Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

طعنة الإصابة بالجروح من اسماك الزرد الكبار الدماغ الانتهائي: طريقة المعنية بالتحقيق في تكوين الخلايا العصبية والدماغ الفقارية التجديد

Published: August 4, 2014 doi: 10.3791/51753
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Toxicology and Genetics, Karlsruhe Institute of Technology

Abstract

الزرد الكبار لديهم قدرة مذهلة على تجديد الجهاز العصبي المركزي على بعد الاصابة. للتحقيق في استجابة الخلايا والآليات الجزيئية المشاركة في الزرد الكبار الجهاز العصبي المركزي (CNS) تجديد وإصلاح، وضعنا نموذجا الزرد من إصابة الدماغ الانتهائي الكبار.

في هذا النهج، ونحن يدويا توليد إصابة عن طريق دفع إبرة حقنة الأنسولين في الدماغ الانتهائي الكبار الزرد. في أيام مختلفة إصابة آخر، يتم التضحية الأسماك، يتم تشريح أدمغتهم وملطخة بواسطة المناعية و / أو الموقع التهجين (ISH) في مع علامات المناسبة لمراقبة تكاثر الخلايا، gliogenesis، وتكوين الخلايا العصبية. يخدم نصف الكرة unlesioned المقابل باعتبارها الرقابة الداخلية. هذا الأسلوب مجتمعة على سبيل المثال مع الحمض النووي الريبي التسلسل العميق يمكن أن تساعد على الشاشة لجينات جديدة مع دورا في تكوين الخلايا العصبية الدماغ الانتهائي الزرد الكبار، وتجديد، وإصلاح.

Introduction

الثدييات لديها قدرة محدودة للغاية لتوليد خلايا عصبية جديدة خلال حياة البالغين، والخلايا العصبية في الدماغ الكبار ويقتصر في الغالب إلى منطقتين الدماغ الانتهائي تقع في منطقة subventricular (SVZ) من البطينين الوحشي، والمنطقة جزئي التحبب (SGZ) من المسنن التلفيف في الحصين 1. الثدييات أيضا لا يمكن إصلاح الضرر في الدماغ الناجم عن الأمراض العصبية والسكتة الدماغية، أو إصابات، بكفاءة. لا يتم استبدال الخلايا العصبية المفقودة وبدلا انتشار أنواع مختلفة من الخلايا الدبقية، بما في ذلك الخلايا النجمية، الخلايا الدبقية الصغيرة، و oligodendrocytes، ويلاحظ. نتيجة لهذه العملية التكاثري دعا دباق رد الفعل، وختم أنسجة المخ أصيب قبالة عن طريق تشكيل ندبة الدبقية، الذي يثبط الخلايا العصبية وتجدد المحاور 2-4.

وعلى النقيض من الثدييات والأسماك مكتملة العظام مثل الزرد تشكيل الخلايا العصبية الجديدة بوفرة في مراحل الكبار ولها التجدد العالية وتتكاثرإيف المحتملة لإصلاح آفات الجهاز العصبي المركزي 2،5-7. الدماغ الكبار الزرد يحتوي على 16 منافذ متميزة العصبية الخلايا الجذعية التي تولد عدد كبير من الخلايا العصبية الجديدة أثناء الحياة بأكملها 8-11. الخلايا العصبية ولدت في هذه المناطق انتشار محددة من الدماغ الزرد الكبار الهجرة إلى المناطق المستهدفة، حيث أنها سوف تنضج والاندماج في الشبكات العصبية القائمة 8،10،12-15.

بين مناطق السلف المحددة في الزرد الكبار، ومنطقة البطين الدماغ الانتهائي هي واحدة من الخلايا العصبية محاريب الخلايا الجذعية الأكثر دراسة. ويمكن تصنيف الخلايا المتخصصة في هذا السلف إلى ثلاثة أنواع متميزة فيما يتعلق التشكل، ومعدل الانقسام والتعبير عن الدبقية مختلفة أو علامات العصبية. النوع الأول والنوع الثاني هي الخلايا الدبقية شعاعي مثل الخلايا التي لها عمليات طويلة. يعبرون عن علامات الخلايا الجذعية بما في ذلك GFAP، nestin، وS100β. النوع الأول الخلايا لا تتكاثر بينما النوع الثاني الخلايا تتكاثره ببطء، كما يتضح من التعبير عنها من علامات انتشار مثل تكاثر الخلايا مستضد النووي (PCNA) وإدماج نظائرها desoxythymidine. نوع الخلايا سريعة الانقسام الثالث والخلايا التي ملتزمون تصبح الأسلاف العصبية والتعبير عن الجينات علامة العصبية، مثل PSA-NCAM 5،16.

على الرغم من أن قدرات التجدد من الأسماك مكتملة العظام موثقة توثيقا جيدا، وقد وصفت سوى عدد قليل المطبوعات والتحقيق في تفاصيل الآليات الخلوية والجزيئية المشاركة في تجديد الخلايا العصبية في الدماغ الانتهائي الكبار في استجابة لإصابة 15،17-22. فك آليات الكبار المتورطين في الزرد تجديد الجهاز العصبي المركزي وإصلاح وفهم أوجه الشبه والاختلاف بين الخلايا العصبية التأسيسية والتجدد، وضعنا نموذجا الزرد من إصابة الدماغ الانتهائي الكبار. هنا، فإننا سوف تصف بصريا كيفية توليد اصابة في واحدة من hemisph الدماغ الانتهائيإزدان العقارية بمساعدة إبرة حقنة، مع الحفاظ على الجانب المقابل unlesioned باعتبارها الرقابة الداخلية. ونحن سوف تظهر أيضا كيفية رصد التغيرات على إصابة في تكاثر الخلايا والتعبير الجيني من قبل المناعية والمقايسات في الموقع التهجين.

Protocol

واستمرت الزرد في منشأة الأسماك من معهد لعلم السموم وعلم الوراثة (ITG) في معهد كارلسروه للتكنولوجيا (KIT). وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمعايير الألمانية لحماية الحيوان وتمت الموافقة من قبل حكومة بادن فورتمبيرغ، Regierungspräsidium كارلسروه، ألمانيا (Aktenzeichen 35-9185.81/G-272/12 'المتحمسين Neurogenese').

1. توليد طعنة في الدماغ الانتهائي

  1. خدر
    1. لإعداد محلول المخزون من تريكين (3 الأمينية البنزويك اثيل استر حامض، وتسمى أيضا إيثيل 3 أمينوبنزوات) استخدام 400 ملغ من مسحوق تريكين وحلها في 97.9 مل من الماء و 2.1 مل 1 M تريس / حمض الهيدروكلوريك العازلة (درجة الحموضة 9). ضبط درجة الحموضة إلى 7. تقديم 5 مل مأخوذة وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    2. نقل عدد مناسب من الزرد 0.5-1 سنة من دباباتهم في أقفاص الماوس البلاستيك. ملاحظة: الجمجمة من الزرد الكبار في حوالي 12أشهر من العمر لا تزال لينة نسبيا ويمكن بسهولة مثقبة مع إبرة (انظر القسم 1.2.3 والشكل 1A).
    3. لتخدير الزرد الكبار، والجمع بين 5 مل تريكين (محلول المخزون) في قفص معبر البلاستيك مع ~ 100 مل من الماء خزان الأسماك نظيفة (تركيز النهائي من تريكين 0.02٪ (ث / ت) تريكين).
    4. احتضان الأسماك في التخدير حتى لا تتحرك بعد الآن (45-60 ثانية).
  2. إصابة الدماغ الانتهائي
    1. المكان الفردية تخدير الزرد إلى شق في كتلة من الرغوة غارقة تريكين.
    2. تحت المجهر تشريح مع ضوء من أعلى عقد بلطف السمك مع يد واحدة وتوجيهه بطريقة تسمح بالوصول إلى الرأس من أعلى.
    3. من ناحية أخرى مع دفع G حقنة 30 (حقنة الأنسولين مع إبرة متكاملة) عموديا من خلال الجمجمة في المنطقة وسطي واحد نصف الكرة الدماغ الانتهائي (أرقام 1A-1B). نصفي لل telencephalon لإعادة مرئية من خلال الجمجمة. تأكد من أن الآفة قدم ليس أعمق من 2 مم (الشكل 1C). ملاحظة: من المستحسن بشدة لإدخال الآفة دائما في نفس نصف الكرة للتخفيف من تحديد موقع الآفة عند تشريح الدماغ من الجمجمة.
    4. بعد عرضه لإصابة في الدماغ الانتهائي، ضع السمك في المياه العذبة الأسماك. الحفاظ على ما يصل الى 10 سمكة في قفص 2 L الماوس مملوءة بالماء الأسماك للتعافي وربط قفص الماوس لنظام تدفق المياه. ملاحظة: معدل البقاء على قيد الحياة هو عادة ~ 97٪ إذا الأسماك يتمتعون بصحة جيدة وأجريت تجارب أخرى لا مع السمك قبل. إضافة المضادات الحيوية إلى الماء الأسماك ليست ضرورية. بعد الشفاء، والأسماك تتصرف عادة: أنها تسبح، والأعلاف، ورفيقة.

2. تحليل تأثير إصابة الدماغ الانتهائي

  1. تشريح الدماغ وتثبيت
    1. إعادة تخدير الأسماك استردادها عند نقاط زمنية مختلفة بعد الآفة (typicallذ، 1، 3، 5، و 14 يوما إضافة الآفة (قرض سياسات التنمية)) مع 0.02٪ (ث / ت) تريكين على النحو الوارد أعلاه والموت ببطء لهم من خلال وضعها في الماء المثلج لمدة 5 دقائق.
    2. وضع الأسماك على المناديل الورقية غارقة في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وفصل الرأس عن الجسم عن طريق قطع وراء الخياشيم مع مقص حاد.
    3. إبقاء رؤساء في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق للسماح النزيف. ملاحظة: هذا يستنزف الدم من الأنسجة، مما قد التشويش على المزيد من الخطوات في البروتوكول.
    4. إصلاح بين عشية وضحاها رؤساء في 4 درجات مئوية في بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في برنامج تلفزيوني أو 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة (RT).
    5. يغسل مرتين مع رؤساء ثابتة برنامج تلفزيوني 1X في طبق بتري.
    6. تشريح أدمغة بعناية في برنامج تلفزيوني 1X تحت المجهر تشريح 23. الآفة عادة مرئية تحت المجهر تشريح. يجب التخلص من العقول دون آفة مرئية.
    7. نقل العقول في 2 مل أنابيب رد الفعل مليئة 1.5 مل 100٪ الميثانول (MeOH) وعكس أنابيب 5X قبل يحتضنهالهم في -20 درجة مئوية لمدة 16 ساعة على الأقل. ملاحظة: يمكن أن تظل العقول لعدة أشهر في MeOH في -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها لالمناعية أو التهجين في الموقع.
  2. إعداد الأنسجة لالمناعية
    1. ترطيب العقول من خلال سلسلة الميثانول تنازلي في 2 مل أنابيب بلاستيكية (بالتتابع 75٪ MeOH (1X PBS، 0.1٪ توين 20 = PTW)؛ 50٪ MeOH، 25٪ MeOH احتضان العقول (15 أدمغة / 2 مل أنابيب رد الفعل ) لمدة 5 دقائق في كل حل.
    2. غسل أدمغة في PTW لمدة 5 دقائق. تكرار 4X مع PTW الطازجة.
  3. التضمين من العقول لباجتزاء
    1. لتضمين، ونقل أدمغة من الأنبوب رد فعل 2 مل في PTW في تجاويف صينية البولي ايثيلين صب كوب مع الماصة نقل (5 مم).
    2. إعداد 2٪ الاغاروز (الصف DNA) في برنامج تلفزيوني 1X في دورق مخروطي. تسخينها في الميكروويف في 600 W حتى يذوب تماما الاغاروز. تحضير 50 ​​مل لمدة 10 العقول. اسمحوا عشره تبريد الاغاروز أسفل لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. الحفاظ على الاغاروز على كتلة التدفئة قبل ساخنة (60 درجة مئوية)، في حين تضمين العقول من أجل منع التصلب.
    3. إزالة برنامج تلفزيوني 1X من العفن تحتوي على الدماغ واحد باستخدام ماصة باستور (1 مم). يجب الحرص على عدم تلف الدماغ.
    4. صب الاغاروز في القالب وملئه بالكامل. ثم استخدام إبرة تشريح لدوامة الدماغ في الاغاروز ليغسل PTW مما يجعل من الاسهل لتضمين الدماغ.
    5. توجيه الدماغ في الجانب البطني العفن أسفل، حتى الجانب الظهري ووضعه على التوالي.
    6. السماح للالاغاروز يبرد. لسرعة التبريد، ووضع القالب على الجليد. كرر الخطوات.
    7. تكرار 2.3.3-2.3.6 لجميع العقول.
  4. تقليم الاغاروز كتلة
    1. باستخدام إبرة تشريح، تخرج كتلة agarose.
    2. بشفرة حلاقة حادة، وقطع الاغاروز في نهاية الخلفي من الدماغ. تأكد من هذه الطائرة موازية للالشركة المصرية للاتصالاتlencephalon.
    3. قطع الاغاروز في نهاية الأمامي من الدماغ. ثم الوجه كتلة بحيث يقف على متن الطائرة الخلفي.
    4. إزالة الزائدة من الاغاروز عن طريق خفض بالتوازي مع الظهرية الدماغ وجوانب بطني. ثم الوجه الدماغ مرة أخرى بحيث انها تقع على جانبها بطني.
    5. خفض كتلة لمثلث مبتورا التي يقع لل telencephalon في طائرة أصغر (الشكل 2).
  5. إعداد Vibratome لباجتزاء
    1. إعداد vibratome وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. استخدام شفرة حلاقة جديدة واستبدالها بعد 10 العقول.
    2. ملء حوض الاستحمام العازلة مع برنامج تلفزيوني 1X إلى المستوى الذي يصل فقط الجزء السفلي من النصل.
    3. وضع نقطة صغيرة من superglue على الجزء العلوي من القرص عينة من vibratome.
    4. وضع بعناية الطائرة التي يقع الخلفي للدماغ على superglue. سوف الغراء تتصلب في أقرب وقت كما هو الحال في اتصال مع برنامج تلفزيوني 1X فيالحمام عازلة vibratome.
    5. إدراج القرص العينة مع عينة في علبة عازلة باستخدام مناور من مشراح.
    6. استخدام مناور لتدوير القرص العينة إلى الموضع المطلوب. توجيه كتلة في الحمام عازلة في الطريقة التي يقع لل telencephalon فقط تحت السطح، مع الجزء الظهري من المخ التي تواجه النصل. ثم تشديد scrw مع 3 مم مفتاح ألين وإزالة مناور. ملاحظة: يجب أن لا يكون موجودا المسمار لقط أو أحد الأجهزة تحامل على مدى الفجوة في القرص العينة؛ في هذه المواقف تحامل القرص العينة غير ممكن.
  6. باجتزاء الدماغ
    1. إعداد 24 لوحة جيدا لجمع المقاطع. في الدماغ لتكون مقطوع، وملء واحدة بشكل جيد مع 1 مل من حجب العازلة (0.1٪ (ت / ت)، 1٪ (ت / ت 10٪ توين 20، 0.2٪ (ث / ت) ألبومين المصل البقري (BSA)) سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) في برنامج تلفزيوني).
    2. بدء باجتزاء في 50 ميكرون سمك، سرعة 1 ملم / ثانية، و 70 هرتز الترددباستخدام مشراح تهتز.
    3. استخدام فرشاة الاصطناعية (1 ملم) لالتقاط شرائح رقيقة من الاغاروز لأنها تأتي من النصل وجمعها في 24 لوحة جيدا.
  7. المناعية على أقسام Vibratome
    1. حجب المواقع غير محددة وملزمة لمدة 1 ساعة على RT في عرقلة العازلة (0.1٪ (ت / ت) 10٪ توين 20، 0.2٪ (ث / ت) BSA، 1٪ (V / V) DMSO في برنامج تلفزيوني).
    2. إزالة طاف وإضافة 250 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخفف في عرقلة العازلة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. بدلا من ذلك، احتضان الأجسام المضادة الأولية لمدة 2 ساعة على RT. ثم يغسل 3X لمدة 10 دقيقة في PTW. ملاحظة: للحصول على بكنا تلطيخ استخدام 1:400 التخفيف (الماوس المضادة للبكنا لمزيد من التفاصيل انظر الجدول مواد). يمكن المحتضنة الأجسام المضادة الأولية متعددة في نفس الوقت.
    3. احتضان المقاطع في الضد الثانوية لمدة 2 ساعة على RT ثم يغسل 3X لمدة 10 دقيقة في PTW. ملاحظة: 1:1،000 التخفيف في PTW، لمزيد من التفاصيل انظر الجدول من المواد. يمكن المحتضنة الأجسام المضادة الثانوية متعددة في نفس الوقت.
  8. RNA الدماغ الكبار في الموقع التهجين (بدلا من ذلك لالمناعية)
    1. تشريح الدماغ وتثبيت (نفس الإجراء لالمناعية):
      1. التهجين من التحقيق.
      2. ترطيب العقول في 2 مل أنابيب رد الفعل كما هو موضح لالمناعية.
      3. احتضان العقول في بروتين K (ProtK؛ 10 ميكروغرام / مل اضرب النهائي) في PTW لمدة 30 دقيقة. بعد فترة حضانة إزالة ProtK / PTW وإصلاح العقول مرة أخرى لمدة 20 دقيقة في BT-فيكس (PFA 4٪، 4٪ سكروز، 0.12 مم CaCl 2، 77 ملي نا 2 هبو 4، 23 ملم ناه 2 ص 4).
      4. غسل أدمغة 5X لمدة 5 دقائق في PTW (0.1٪ (V / V) توين-20 في برنامج تلفزيوني).
      5. إزالة PTW وشطف الأدمغة في 500 ميكرولترHYB العازلة (50٪ (ت / ت) الفورماميد منزوع الأيونات، 5X SSC، 500 ميكروغرام / مل الحمض الريبي النووي النقال الخميرة، و 50 ميكروغرام / مل الهيبارين، 0.1٪ توين 20، 9 ملي citricacid). الانتظار حتى العقول تنزل الى قاع الأنبوب ثم تجاهل طاف وإضافة 500 ميكرولتر من العازلة HYB نظيفة واحتضان عند 65-70 درجة مئوية لمدة 3-4 ساعة.
      6. تمييع التحقيق RNA إلى 1:200 1:400 أو (اعتمادا على التحقيق) في الحجم النهائي 400 ميكرولتر من العازلة HYB. تسخين التحقيق RNA المخفف عند 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      7. إزالة طاف من العقول وإضافة التحقيق الحمض النووي الريبي، واحتضان في 65-70 درجة مئوية (O / N). وينبغي prewarmed جميع الحلول غسل العازلة والاحتفاظ بها في 70 درجة مئوية.
    2. وضع العلامات
      1. غسل أدمغة في 65-70 درجة مئوية (خلال جميع الخطوات غسل 4) مع 500 ميكرولتر من غسل العازلة 1 (50٪ الفورماميد، 1X SSC، 0.05٪ توين 20) مرتين لمدة 30 دقيقة. استبدال العازلة 1 بواسطة العازلة 2 (2X SSC، 0.1٪ توين 20)، واحتضان لمدة 15 دقيقة. إزالة العازلة 2 وغسل أدمغة في المخزن 3 (SSC 0.2x و 0.1٪ توين 20) FOص 30 دقيقة، كرر هذه الخطوة مرتين 2. استبدال عازلة عازلة 3 في 4 (SSC 0.1X، 0.05٪ توين 20 في PTW)، واحتضان لمدة 5 دقائق.
      2. إزالة طاف ويغسل لمدة 5 دقائق في 500 ميكرولتر من PTW في RT.
      3. تضمين العقول في 2٪ الاغاروز (في برنامج تلفزيوني 1X) وقطع vibratome أقسام (50-100 ميكرون) كما هو موضح لالمناعية.
      4. غسل 1X لمدة 5 دقائق في 500 ميكرولتر عرقلة العازلة (1X PBS، 0.1٪ توين 20، 0.2٪ (ث / ت) BSA، 1٪ (V / V) DMSO).
      5. إزالة طاف وإضافة 500 ميكرولتر العازلة حظر لمدة 2 ساعة على RT.
      6. إزالة طاف وإضافة 300 ميكرولتر المضادة للحفر الأجسام المضادة AP جانب والمخفف 1:4،000 في عرقلة العازلة.
      7. احتضان س / ن في 4 درجات مئوية.
    3. NBT / BCIP تلطيخ
      1. غسل 5X لمدة 15 دقيقة مع PTW عازلة في RT.
      2. شطف 1X العازلة في تلطيخ. يغسل مرتين في 5 دقائق العازلة تلطيخ (100 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 9.5، 50 ملي MgCl 2، 100 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.1٪ توين 20).
      3. إزالة طاف وصمة عار مع 500 μالحل ل تلطيخ (3.5 ميكرولتر من 4 تترازوليوم كلوريد نتروبلو (NBT) و 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl فوسفات (BCIP) لكل 1 مل العازلة تلطيخ).
      4. وقف تلطيخ من قبل الشطف 3X إلى 5x مع PTW.
  9. تصاعد الأقسام
    1. تحميل المقاطع على الشرائح باستخدام، غير الفلورسنت المتوسطة المتزايدة للذوبان في الماء (انظر الجدول مواد).
    2. الحفاظ على الشرائح في الثلاجة على 4 درجات مئوية. ملاحظة: إن تلطيخ مستقرة لعدة أسابيع أو حتى أشهر.
    3. تحليل الشرائح تحت المجهر مركب أو متحد البؤر.

Representative Results

باستخدام سير العمل الموضحة في هذه المقالة، وقدم آفة في النصف الأيمن من الدماغ الانتهائي على الزرد الكبار (أرقام 1A-1B). وجرح الصحيح يؤدي إلى قناة الآفة التي تمتد من ظهري لبطني من خلال درع التثبيت كاملة من لل telencephalon (الشكل 3C). وينبغي أن يقتصر الآفة إلى واحدة من نصفي الكرة الأرضية، وينبغي ألا عبور البطين وسطي. قناة الآفة مرئيا مع المجهر حقل مشرق (الشكل 3C) وسوف تلتئم بعد حوالي 35 يوما 15.

سبق ان عرضه أنه بعد اصابة في التنظيم تتكون من الخلية المتكاثرة مستضد النووي (PCNA؛ الشكل 3A) وS100β (الشكل 3B) في 3-7 قرض سياسات التنمية هو كشفها بواسطة المناعية 15. تلطيخ من بكنا وS100β هو التداخل، مشيرا الى انتشار الخلايا الدبقية شعاعي.

Furthermore، من أجل تصور خلايا دبقية قليلة التغصن السلائف (يجد OPCs)، تم إجراء فحص طعنة الجرح على تيراغرام (olig2: EGFP) الأسماك 24. على تلطيخ مع الأضداد المضادة للGFP، وتراكم يجد OPCs على مقربة من القناة الآفة قابلا للاكتشاف (الشكل 3D). هذا التراكم هو عابر، وليس لوحظ مجموعات OPC بعد الآن في 35 DPL 15.

إذا لم يتم عرض الآفة بشكل صحيح، فإن القناة الآفة لا تكون مرئية، وسوف يصل تنظيم بكنا وS100β أو تراكم يجد OPCs لا تكون قابلة للكشف. بكنا هو علامة الأكثر حساسية للإصابة الدماغ. من أجل التحقق من كفاءة الجرح طعنة واستبعاد أن كلا نصفي الكرة الأرضية والجرحى، فمن المستحسن دائما لصبغ المقاطع مع الأجسام المضادة لمكافحة PCNA. في آفة قدم بشكل صحيح، يجب أن يكون بكنا بشكل كبير (يصل إلى 4 أضعاف 15) في واحدة فقط من نصفي الكرة الأرضية التنظيم الأعلى. رغم أنه في معظم الحالات، هويكفي فقط استخدام الجانب المقابل unlesioned باعتبارها الرقابة الداخلية لرصد التغيرات في التعبير الجيني، فإنه يوصى بشدة مقارنة التعبير الجيني في نصف الكرة التحكم مع التعبير في نصفي الكرة الدماغ الانتهائي من العقول النوع البري. بهذه الطريقة، يمكن أن يتم الكشف عن أية تأثيرات جهازية الآفة على التعبير الجيني التي من شأنها أن تؤثر على كل من نصفي الكرة الأرضية.

طعنة الجرح فحص بالاشتراك مع شاشة منهجية التعبير عن المنظمين النسخ (TRS) (25 وشميت وآخرون، غير منشورة) يمكن أن تستخدم أيضا لتحديد الجينات TR مع دور محتمل في تكوين الخلايا العصبية والتجديد (أرقام 4A-4C).

وقد حدد هذا النهج عدد من العوامل التي يتم التعبير عنها في الدماغ الانتهائي والذي هو التعبير خصيصا التنظيم ردا على إصابة (الشكل 4A-C).

الشكل 1. تمثيل تخطيطي من الكبار الزرد الدماغ الانتهائي طعنة جرح. أ) يتم دفع إبرة الأنسولين حقنة من خلال الجمجمة من الزرد الكبار لتوليد اصابة في الدماغ الانتهائي. الأبيض متقطع يمثل خط الحدود بين نصفي الدماغ الانتهائي والصليب الأخضر يشير إلى موقف طعنة الجرح. B) عرض الظهرية من الدماغ الزرد الكبار. يشار إلى مناطق الدماغ الرئيسية. الصليب الأخضر يبين الموقف من الاصابة. C) التي يسببها غيض من الإبرة، والذي يعمل على إحداث إصابة الدماغ الانتهائي، يقيس 2 مم. البصلة الشمية (OB)، الدماغ الانتهائي (الهاتف) والسقف البصري (بعد التمديد).

الرقم 2
الشكل 2. Sالتمثيل chematic من الدماغ الزرد الكبار في كتلة الاغاروز قلص قبل باجتزاء vibratome. الأمامي متروك. البصلة الشمية (OB)، الدماغ الانتهائي (الهاتف)، السقف البصري (بعد التمديد)، المخيخ (CB) والنخاع (م). شريط مقياس: 500 ميكرون.

الرقم 3
الرقم 3. ردود التجديدي طعن إصابة الجرح. الدماغ الزرد م) الكبار في 5 أيام بعد الآفة (قرض سياسات التنمية). AB) وبكنا التكاثري علامة (A) وعلامة الدبقية شعاعي S100β (B) ما يصل التنظيم في منطقة البطين (السهام) عند جرح طعنة. (C) وقناة الآفة مرئيا تحت إضاءة حقل مشرق (السهام). يشار إلى منطقة البطين من الخط الأخضر. (D) خلايا دبقية قليلة التغصن السلائف (olig2: EGFP +) تتراكم في موقع الآفة (السهام). شريط مقياس: 200 ميكرون. في جميع لوحات، النصف الأيمن هو نصف الكرة lesioned. الظهرية متروك. خط متقطع في ألف إلى دال يشير إلى الحدود بين طيلسان البابا أو الأسقف وsubpallium.

الرقم 4
الشكل 4. مثال على الجينات تصل التنظيم ردا على طعن الاصابة. لاحظ يصل التنظيم القوي (الأسهم) من eomesa (A، B) وsox4a (C) التعبير مرنا في نصف الكرة الدماغ الانتهائي الحق (نصف الكرة طعن) كما رصدت بواسطة الموقع التهجين في 5 قرض سياسات التنمية في. نصف الكرة المخية الأيسر هو لم يصب وبمثابة السيطرة. (ب) المعارض التكبير أعلى من المنطقة الظهرية من الدماغ الانتهائي A. الظهرية متروك. شريط مقياس: 200 ميكرون لA و C و 55 ميكرومتر لب.خط متقطع في A و C يشير إلى الفصل بين طيلسان البابا أو الأسقف وsubpallium. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

المختصرات
AP الفوسفاتيز القلوية
BCIP 5-برومو-4-كلورو 3'-indolyphosphate
BSA ألبومين المصل البقري
CNS الجهاز العصبي المركزي
حفر Digoxygenin
DMSO ثنائي ميثيل سلفوكسيد
قرض سياسات التنمية آخر أيام الآفة
eomesa Eomesodermin homolog ل
GFAP ييفي الدبقية البروتين الحمضية
ساعة ساعة
HYBالعازلة العازلة التهجين
ISH التهجين في الموقع
MeOH الميثانول
NBT نتروبلو نيترو الأزرق
يجد OPCs خلايا دبقية قليلة التغصن السلائف
برنامج تلفزيوني الفوسفات مخزنة المالحة
بكنا تنتشر الخلايا مستضد النووية
PFA بارافورمالدهيد
ProtK بروتين K
PSA-NCAM Polysialylated العصبية جزيء التصاق الخلية
PTW PBS، 0.1٪ توين 20
RNA حمض النووي الريبي
RT درجة حرارة الغرفة
SGZ منطقة جزئي التحبب
sox4a SRY مربع تحتوي على الجين 4A
SSC سيترات الصوديوم المالحة
SVZ منطقة Subventricular
TRS المنظمين النسخ

Discussion

نحن هنا وصف الأسلوب للحث على إصابة الدماغ الانتهائي عن طريق دفع الإبرة من خلال الجمجمة من الزرد الكبار، وتحليل رد فعل الخلوية والجزيئية لهذه الإصابة من قبل المناعية والتهجين في الموقع. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على النهج القائمة الأخرى هو بساطته والسرعة والكفاءة من حيث التكلفة. لذلك، هذه التقنية، والذي يسمح إنتاج العديد من أدمغة المصابين في وقت قصير، ويمكن الجمع بسهولة مع نطاق واسع في الموضع الشاشة التهجين لتحديد الجينات التي لها دور في تجديد وتكوين الخلايا العصبية.

عمر الزرد الكبار التي تتم الإصابة أمر بالغ الأهمية. إذا كان السمك تكون أقدم من 1.5 سنوات، والجمجمة من الصعب جدا وأنه من الممكن أن يتم دفع الجمجمة أو كسر أسفل بدلا من مثقب نظيفة. في المقابل، في الأسماك الأصغر سنا (أصغر من 4 أشهر)، لا يزال هناك الكثير من الخلايا العصبية مستمرة، والتي قد لياد إلى نتائج إيجابية كاذبة بشأن تكوين الخلايا العصبية على رد الفعل.

آخر خطوة حاسمة في هذا النهج هو للتحقق من كفاءة الجرح طعنة واستبعاد أن كلا نصفي الكرة الأرضية والجرحى. هذا يمكن رصدها من قبل تلطيخ المقاطع مع الأجسام المضادة لمكافحة PCNA. في آفة قدم بشكل صحيح، يجب أن يكون بكنا بشكل ملحوظ التنظيم في واحدة فقط من نصفي الكرة الأرضية.

من المهم أن نضع في اعتبارنا أن الإصابة الميكانيكية الناجمة سيكون لها العديد من الآثار الجانبية مثل الاجتثاث غير محددة الخلايا، وزيادة موت الخلايا بسبب انحطاط الثانوية، والتهاب وتدمير حاجز الدم في الدماغ، والضرر من منطقة البطين وكما ممكن نتيجة لتدفق السائل النخاعي في الدماغ حمة. ومع ذلك، يبدو أن الأسماك الجرحى يعانون القليل جدا من الإصابات. في غضون 2 دقيقة هم السباحة الحرة مرة أخرى ويتم استعادة سلوك التغذية الطبيعية في غضون 4 ساعة. بعد 3 أسابيع طnjury هو شكليا غير مرئية بعد الآن. في أيدينا، من عدة مئات العمليات الجراحية أننا لم نفقد سمكة واحدة على الرغم من أن كان لدينا معدل الإصابة بنسبة 100٪ وفقا لتقييم الأنسجة في 5 أيام آخر الآفة.

في السنوات الأخيرة تم تطوير تقنيات أخرى مثل النهج المعدلة وراثيا في الزرد لإنتاج أنسجة أو نوع من الخلايا الاجتثاث محددة 2. على الرغم من أن هذه التقنيات هي أنيقة جدا والحد الأدنى الغازية لأنها تستند إلى توليد بنيات الحمض النووي معقد وإنشاء العديد من خطوط المعدلة وراثيا الزرد مستقرة والتي يمكن أن تكون شاقة للغاية وتستغرق وقتا طويلا. وبالتالي، نهج الميكانيكية البسيطة مثل الفحص الموصوفة في هذا البروتوكول تظل أداة مهمة لدراسة الخلايا العصبية في الدماغ الكبار والتجدد.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tricaine Sigma 335.2
10x DPBS (-/-) Life technologies 14200-083
30 G syringe (Omnican 40) B.Braun Melsungen 916162
Polyethylene molding cup tray  Polysciences, Inc 17177C-3
PeqGOLD Universal Agarose  Peqlab 35-1020
Bovine serum albumin Biochrom W 2835919108
Aqua Poly/Mount Polysciences, Inc 18606-20
Tween 20 Carl Roth 9127.1
DMSO Carl Roth A994.2
Dissection needle Carl Roth KX93.1
Paraformaldehyde Carl Roth 335.2
Loctite 414 Schöffler und Wörner 06 1362 0020
Glass slides Labonord 5305103
Cover slips 24 x 60 mm Labonord 5305060
Petri dishes, 94 mm Greiner bio-one 632180
Falcon tubes, 15 ml Greiner bio-one 188261
24-well plate Greiner bio-one 662160
Anti-S100 (1:500) Dako Z031101-2
Anti-PCNA (1:400) Dako M087901
Anti-GFP (1:1,000) Aves Labs GFP-1020
anti-Dig AP-coupled antibody  Roche Diagnostics 11093274910
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP)  Roche Diagnostics 1383221
4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT)  Roche Diagnostics 1383213
Proteinase K Roche Diagnostics 1092766
Polyethylene molding cup tray  Polysciences 17177C-3
Vibratome VT1000S Leica
Confocal microscope Sp5 DM6000 Leica
Dissecting microscope Nikon SMZ 645 Nikon
24-well flat bottomed tissue culture plates  Falcon catalog  353226
Student Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 91150-20
Surgical scissors Fine Science Tools 91460-11
Danio rerio Tg(olig2:EGFP) Shin et al.24
Danio rerio WT strains (e.g., AB2O2)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
  2. Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72, 429-461 (2012).
  3. Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis. Nat Rev Neurosci. 12, 88-104 (2011).
  4. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32, 638-647 (2009).
  5. Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Dev. 8, 3 (2013).
  6. Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the central nervous system of teleost fish. Eur J Neurosci. 34, 917-929 (2011).
  7. Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. Teleost fish as a model system to study successful regeneration of the central nervous system. Curr Top Microbiol Immunol. 367, 193-233 (2013).
  8. Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295, 278-293 (2006).
  9. Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Dev Biol. 295, 263-277 (2006).
  10. Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain. J Comp Neurol. 488, 290-319 (2005).
  11. Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29, 745-757 (2007).
  12. Hinsch, K., Zupanc, G. K. Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis. Neuroscience. 146, 679-696 (2007).
  13. Lindsey, B. W., Darabie, A., Tropepe, V. The cellular composition of neurogenic periventricular zones in the adult zebrafish forebrain. J Comp Neurol. 520, 2275-2316 (2012).
  14. Marz, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58, 870-888 (2010).
  15. Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240, 2221-2231 (2011).
  16. Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223, 131-147 (2013).
  17. Ayari, B., El Hachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon. J Neurotrauma. 27, 959-972 (2010).
  18. Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis. Glia. 60, 343-357 (2011).
  19. Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Dis Model Mech. 5, 200-209 (2012).
  20. Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Dev Cell. 23, 1230-1237 (2012).
  21. Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138, 4831-4841 (2011).
  22. Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338, 1353-1356 (2012).
  23. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
  24. Shin, J., Park, H. C., Topczewska, J. M., Mawdsley, D. J., Appel, B. Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics. Methods Cell Sci. 25, 7-14 (2003).
  25. Armant, O., et al. Genome-wide, whole mount in situ analysis of transcriptional regulators in zebrafish embryos. Dev Biol. 380, 351-362 (2013).

Tags

علم الأعصاب، العدد 90، الزرد، تكوين الخلايا العصبية الكبار، الدماغ الانتهائي التجديد، طعنة، الجهاز العصبي المركزي، الخلايا الجذعية العصبية الكبار
طعنة الإصابة بالجروح من اسماك الزرد الكبار الدماغ الانتهائي: طريقة المعنية بالتحقيق في تكوين الخلايا العصبية والدماغ الفقارية التجديد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schmidt, R., Beil, T., Strähle, … More

Schmidt, R., Beil, T., Strähle, U., Rastegar, S. Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration. J. Vis. Exp. (90), e51753, doi:10.3791/51753 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter