmiştir. Tamponda SSLB diziler daha büyük bir haftadan uzun süreli stabilite gösterir. Biz gangliosid GM1 ile kolera toksini etkileşimlerini karakterize ile göstermek ki, SSLBs çok tip seri biriktirme ile tek bir dizi yerleştirilebilir ve bu diziler tespiti için de kullanılabilir. Ayrıca, hücresel kaynaklardan elde edilen boncuk destek ve biyomembranlarda olmayan fosfolipid vesiküller aynı yöntemle dizilmiş olabilir ve hücreye özel membran lipidleri tespit edilebileceğini göstermektedir.
Introduction
Lipid iki katmanlı membranlar doğada temel yapılardır. Hücresel zarlar, plazma ve organel membranlar yaşam için gerekli olan moleküller, bir dizi dahil lipid ikili katmandan oluşmaktadır. Birçok yaşamı sürdürme işlemleri hücrelerinin yüzeyinde meydana veya lipit iki katmanlı membran ile ilişkili moleküller aracılık eder. Aslında, birçok ilaç hedef işlemler veya moleküller 1,2 veya zarlarında bulunmaktadır. Bu tür zar analitik yüzeylerinde meydana gelen kimyasal reaksiyonlar veya kovalent olmayan bağlanma olaylar gibi süreçleri araştırılması gereklidir. Doğal membranlar sensörleri ile izole ve / veya arayüz zor olabilir çünkü, birçok araştırmacı, analitik çalışmaları yürütmek için basitleştirilmiş bir model zarları kullanır. Model membran sistemleri bir dizi nano boyutta 3,4 ile lipozomlara çapı mikron On ila yüzlerce olabilir dev veziküllerden kadar, literatürde tarif edilmiştir. Alternrin, katı destekler üzerinde biriken düzlemsel lipid çift, yani ikili lipid tabakalarıdır (SLBS), farklı yüzeylerin bir dizi oluşturulabilir ve yaygın olarak, biyo-fiziksel biyokimyasal ve analitik uygulamalarda 5 kullanılmaktadır desteklenir. Elektrik ya da optik malzeme ile birleştirilmesi SLBS farklı analitik tekniklerin kullanılması ile membran biyokimya ve biyofiziğin soruşturma sağlar. Floresan mikroskopi 6, elektrokimya 7, optik spektroskopi 8, taramalı prob mikroskopisi 9, yüzey plazmon rezonans 10 ve kütle spektrometresi 11 tüm SLBS yapısını ve özelliklerini incelemek için istihdam edilmiştir.
SLB diziler multipleks 12,13 deneyleri için sensörler tasarımında ek bir esneklik sunar. Diğer uygulamalar bağışıklık hücrelerinin 14 arasında oluşan kavşak taklit etmek SLB diziler kullanın. SLB diziler için hazırlama yöntemleri microflu arasında değişmesineidic bitişik SLB yamalar arasındaki fiziksel engelleri istihdam olanlar için 15 yaklaşır. 16. Diğer gruplar baskı yöntemleri 17 kullandım, fotokimyasal desenlendirme 18 ve çeşitli nanoengineering SLB diziler oluşturmak için 19 yaklaşır.
Bu kağıt ve ekteki videoda mikro oyuk 20'nin sıralı diziler halinde SLB-kaplanmış boncuklar SiO 2 biriktirilmesiyle SLB dizileri oluşturmak için bir yöntem ortaya koymaktadır. Biz küresel desteklenen lipit tabakalarının (SSLBs) olarak SLB kaplı SiO 2 boncuklar bakın. Bu teknik, aynı zamanda, örneğin sonuçları göstermektedir başka doğal kaynaklardan 21, elde edilen fosfolipid vezikülleri ve biyomembranlarda dizileri oluşturulan önceki işin bir uzantısıdır. Biyomembran tanecikleri veya veziküller arraying için diğer yöntemler vesikül yüzeyi üzerinde bulunan tamamlayıcı bir ligand ile ortak yüzeyleri üzerinde belirli hedefleme ligandlarının kalıpları yararlanmıştır. Örnekleri arasında biyotin-içeriravidin dernek 22,23 ve DNA hibridizasyon şemaları 24. Bizim yaklaşım sadece gerekli hiçbir hedefleme veya tanıma kısımları ile bir mikro dizi gerektirir. SSLBs büyüklüğü düşük poli-disperitesineM sahip SiO 2 boncuk desteklerin, çapı ile tanımlanır. SSLB çapından biraz daha büyük için mikro çapını ayarlayarak, tek bir SSLB her kuyucuktan yerleşir. Bir poli (dimetilsiloksan) (PDMS) silecek sonra yüzeyinden mikro oyuk hareketsiz olmayan tüm SSLBs kaldırır. Mikro-ve elde edilen diziler SSLB 3 um merkez-merkez aralığında ve altıgen periyodik yüksek yoğunluklu (~ 10 5 SSLBs / mm 2) sahiptir. Seri olarak, farklı lipid bileşimlerle SSLBs biriktirilmesi ile, rasgele konumlandırılmış olan çok-bileşenli SSLBs diziler oluşturmak mümkündür. SSLB Dizilerin algılama yeteneğini göstermek için, SSLBs dahil bir Gangliozidleri (GM1) ile kolera toksini (CTx) etkileşimini kullanılır. Iledoğal zar partiküller, iki farklı hücre tiplerinden membran malzemesi ihtiva eden, çok-bileşenli dizilerde hücreye özel lipidler tespit etmek mümkün oldu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Microwell Dizi Yüzey 1. Mikro ve
- Termal olarak yetiştirilen oksit 100 nm olan bir 4 inç silikon gofret ile başlayın.
- 30 saniye boyunca 4,000 rpm'de gofret SPR-955 0.7 photoresist'i Spin.
- 90 saniye boyunca 115 ° C'de bir sıcak plaka üzerinde pişirilir.
- Photoresist'i Açığa.
- Dizi, bir 2 mm x 2 mm alanı kapsayan bir 3 um süresi ile bir altıgen dizide düzenlenmiş 1 um delikler yaratacak bir maske kullanın.
- 6 mm adım büyüklüğü ve 200 mJ / cm 2 'lik bir pozlama kullanan bir i-hat step in gofret Açığa.
- 90 saniye boyunca 115 ° C'de bir sıcak plaka üzerinde pişirilir.
- 90 saniyelik bir geliştirme toplam süresi için gofret CD-26 2 birikintileri yatırmak için bir spin geliştirici kullanarak geliştirin.
- N 2 ile ultra saf DI su ve kuru ile iyice durulayın.
- Ar 50 sccm'lik, CF 4 25 sccm'lik ve CHF 3 flo 50 sccm'lik ile 6 dakika boyunca bir reaktif iyon etcher in oksit etch75 mTorr basıncında kanat.
- C4 F 8 63 sccm'lik, SF 6 27 sccm'lik, Ar 40 sccm'lik ve O 2 14 mTorr basıncında akan 10 sccm'lik ile 2 dakika boyunca bir ICP derin açması reaktif iyon etcher olarak silikon etch.
- Karşı kaldırmak için aseton, metanol ve izopropanol içinde durulayın.
- H 2 SO 4 banyosu içinde yer: H 2 O 2 01:01 yüzeyi temizlemek için 10 dakika karıştırıldı.
- N 2 ile ultra saf DI su ve kuru ile iyice durulayın.
- 250 ° C'de atomik tabaka birikimi ile Al 2 1.080 Å O 3 yatırınız
Poli 2.. Hazırlama (dimetilsiloksan) Çekçek
- Mümkünse, bir temiz oda çalışır. Aksi mümkün temiz ortamda çalışmak.
- ≥ 13 mm saplı bir plastik Petri çanak (veya başka temiz tek bir kap) edinin.
- Bu yemeğin içinde, 50 g PDMS bas ardından, 5 gr PDMS sertleştirme ajanı dökmeke maddesi (ya da çoğunlukla Petri kabı dolduracak 1:10 şey). Bir kullanılıp atılabilir plastik bir pipet ya da çubuk ile iyice karıştırın.
- Kabarcıkları karışımı (yaklaşık 30 dakika) üzerinden gelinceye kadar vakum uygulanarak, bir vakum hattı olan bir bölme içerisinde karışık PDMS yerleştirerek kabarcıklarını çıkarın.
- Zaten Petri kabındaki, hava kabarcıklarının oluşturulmasını önlemek Petri kabındaki PDMS, dökmek değilse.
- 50 ° C (daha az bir süre için yüksek ısı de çalışıyor)> bir ocak gecede Cure.
- Temiz / yeni jilet ile, dikkatle mümkün olduğunca temiz üst yüzeyi tutarak, bir dikdörtgen parça, yaklaşık 2.5 x 2.5 cm kesti. Temiz bir forseps ile soyunuz. (Bu silecek sürecinde kullanılan kenar olacak) mümkün olduğunca keskin üst kenarına yapmak için, bir hareket jilet bastırarak bir kenarını (1.5 cm aşağı) keserek.
- Daha sonra aseton, metanol, izopropil alkol, ve ultra saf DI su ile yıkayınız ve temiz, kuru bir nitrojen gazı ile darbe. Temiz bir Petri kabındaki saklayın.
Veziküller 3. Hazırlanması
- Lipid stok 25 mg / ml yumurta fosfatidilkolin (PC) solüsyonları ve 1 mg / ml 1,2-dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N toplayın - kloroform (lisamin rodamin B sülfonil) amonyum tuzu (Rho-DPPE) ve kloroform / metanol içinde monosialoganglioside GM1 bir 0.5 mg / ml stok çözeltisi (2:1 v / v).
- Küçük bir cam şişe içinde 25 mg / ml PC 18.9 ul, 0.5 mg, 39.6 ul / ml GM1 ve 7.9 ul eklenmesi ile 97 mol% PC,% 2 mol GM1 ve 1 mol% Rho-DPPE sonuçlanan bir karışım yapmak 1 mg / cam şırıngalar kullanılarak ml Rho-DPPE.
- Not:. Nair ve diğerleri, 25 için ek malzeme istenen herhangi bir bileşimin vezikülleri oluşturmak için gerekli lipitlerin miktarlarını hesaplamak için mükemmel bir özelleştirilebilir Excel içerir.
- Bir vakumlu desikatör içinde şişe yerleştirin ve 6 saat için vakum altında şişeyi bırakarak çözücü çıkarın.
- 0.1 'lik bir sulu çözelti yapınM NaCl. Kurutulmuş lipid filmi içeren şişeye 0.1 M NaCl çözeltisinin 0.5 ml ilave edilir.
- Sulu lipid karışım gece boyunca dinlenmeye bırakın.
- Bir vezikül süspansiyonu oluşturmak için Kısaca girdap karışımı, daha sonra oda sıcaklığında bir banyo sonikatörü içinde 20 dakika boyunca ultrasonik titremeye maruz bırakılır.
- 100 nm gözenek boyutu olan bir polikarbonat membran ile vezikül süspansiyonunun Ekstrüze. Filtre 17X ile vezikül süspansiyonunun geçirin.
- 4 ° C'de bir cam şişe içinde çekilmiş veziküllerin saklayın
Küresel Desteklenen lipit tabakalarının 4. Oluşumu
- 700 nm çaplı SiO 2 boncuk toplayın. Taneler, 1.4 x 10 11 boncuk / ml 'lik bir stok konsantrasyonu ile damıtılmış su içinde temin edilmektedir.
- Bir 1.5 ml Eppendorf tüpü içinde 0.1 M NaCI 893 ul boncuk stok çözeltisinin 107 ul ekleyerek 1.5 x 10 10 boncuk / ml 'lik bir konsantrasyon ile bir 1 ml boncuk süspansiyonu hazırlamak.
- Iyi mi sağlamak için süspansiyon vorteksxed.
- 20 dk sonra süpernatant atın için 1.700 x g'de süspansiyon santrifüj. 0.1 M NaCI, 1 ml olarak boncuk yeniden süspanse edin. Iyice boncuk yıkamak için iki kez daha bu adımı tekrarlayın.
- , SSLBs oluşturan bir 1.5 ml Eppendorf tüpü içinde 1 mg / ml vezikül süspansiyonunun 200 ul SiO 2 boncuk süspansiyonu 25 ul ekleyin. Vortex karışım, oda sıcaklığında 1 saat boyunca bekletilir. Bu aşamada SSLB konsantrasyonu 1.7 x 10 9 SSLBs / ml olmalıdır.
- SSLBs pellet haline getirmek için 20 dakika boyunca 1700 x g'de santrifüjleyin. Pelet nedeniyle boncuklar üzerinde Rho-DPPE ile veziküllerin rüptürü pembe görünmelidir.
- 225 | il fosfat tamponlu tuz (PBS), pH = 7.4 'de tekrar süspansiyon süpernatan ve atın. Tekrar SSLB süspansiyon herhangi yırtılmamış veziküllerini kaldırmak için 4.6-4.7 adımları iki kez daha.
SSLB Array 5. Meclisi
- 4-6 mikrofon ile dikdörtgen parçalar sonuçlanan mikro diziler Cleave gofretbirim başına Rowell diziler.
- Vortex SSLB süspansiyonu karıştırmak, sonra her mikrowell dizideki SSLB süspansiyonu 10 ul yerleştirin. 1 saat dinlenme SSLBs yüzeyine yerleşmek için izin diye.
- Sonra yavaşça sığ bir tabak içinde hazırlanmış bir PBS banyosunda daldırın, bir yıkama şişesinden PBS ile mikro dizi çip yıkayın.
- Batık ise, yavaşça mikro dizi çip üzerinde PDMS silecek floş yerleştirin ve yavaşça mikro oyuk hareketsiz değil SSLBs kaldırmak için yüzeyi 5x boyunca kaydırın.
- Kavrama hafifçe mikro dizi cımbız ile çip ve herhangi bir aşırı SSLBs kaldırmak için PBS banyosunda sallayın.
- Çabuk silecek banyosundan çipi çıkarın ve daha sonra kullanmak kadar taze PBS banyosunda yerleştirin. Çipin üst yüzeyi SSLBs korumak için ıslak olduğundan emin olun.
Not: Yukarıda tarif edilen montaj yöntemi fare beyin veya pho izole myelin parçacıkların gibi doğal zar parçacıklarının diziler yaratmak için kullanılabilirSiO 2 kordon destek olmadan spholipid veziküller. Bu çalışma Wittenberg et de ayrıntılı olarak tarif edilmiştir al. 21 ve temsili sonuçlar aşağıda gösterilmiştir.
6.. Kolera Toksin Bağlanma Deneyi
- PBS içinde sığır serum albümini (BSA) içinde bir 2 mg / ml çözeltisi hazırlayın.
- 2 mg / ml BSA ile PBS içinde Alexa 488 ile konjuge edilmiş kolera toksini B-alt-biriminin istenen konsantrasyonuna sahip bir çözelti hazırlayın.
- PBS banyosundan SSLB dizi çipini çıkarın ve silin bir laboratuvar ile PBS solüsyonu en uzak fitil. SSLB dizi sulu tutmak için çip üzerinde yeterli PBS bırakın.
- Özel olmayan bağlanmasını önlemek için, 2 mg / ml SSLB dizi çip BSA çözeltisi 200 ul ekleyin. Nemlendirilmiş kutu içinde 1 saat bekletin.
- Bir mikropipet ile, SSLB dizi çip üstünden çözeltisi 200 ul çıkarın.
- SSLB dizi çip kolera toksin çözeltisi 200 ul ilave edin ve bir nemlendirilmiş kutu içinde 1 saat boyunca geri kalanı sağlar.
- Yavaşça herhangi bağlanmamış kolera toksini kaldırmak için bir yıkama şişesinden PBS ile SSLB dizi çip yıkayın.
- Bir laboratuvar kullanarak fitil uzak aşırı PBS silin. 24 mm x 40 mm kapak kayma ile kapak çip görüntüleme önce.
- Filtre kullanarak dik bir mikroskop ile görüntü diziler ilgi floroforlar için uygun ayarlar.
- ImageJ yazılım otomatik parçacık analiz fonksiyonunu kullanarak bir dizi bireysel SSLBs arasında floresan yoğunluğu analiz edin.
- Belirli bir dizi üzerinde bulunan SSLBs yoğunluklarını özetlemek histogramlar içine bireysel SSLBs itibaren ortalama floresan yoğunlukları derlemek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SiO 2 boncuk fosfolipidler, floresan lipitler ve örneğin gangliosidler gibi diğer lipidler oluşan veziküllerin bir çözeltisi ile karıştırılmaktadır, Şekil 1a'da şematik olarak gösterildiği gibi, veziküller, SSLBs oluşturmak üzere SiO 2 kordon yüzeyleri üzerinde kopma. SSLBs yıkandıktan sonra, SSLB çözeltisinin bir damlası bir mikro dizi yerleştirilir ve boncuklar yüzeyine yerleşmek için izin verilir. (Şekil 1B1), Şekil 1B2 gösterilmiştir fosfolipid vezikülleri ya da doğal zar parçacıkları, bir süspansiyonu ile de yapılabilir. Bir mikro dizi alt-tabakaya emdirilir fosfolipid vesiküllerin bir fluoresans görüntü Şekil 1B3 gösterilmiştir. Sonra PDMS silecek herhangi SSLBs (Şekil 1C1), veziküller veya doğal zar parçacıklar mikro oyuk içine razı olmadı (Şekil 1c2) kaldırmak için yüzeyi boyunca yavaşça kayarak yapılır. Bu, SSLB dizi ile sonuçlanan hermikro en içeren bir SSLB (Şekil 1D1) ya da çoklu keseler ya da doğal zar parçacıkları, her kuyucuğa (Şekil 1D2) olan bir dizi. Floresan etiketli veziküller oluşan mikrodizisinin bir görüntü Şekil 1D3 gösterilmiştir.
Yumurta PC (siyah), Rho-DPPE (kırmızı) ve GM1 (mavi):.. Bir SiO 2 boncuk üzerinde lipitlerin 3 tip oluşan bir SSLB bir SSLBs ve SSLB dizi montaj Şekil 1 Formasyonu (a) İllüstrasyon. (B1-d1) bir mikro dizi (b1) dağınık SSLBs gösteren bir SSLB dizinin montajı için Süreç akış, SSLBs yüzeyini temizlemek için bir PDMS çekçek kullanımı mikro oyuk (c1) içine yerleşmiş değil, ve nihai SSLB dizisi (d1 .) (B2-d2 (B2) 'de resme karşılık gelen bir mikro alt-tabaka üzerine adsorbe fosfolipid vesiküllerin (b3) bir fluoresans görüntüsü. (D3) (d2) 'de resme karşılık gelen fosfolipid vezikülleri oluşan mikrodizisinin bir floresan görüntü. Referanslar 20 ve 21 uyarlanan ve American Chemical Society izni ile kullanılır.
Mikro oyuk içinde SSLBs hem açılı üst görünümü ve kesitsel perspektiflerden taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile görüntülendi bireysel SiO 2 boncuk destekler. Şekil 2b, bir hareketsiz, tek bir boncuk bir kesit görünüşünü göstermektedir sırasında bir bölgenin bir üst görünümüdür, yaklaşık 15 um x 15 um, Şekil 2a'da gösterilmiştirmikrowell. Kuyu kaplama tabakası hafif Al 2, 100 nm, O 3 oyukları, sadece tek bir boncuk uyum sağlama kapasitesine sahiptir, böylece iyi çapı ayarlamak için atomik tabaka olarak yerleştirilir.
SSLB diziler Şekil 2.. Taramalı elektron mikroskobu görüntüleri. Mikro dizilerde hareketsiz SSLB boncuk destekleri gösteren bir 15 mm x 15 mm alanının (a) bir elektron mikrografı. (B) bir mikro içinde tek bir 700 nm çapında SSLB. Mikrowell kaplama sadece bireysel boncuk içine sığabilecek böylece kuyu küçültmek için yatırılır Al 2 O 3, olduğunu. Referans 20 uyarlanan ve American Chemical Society izni ile kullanılır.
SSLB dizileri hazırlanır, onlar floresan mikroskobu ile görüntülenebilir.
SSLBs farklı ardışık yerleştirme birden fazla bireysel SSLBs kimliği bir toksin reseptörüne (GM1) yokluğunda ya da varlığı ile belirlenmiştir SSLB, türüne ve onun kolera toksini (CTx) bağlanması ile diziler oluşturmak için kullanıldı. Düzenek işlem, bir tek SSLB tipi için aynı olmuştur, ancak farklı bir SSLB kimliği ile bir kez gerçekleştirilmiştir. SSLBs ait başlangıç konsantrasyonu SSLB ilk Çeşidi doluluk azaltmak ve daha fazla boş SSLB ikinci tip tarafından işgal izin vermek için 10x daha düşüktü. Şekil 3c-3E olarak, SSLBs iki tip bir SSLB dizi gösterilmektedir. AlSSLBs l kırmızı floresan Rho-DPPE (Şekil 3C) içerir, ama sadece bazı SSLBs GM1, CTX ve B-alt-birimi için bir reseptördür gangliosid içerir. Yeşil floresan Alexa 488-konjuge CTx maruz kaldığında, GM1 içeren yalnızca SSLBs yeşil kanal (Şekil 3d) flüoresanslara. Kırmızı ve yeşil görüntüler birleştirilir, bu SSLBs GM1 (sarı) içeren belirlemek mümkündür ve hangi yapmak değil (kırmızı) (Şekil 3e).
SSLB diziler Şekil 3.. Floresans görüntüleme. (A) 936 Rho-DPPE-etiketli yumurta PC SSLBs içeren bir 100 mikron x 100 mikron alanı. (B) işgal mikro oyuk% 76 ile bir SSLB gösteren bir aydınlık ve floresan kaplama. (Ce) Rho-DPPE içeren SSLBs içeren bir SSLB dizi(C), bir kısmı da Alexa-488-konjuge CTX (d) ile bağlıdır GM1 içerir. (E) kolokalize floresan SSLB üzerinde GM1 varlığını gösteren kırmızı ve yeşil kanallarının birleşme. Mavi daireler yani GM1 eksik, sadece kırmızı floresan SSLBs göstermektedir. Referans 20 uyarlanan ve American Chemical Society izni ile kullanılır.
SSLB dizilerindeki Flüoresans verileri tek bir resimde SSLBs yoğunluğunu ölçülmesi ile analiz edilmiştir. Dizilerindeki SSLB yoğunluğu verileri histogramlar halinde toplanmıştır. Şekil 4a, sadece yumurta PC ve 1 mol% Rho-DPPE içeren SSLBs oluşan bir diziden SSLB Rho-DPPE floresans analizi böyle bir histogramı gösterir. Şekil 4a'da veriler Şekil 3a'da görüntüsünün analizi ile elde edilmiştir. Bu buzdolabında SSLB diziler, en az bir hafta için sağlam ve stabil olduğu birnd tamponu daldırılmıştır. Diziler herhangi bir floresan yoğunluğunu kaybeder vermedi, ne dizilerin doluluk bir hafta (Şekil 4b) boyunca değişiklik yoktu.
Şekil 4,. (A) Histogram Şekil 3a'da gösterilen SSLB dizisi için floresan yoğunlukları dağılımını gösteriyor. Dizideki her SSLB için ortalama yoğunluk histogramı derlemek için kullanılmıştır. Kesintisiz çizgi, verilere bir Gauss uygundur. (B) dizi doluluk (siyah daireler) ve bir hafta boyunca izlenen bir SSLB dizi için floresan yoğunluğu (kırmızı kareler) idi. Referans 20 uyarlanan ve American Chemical Society izni ile kullanılır.
Biz GM1 (0, 0.5, 1, değişen konsantrasyonları ile SSLBs oluşan dizileri yapılmış birnd 2 mol%) ve sabit bir CTX konsantrasyonu yanı sıra, GM1 konsantrasyonları ile SSLBs Dizilerin bunları maruz kalan ve CTX arasında değişen konsantrasyonlarda bunları maruz. Daha sonra deney GM1/CTx bağlanması için denge çözüşüm sabiti (Kd) belirlemek için kullanılmıştır. GM1 değişen konsantrasyon ile SSLB diziler daha sonra yıkanır ve 1 saat boyunca görüntüsü 50 nM Alexa-488 etiketli CTX maruz bırakıldı. Yoğunluğu 0.5 ile SSLB diziler için histogramlar - 50 nM Alexa 488-konjuge CTx maruz kalan% 2 mol GM1, Şekil 5a'da görülebileceği Şekil 5b, GM1 konsantrasyonuna ortalama floresan yoğunluğunun doğrusal bağımlılık gösterir.. SSLBs içinde GM1 konsantrasyonu, 2 mol% olarak sabitlenir ve SSLB diziler 16 pM ile 158 nM arasında değişen CTX maruz kaldığında Şekil 5c 'de gösterildiği gibi, bağlama tepki eğrileri sigmoidal izler. Bu verilere uygun eğrileri iki farklı bağlama modellere dayanmaktadır: Langmuir izoterm (Eşitlik 1) ve Hill-VVaud modul (Eşitlik 2). , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
(1)
(2)
F belirli bir CTX konsantrasyonda floresan yoğunluğu olduğu durumda bağlama doyduğunda, F max floresans yoğunluğu, [CTX] CTX konsantrasyonu, K D ve K H Langmuir ve Hill-Waud arasındaki ayrılma sabitleri olduğu sırasıyla uyan ve n, Hill-Waud modelinde kooperativiteye katsayısıdır. Kooperativiteye katsayısı (n) 'den daha büyük bir n multivalent bağlanma miktarını tahminher biri CTx molekülü birden fazla GM1 bağlandığım gösterir. 0.5 x F max CTX konsantrasyonu GM1/CTx etkileşim için K D ya da K H'dir. Deneylerimizde kooperatif bağlanma gösteren, 1.3 bir n değerine sahip bir 1.6 ± 0.2 nM olan Kd 1.4 ± 0.2 nM K H hesaplanmıştır. GM1/CTx etkileşim için ayrılma sabitleri 370 nM 26,27 için 04:05 dan büyüklükte 5 üzerinden sipariş kadar, literatürde geniş ölçüde değişir.
Şekil 5. CTx/GM1 SSLB diziler üzerinde bağlanma deneyleri. (A) SSLB diziler tek tek SSLBs floresans yoğunluğunun Histogramlar. Dizileri 0.5, 1 ya da 2 mol% GM1 ile SSLBs içeren ve 50 nM Alexa 488-konjuge CTx maruz bırakıldı.kalın çizgiler Gauss uyar bulunmaktadır. (B) dağılımın Plot GM1 konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak, (a) 'dan gelir. (C) dağılımını gösteren bağlama eğrileri, 158 nM, 16 pM arasında değişen Alexa-488-konjuge CTX tabi tutulduktan sonra,% 2 mol ile GM1 SSLBs ihtiva eden dizileri anlamına gelmektedir. Çizgiler Langmuir izotermi (kırmızı) ve Hill-VVaud (mavi) bağlama modelleri uyan vardır. (BC) hata çubukları her veri noktasına gelen floresan yoğunluğu dağılımlarının standart sapmaları temsil eder. Referans 20 uyarlanan ve American Chemical Society izni ile kullanılır.
Daha önce de belirtildiği gibi, doğal kaynaklardan elde edilen 21 biyomembran malzeme ile diziler oluşturmak da mümkündür. Diziler daha sonra mikrofon membran parçacıkların geride bırakmak silecek üst yüzeyini temizlerken, bir mikro tabaka üzerinde zar parçacıkları yayarak, aynı şekilde oluşturulurRowells. Şekil 6 miyelin ve nöronal lipid salı microarrays örneklerini göstermektedir. Şekil 6A'da, miyelin parçacıklar lipofilik florofor FM1-43 ile etiketlenir. Lipid sal kolesterol ve GM1 gibi gangliosidler zenginleştirilmiş olduğu bilinmektedir; Şekil 6b'de gösterildiği gibi flüoresan etiketli streptavidin (SAPE) diziye bağlanmadığını Böylece, Alexa 488-konjüge CTX, lipid salı mikrodizilerinin güçlü bir şekilde bağlar. (Şekil 6c) Biz de 250 mikron çapında kanalları ile microfluidic çip ile mikro yüzeye miyelin ve lipid salı parçacıkları sunarak şerit dizileri oluşturulur. Parçacık Doğumdan sonra, mikroakışkan çip mikro altkatmanından müstakil ve silecek süreç her zamanki gibi yürütülmektedir. Şerit diziler daha sonra miyelin bulunan sulfatid bağlanan bir floresan anti-oligodendrosit IgM antikoru (IgM O4) maruz bırakıldı. (Şekil 7) miyelin ve lipid salı şerit mikroarrayŞekil 7 s büyütme artan düzeyde gösterilen ve büyütme en üst düzeyde, bu sulfatid lipid sallar yoktur çünkü IgM O4 sadece miyelin mikrodiziler bağlar olduğu açıktır vardır.
Şekil 6.. Miyelin parçacık ve nöronal lipid salı parçacık diziler. Myelin parçacıkların lipofilik florofor FM1-43 ile floresan işlenir: (a) bir miyelin parçacık mikrodizi. Kesikli çizgi dizisi alanının kenarına gösterir. (B) CTx lipid salı partiküllere bağlanma gösteren Lipid sal mikroarray. (C) Lipid salı mikrotertip hiçbir spesifik olmayan bağlanma az gösteren floresan streptavidin-fikoeritrinle (SAPE) maruz. Referans 21 uyarlanan ve Amerikan Kimya Soc izni ile kullanılıriety.
Şekil 7. Multikomponent diziler miyelin ve nöronal membranların sal mikrofluidik teslimat kurdu. (A) miyelin ve sallar sonra Floresan görüntü mikroarray tabaka üzerinde microfluidic kanallardan tevdi edilmiştir. Sol ve sağ çizgili miyelin içeren ve orta şerit nöronal sal membranlar içerir. Zarlar FM1-43, her bir lipit maddesi etiketler ile boyanır. Ölçek çubuğu 250 mikron. PDMS sileceği uygulanması ve IgM O4 ile inkübe edildikten sonra, aynı üç şeritlerin (b) Flüoresan image. Ölçek çubuğu 250 mikron. IgM O4 sadece miyelin mikrodizilerine bağlar olduğunu gösteren üç çizgili itibaren (ce) Büyütülmüş görüntüleri: (c) sol şerit ve (e) sağ şerit. P ölçek barANELLER ce 30 mikron. Referans 21 uyarlanan ve American Chemical Society izni ile kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, biz destekli lipid çift tabakaları ile kaplanmış tek dağılımlı SiO 2 boncuk lipid iki katmanlı ya da alt-tabaka yüzeyi üzerinde ligandların hedef için gerek kalmadan mikro diziler halinde dizilmiş olabilir ve diziler toksin lipid etkileşimleri belirlemek için kullanılabileceğini göstermektedir. CTx/GM1 bağlanması için hesaplanan ayrışma sabiti biz önceki bir raporla, literatürde değerlerin geniş bir eşitsizlik göz önüne alındığında, uygun bir şekilde kıyaslanabilir Winter ve ark., Lipid kaplı boncuklar koloidal düzeneği ile ilgili bir ayrışma sabitini hesaplamak için kullanılmıştır burada 30 nM. Hill-VVaud bağlama modeli için veri uydurma, biz CTx/GM1 etkileşim önceki raporlarda 28 ile kabul muhtemeldir değerlikli olduğunu belirledi. CTX B (gangliosid bağlanma) alt-birimi, bir 29 GM1 molekülü bağlayabilen beş birimlerinin her biri ile, pentamer olarak bulunur; Bu şekilde, birden fazla alt birim diff verilen bağlı olabilir, bu şaşırtıcı değildirSLBS 30 GM1 arasında usive hareketlilik.
Kimyasal olarak işlevselleştirilmiş boncuk diziler, diğer analitik çalışmalarda 31 kullanılmıştır. Deneyler bu tür, taneler, tipik olarak dağlanmış optik fiberlerin sonunda oluşturulan mikro oyuk olarak hareketsizleştirilir. Multiplex floresan deneyleri, tanelerin karıştırılması yapıda yapıdadır ve optik lif 32'nin ucuna eş zamanlı olarak sabitlenmesi bu yapılandırmada gerçekleştirilebilir. Çözelti içinde serbest SSLBs ilgili başka lipidler ile 33 SSLB tipinden diğerine transfer edilebilir çünkü çok katlı tahlilinde (Şekil 3c-3e) olarak, ardışık olarak optik yönden kodlanmış SSLBs hareketsiz. Bu SSLB dizilerin hazırlanmasında ekstra adımlar ekler, bu aşırı zaman alıcı ve lipit-fonksiyonalize boncuklar için en etkili bir yaklaşımdır. Biz de mekansal bitişik mikro dizilerde farklı SSLB popülasyonları yatırarak dizileri kodlanmıştır, ve gözlemlenebilir Kasır yokturDizilerin 20 ila s-konuşma. Numune hazırlama sürelerini azaltmak için, SSLB dizileri, önceden hazırlanmış ve istendiğinde kullanılabilir. Bir hafta boyunca dizilerin stabilitesini test edilmiş ve SSLBs lipit malzeme miktarının zamanla değişmez gösterir floresan yoğunluğu, açısından dizilerin önemli bir bozulma bulundu. Ayrıca, dizi doluluk SSLBs hareketsiz bir kez, onlar mikro oyuk (Şekil 4b) den ayırmak olmadığını göstermektedir ki, zamanla değişmez.
Sentetik lipid çift tabakaları ile kaplanmış boncuk ilave olarak, aynı zamanda doğal zar parçacıklarının 21 dizileri oluşturmak için bu yöntemi kullandık. Bu çalışma, bu tür lipid salı fraksiyonu olarak fare beyin hem de nöronal membran partiküllerden elde edilen myelin parçacıkların, hareketsiz. Biz antikor bindinin hücre-spesifik membran yüzey molekülleri tanımlamak için dizileri kullanmak başardıkng (Şekiller 6 ve 7). Ayrıca, mikro oyuk büyüklüğü dizinin nano ve üst yüzeye düşürülmüştür zaman altın ile kaplanmıştır, floresan etiket kullanılmadan miyelin zar parçacıkları antikorların bağlanma izlemek için yüzey plazmon rezonans kullanmak mümkün. Dizileri oluşturmak için SSLB ve vezikülleri veya doğal zar partiküller kullanılarak arasındaki en büyük fark, sadece tek bir boncuk her iyi uyum, çünkü SSLBs durumunda küçük hücreden her membran malzemenin tam miktarı olmasıdır. Keseler ya da doğal zar parçacıkları ile, keseler ya da parçacıkların başlangıç konsantrasyonu ayarlamak için başka bir küçük hücreden her malzeme miktarını kontrol etmek için hiçbir yol yoktur. Bununla birlikte, vezikül sayısı iyi-kuyu değişkenlik vezikül çapı 21 dağılımına kıyasla çok büyük değildir.
Son olarak, bu yöntem div olabilirgelecekteki uygulamalar Erse. Junesch ve arkadaşları kolloidal litografi nano fabrikasyon 34 sırasında nanopartıküllerıni kaldırmak için bir çekçek istihdam var. Membran hücre dizileri fokal yapışma 35 araştırmak kavis ya da zar-protein algılama 36 bağlanma incelemek için, hücre-hücre temas taklit etmek için oluşturulabilir. Buna ek olarak, gözenekli boncuklar kullanımı lipid ikili tabakalar 37 ya da bir biyomembran bir dizi alt-tabaka üzerinde kültive hücreleri için saklı kargo yerel teslim içine transmembran proteinlerin dahil kolaylaştıracaktır. Mikro platformu tasarım esnekliği sağlar fotolitografi, imal edilmektedir. İşte bizim diziler altıgen geometri vardı, ama kare, doğrusal veya diğer geometriler fokal yapışma mekansal etkilerini araştırmak dizi dönemsellik ve mikro boyutları değişen ile oluşturulmuş olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa etmek hiçbir rakip mali çıkarları var.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 GM092993) den SHO hibe tarafından desteklenen, Ulusal Bilim Vakfı (NSF KARİYER Ödülü ve DBI 0.964.216), Donanma Araştırma Bürosu (ONR) Genç Araştırmacı Programı ve Biyoteknoloji Minnesota Ortaklık Ödülü ve Tıbbi Genomik. Cihaz fabrikasyon Ulusal Nanoteknoloji Altyapı Ağı aracılığıyla NSF destek alan Minnesota Üniversitesi NANO Merkezi (NFC), gerçekleştirildi. Bu çalışma aynı zamanda Sağlık (NS048357, R21 NS073684), Ulusal Multipl Skleroz Derneği (CA1060A11), Applebaum, Hilton, Peterson ve Sanford Vakıflar ve McNeilus ailenin National Institutes MR için hibe tarafından desteklenmiştir. Yazarlar taramalı elektron mikroskobu ile yardım için illüstrasyonlar ve Shailabh Kaya ile yardım için Hyungsoon Im teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 inch silicon wafers | University Wafer | 425 | |
| Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist | MicroChem | SPR955-CM | |
| Shipley MICROPOSIT CD-26 developer | MicroChem | CD-26 | |
| i-line stepper | Canon | 2500 i3 stepper | |
| Vision 320 reactive ion etcher | Advanced Vacuum | Vision 320 RIE | |
| Deep trench reactive ion etcher | Plasma Therm | SLR-770 | |
| Atomic layer depostion system | Cambridge NanoTech | Savannah | |
| Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Egg phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt | Avanti Polar Lipids | 810158C | |
| Monosialoganglioside GM1 | Avanti Polar Lipids | 860065P | |
| Silica beads | Bangs Laboratories | SS03N/4666 | Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter. |
| Cholera toxin B-subunit, Alexa 488-conjugate | Molecular Probes | C-34775 | |
| Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate | R&D Systems | NL1326R | |
| FM1-43 | Molecular Probes | T-3136 | |
| Eppendorf MiniSpin centrifuge | Fisher Scientific | 05-401-09 |
References
- Drews, J. Drug discovery: A Historical Perspective. Science. 287 (5460), 1960-1964 (1126).
- Cooper, M. A. Advances in Membrane Receptor Screening and Analysis. J. Mol. Recognit. 17 (4), 286-315 (2004).
- Voskuhl, J., Ravoo, B. J.
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (1002).
- Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid Supported Lipid Bilayers: From Biophysical Studies to Sensor Design. Surf. Sci. Rep. 61 (10), 429-444 (2006).
- Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early Steps of Supported Bilayer Formation Probed by Single Vesicle Fluorescence Assays. Biophys. J. 83 (6), 3371-3379 (2002).
- Krysinski, P., Zebrowska, A., Michota, A., Bukowska, J., Becucci, L., Moncelli, M. R. Tethered Mono- and Bilayer Lipid Membranes on Au and Hg. Langmuir. 17 (13), 3852-3857 (2001).
- Li, L., Wang, H. F., Cheng, J. X. Quantitative Coherent anti-Stokes Raman Scattering Imaging of Lipid Distribution in Coexisting Domains. Biophys. J. 89 (5), 3480-3490 (2005).
- Richter, R. P., Brisson, A. R. Following the Formation of Supported Lipid Bilayers on Mica: A Study Combining AFM, QCM-D, and Ellipsometry. Biophys. J. 88 (5), 3422-3433 (2005).
- Dahlin, A., Zäch, M., Rindzevicius, T., Käll, M., Sutherland, D. S., Höök, F. Localized Surface Plasmon Resonance Sensing of Lipid-Membrane-Mediated Biorecognition Events. J. Am. Chem. Soc. 127 (14), 5043-5048 (2005).
- Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. Phase Separation of Lipid Membranes Analyzed with High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry. Science. 313 (5795), 1948-1951 (2006).
- Groves, J. T., Boxer, S. G. Micropattern Formation in Supported Lipid Membranes. Acc. Chem. Res. 35 (3), 149-157 (2002).
- Bally, M., Bailey, K., Sugihara, K., Grieshaber, D., Vörös, J., Stadler, B. Liposome and Lipid Bilayer Arrays Towards Biosensing Applications. Small. 6 (22), 2481-2497 (2010).
- Groves, J. T., Dustin, M. L. Supported Planar Bilayers in Studies on Immune Cell Adhesion and Communication. J. Immunol. Methods. 278 (1-2), 19-32 Forthcoming.
- Yang, T. L., Jung, S. Y., Mao, H. B., Cremer, P. S. Fabrication of Phospholipid Bilayer-Coated Microchannels for On-Chip Immunoassays. Anal. Chem. 73 (2), 165-169 (2001).
- Groves, J. T., Ulman, N., Boxer, S. G. Micropatterning Fluid Lipid Bilayers on Solid Supports. Science. 275 (5300), 651-653 (1997).
- Hovis, J. S., Boxer, S. G. Patterning and Composition Arrays of Supported Lipid Bilayers by Microcontact Printing. Langmuir. 17 (11), 3400-3405 (2001).
- Yee, C. K., Amweg, M. L., Parikh, A. N. Direct Photochemical Patterning and Refunctionalization of Supported Phospholipid Bilayers. J. Am. Chem. Soc. 126 (43), 13962-13972 (2004).
- Kelly, C. V., Craighead, H. G. Nanofabrication for the Analysis and Manipulation of Membranes. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1356-1366 (2012).
- Wittenberg, N. J., Johnson, T. W., Oh, S. H. High-Density Arrays of Submicron Spherical Supported Lipid Bilayers. Anal. Chem. 84 (19), 8207-8213 (2012).
- Wittenberg, N. J., et al. Facile Assembly of Micro- and Nanoarrays for Sensing with Natural Cell Membranes. ACS Nano. 5 (9), 7555-7564 (2011).
- Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels. Angew. Chem. Int. Ed. 42 (45), 5580-5583 (2003).
- Kalyankar, N. D., et al. Arraying of Intact Liposomes into Chemically Functionalized Microwells. Langmuir. 22 (12), 5403-5411 (2006).
- Dahlin, A. B., Jonsson, M. P., Höök, F. Specific Self-Assembly of Single Lipid Vesicles in Nanoplasmonic Apertures in Gold. Adv. Mater. 20 (8), 1436-1442 (2008).
- Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using Patterned Supported Lipid Membranes to Investigate the Role of Receptor Organization in Intercellular Signaling. Nat. Protoc. 6 (4), 523-539 (2011).
- Kuziemko, G. M., Stroh, M., Stevens, R. C. Cholera Toxin Binding Affinity and Specificity for Gangliosides Determined by Surface Plasmon Resonance. Biochemistry. 35 (20), 6375-6384 (1996).
- Moran-Mirabal, J. M., Edel, J. B., Meyer, G. D., Throckmorton, D., Singh, A. K., Craighead, H. G. Micrometer-Sized Supported Lipid Bilayer Arrays for Bacterial Toxin Binding Studies Through Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Biophys. J. 89 (1), 296-305 (2005).
- Shi, J. J., Yang, T. L., Kataoka, S., Zhang, Y. J., Diaz, A. J., Cremer, P. S. GM1 Clustering Inhibits Cholera Toxin Binding in Supported Phospholipid Membranes. J. Am. Chem. Soc. 129 (18), 5954-5961 (2007).
- Gill, D. M. The Arrangement of Subunits in Cholera Toxin. Biochemistry. 15 (6), 1242-1248 (1021).
- Weng, K. C., Kanter, J. L., Robinson, W. H., Frank, C. W. Fluid Supported Lipid Bilayers Containing Monosialoganglioside GM1: A QCM-D and FRAP study. Colloid Surface B. 50 (1), 76-84 (1016).
- Walt, D. R.
- Bake, K. D., Walt, D. R.
- Kundu, J., Levin, C. S., Halas, N. J. Real-Time Monitoring of Lipid Transfer Between Vesicles and Hybrid Bilayers on Au Nanoshells Using Surface Enhanced Raman Scattering (SERS). Nanoscale. 1 (1), 114-117 (2009).
- Junesch, J., Sannomiya, T., Dahlin, A. B. Optical Properties of Nanohole Arrays in Metal-Dielectric Double Films Prepared by Mask-on-Metal Colloidal Lithography. ACS Nano. 6 (11), 10405-10415 (2012).
- Wu, M., Holowka, D., Craighead, H. G., Baird, B. Visualization of Plasma Membrane Compartmentalization with Patterned Lipid Bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (38), 13798-13803 (2004).
- Hatzakis, N. S., Bhatia, V. K., Larsen, J., Madsen, K. L., Bolinger, P. Y., Kunding, A. H., Castillo, J., Gether, U., Hedegard, P., Stamou, D. How Curved Membranes Recruit Amphipathic Helices and Protein Anchoring Motifs. Nat. Chem. Biol. 5 (11), 835-841 (2009).
- Roizard, S., Danelon, C., Hassaine, G., Piguett, J., Schulze, K., Hovius, R., Tampe, R., Vogel, H. Activation of G-Protein-Coupled Receptors in Cell-Derived Plasma Membranes Supported on Porous Beads. J. Am. Chem. Soc. 133 (42), 16868-16874 (2011).
