Abstract
Peixe-zebra adulto tem uma incrível capacidade de regenerar seu sistema nervoso central após a lesão. Para investigar a resposta celular e os mecanismos moleculares envolvidos no peixe-zebra adulto sistema nervoso central (SNC) de regeneração e reparo, foi desenvolvido um modelo de peixe-zebra de lesão telencefálico adulto.
Nesta abordagem, podemos gerar manualmente uma lesão, empurrando uma seringa de agulha de insulina para o telencéfalo adulto zebrafish. Em diferentes dias de lesões post, peixe são sacrificados, seus cérebros são dissecados e corados por imuno-histoquímica e / ou hibridização in situ (ISH) com marcadores apropriados para observar a proliferação celular, gliogenesis e neurogênese. O hemisfério contralateral não lesionado serve como um controle interno. Este método combinado, por exemplo, com RNA profundo seqüenciamento pode ajudar a tela de novos genes com um papel em zebrafish neurogênese adulta telencéfalo, regeneração e reparo.
Introduction
Mamíferos têm uma capacidade muito limitada para gerar novos neurônios durante a vida adulta, e neurogênese adulta no cérebro é mais restrita a duas regiões telencefálicos situados na zona subventricular (SVZ) dos ventrículos laterais, ea zona subgranular (SGZ) do dentado circunvolução do hipocampo 1. Mamíferos também não pode reparar os danos do cérebro causada por doenças neurodegenerativas, acidente vascular cerebral ou lesões, de forma eficiente. Neurónios perdidos não são substituídos e, em vez da proliferação de diferentes tipos de células gliais, incluindo os astrócitos, micróglia, oligodendrócitos e é observado. Como consequência deste processo proliferativo chamado gliose reactiva, o tecido cerebral ferido é vedada pela formação de uma cicatriz glial, que inibe a regeneração axonal neuronal e 2-4.
Em contraste com os mamíferos, peixes teleósteos, como o peixe-zebra formar novos neurônios abundantemente em estágios adultos e têm um alto regenerativa e proliferative potencial para reparar lesões do sistema nervoso central 2,5-7. O cérebro adulto zebrafish contém 16 nichos de células estaminais neurais distintos que geram um grande número de novos neurónios, durante toda a vida de 8-11. Neurônios nascidos nessas zonas específicas de proliferação do cérebro adulto zebrafish migrar para suas áreas-alvo, onde eles vão amadurecer e integrar as redes neuronais existentes 8,10,12-15.
Entre as zonas de progenitoras identificados em peixes-zebra adultos, a zona ventricular telencefálicos é um dos nichos de células estaminais neuronais, mais estudados. Células neste nicho progenitor pode ser classificada em três tipos distintos quanto à sua morfologia, a taxa de divisão e expressão de diferentes marcadores glial ou neuronal. Tipo I e tipo II são células da glia radial como células que possuem processos longos. Eles expressam marcadores de células-tronco, incluindo GFAP, nestin e S100β. O tipo I de células não proliferam enquanto que células do tipo II proliferate lentamente, como evidenciado pela sua expressão de marcadores de proliferação, tais como antigénio de proliferação celular nuclear (PCNA) e a incorporação de análogos desoxythymidine. As células do tipo III estão rapidamente dividindo células que estão empenhados em tornar progenitores neurais e expressar genes marcadores neurais, tais como PSA-NCAM 5,16.
Embora as capacidades regenerativas de peixes teleósteos estão bem documentados, apenas poucas publicações têm descrito e investigado em detalhe os mecanismos celulares e moleculares envolvidos na regeneração neuronal no telencéfalo adulto em resposta à lesão 15,17-22. Para decifrar os mecanismos implicados no adulto zebrafish regeneração do sistema nervoso central e reparação e para entender as semelhanças e as diferenças entre a neurogênese constitutiva e regenerativa, desenvolvemos um modelo de peixe-zebra de lesão telencefálico adulto. Aqui, vamos descrever visualmente como gerar uma lesão em um dos hemisph telencefálicoeres com a ajuda de uma agulha de seringa, mantendo a lateral não lesionado contralateral como controlo interno. Também vamos mostrar como monitorar mudanças sobre lesão na proliferação celular e expressão gênica por imuno-histoquímica e em ensaios de hibridização in situ.
Protocol
Zebrafish foram mantidos nas instalações do Instituto de Toxicologia e Genética (ITG) em Karlsruhe Institute of Technology (KIT) peixes. Experimentos em animais foram realizados de acordo com as normas alemãs de proteção animal e foram aprovados pelo Governo de Baden-Württemberg, Regierungspräsidium Karlsruhe, Alemanha (Aktenzeichen 35-9185.81/G-272/12 'Adulte Neurogenese').
1. Gerando uma facada no telencéfalo
- Anestesia
- Para preparar uma solução de estoque de tricaína (éster etílico do ácido 3-amino, também chamado de acetato de 3-aminobenzoato) utilizar 400 mg de pó tricaina e dissolvê-lo em 97,9 ml de água e 2,1 ml de tampão Tris 1 M / HCl (pH 9). Ajustar o pH a 7. Faça alíquotas de 5 ml e armazená-las a -20 ° C até utilização.
- Transferir um número adequado de peixe-zebra 0,5-1 anos de idade a partir de seus tanques em gaiolas de plástico do mouse. Nota: O crânio de um peixe-zebra adulto em cerca de 12meses de idade é ainda relativamente macios e podem ser facilmente perfurado com uma agulha (ver secção 1.2.3 e Figura 1A).
- Para anestesiar o peixe-zebra adultos, combinar 5 ml tricaína (solução estoque) numa gaiola de plástico com cruzamento ~ 100 ml de água do tanque de peixes limpo (concentração final de tricaina 0,02% (w / v) tricaina).
- Incubar os peixes nos anestésicos até que eles não se movem mais (45-60 seg.)
- Lesão telencéfalo
- Local indivíduo anestesiado zebrafish em uma fenda em um bloco de espuma encharcada de tricaina.
- Sob um microscópio de dissecação com a luz do alto segurar delicadamente o peixe com uma mão e orientá-la de uma forma que permite o acesso à cabeça de cima.
- Com a outra mão empurrar uma seringa de 30 G (seringa de insulina com agulha integrado) verticalmente através do crânio na região medial de um hemisfério telencefálico (Figuras 1A-1B). Os hemisférios do telencéfalo de umre visível através do crânio. Certifique-se de que a lesão não é introduzido mais profundo do que 2 mm (Figura 1C). Nota: É altamente recomendado para introduzir a lesão sempre no mesmo hemisfério para facilitar a identificação do local da lesão quando dissecar o cérebro fora do crânio.
- Depois de apresentar a lesão telencefálico, coloque o peixe em água de peixe fresco. Mantenha-se 10 peixes em uma gaiola de 2 L rato cheio de peixes de água para a recuperação e se conectar a gaiola do rato para um sistema de fluxo de água. Nota: A taxa de sobrevivência é geralmente ~ 97% se os peixes estão saudáveis e sem outros experimentos foram realizados com o peixe antes. A adição de antibióticos para o peixe de água não é necessária. Após a recuperação, os peixes se comportam normalmente: eles nadam, alimentação, e companheiro.
2. Analisando o efeito da lesão telencefálico
- Cérebro Dissecção e Fixação
- Re-anestesiar os peixes recuperados em diferentes pontos de tempo após a lesão (typically, 1, 3, 5, e 14 dias após a lesão (DPL)) com 0,02% (w / v) tricaina como acima e eutanásia, colocando-os em água gelada durante 5 minutos.
- Coloque o peixe em um lenço de papel embebido em tampão fosfato (PBS) e separar a cabeça do corpo, cortando atrás das guelras com uma tesoura afiada.
- Manter as cabeças em 1x PBS, durante 5 minutos, a fim de permitir que o sangramento. Nota: Este drena o sangue do tecido, o que pode perturbar outras medidas no protocolo.
- Fixar as cabeças durante a noite a 4 ° C em paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS ou 4 horas à temperatura ambiente (RT).
- Lavar as cabeças fixas duas vezes com PBS 1x numa placa de petri.
- Dissecar cérebros cuidadosamente em 1x PBS sob um microscópio de dissecação 23. A lesão é normalmente visível sob o microscópio de dissecação. Cérebros sem lesão visível deve ser descartada.
- Transferir os cérebros em dois tubos de reacção ml cheios com 1,5 ml de 100% de metanol (MeOH) e inverter os tubos antes da incubação de 5xlas a -20 ° C durante pelo menos 16 horas. Nota: Os cérebros pode ser mantido durante vários meses em MeOH à temperatura de -20 ° C até serem necessários para a imuno-histoquímica, ou hibridação in situ.
- Preparação de tecidos para Imunohistoquímica
- Re-hidratar os cérebros através de uma série descendente de metanol em 2 ml de tubos de plástico (sequencialmente 75% MeOH (1 x PBS, 0,1% de Tween-20 = PTW);. De 50% de MeOH, 25% de MeOH Incubar os cérebros (15 cérebros / 2 ml com tubos de reacção ) durante 5 minutos em cada solução.
- Lave os cérebros em PTW durante 5 min. Repita 4x com fresco PTW.
- Incorporação dos cérebros para Seccionamento
- Para a incorporação, transferir os cérebros a partir do tubo de reacção de 2 ml em PTW para dentro das cavidades de um tabuleiro de copo de moldagem de polietileno com uma pipeta de transferência (5 mm de diâmetro).
- Prepare a 2% de agarose (grau de ADN) em 1x PBS num frasco de Erlenmeyer. Aqueça no microondas a 600 W até que a agarose é dissolvido completamente. Preparar 50 ml de 10 cérebros. Vamos ªe agarose a arrefecer durante 3 minutos à temperatura ambiente antes do uso. Manter a agarose sobre um bloco de aquecimento pré-aquecida (60 ° C), enquanto que a incorporação de cérebro, a fim de evitar a solidificação.
- Remover o PBS 1x do molde contendo um cérebro utilizando uma pipeta de Pasteur (1 mm de diâmetro). Tenha cuidado para não danificar o cérebro.
- Despeje agarose no molde e preenchê-lo completamente. Em seguida, use uma agulha de dissecção a girar o cérebro da agarose para lavar o PTW, tornando mais fácil para incorporar o cérebro.
- Oriente o cérebro de bolor lado ventral para baixo, lado dorsal para cima e colocá-lo em linha reta.
- Deixe o agarose esfriar. Para resfriamento mais rápido, coloque o molde no gelo. Repetir passos.
- Repetir 2.3.3-2.3.6 para todos os cérebros.
- Corte do Bloco de agarose
- Usando uma agulha de dissecação, retire o bloco de agarose.
- Com uma lâmina afiada, corte a agarose na extremidade posterior do cérebro. Certifique-se que este plano é paralelo ao telencephalon.
- Cortar a agarose na extremidade anterior do cérebro. Em seguida, virar o bloco de modo que esteja no plano posterior.
- Remover o excesso de agarose por corte em paralelo com dorsal do cérebro e lados ventral. Em seguida, virar o cérebro de volta para que ele fique do seu lado ventral.
- Cortar o bloco a um triângulo truncado, em que o telencéfalo está localizado no plano menor (Figura 2).
- Preparando o Vibratome para Seccionamento
- Prepare vibratome acordo com as instruções do fabricante. Use uma nova lâmina de barbear e substituí-lo após 10 cérebros.
- Encher o banho tampão com 1x PBS para um nível que apenas atinge o fundo da lâmina.
- Coloque um pequeno ponto de supercola sobre o topo do disco de amostra de vibratome.
- Com cuidado, coloque o avião que está localizado posterior ao cérebro sobre a supercola. A cola vai endurecer logo que ele se encontra em contacto com o 1x PBSo banho de tampão vibratome.
- Insira o disco de amostra com a amostra na bandeja de tampão usando o manipulador do micrótomo.
- Use o manipulador para rodar o disco de amostra para a posição desejada. Orientar o bloco no banho de tampão de uma maneira que localiza o telencéfalo logo abaixo da superfície, com a parte dorsal da cabeça voltado para a lâmina. Em seguida, aperte o SCRW com uma chave Allen de 3 mm e remova o manipulador. Nota: O parafuso de fixação ou de um dos dispositivos de fixação não deve estar localizado sobre a abertura no disco de amostra; nestas posições de aperto do disco de amostra não é possível.
- Seccionamento do Cérebro
- Prepare uma placa de 24 poços para recolher as seções. Por cérebro a ser seccionado, preencher uma cavidade com 1 mL de tampão de bloqueio (0,1% (v / v), 10% de Tween-20, 0,2% (w / v) de albumina de soro bovino (BSA), 1% (v / v) dimetil-sulfóxido (DMSO) em PBS).
- Comece o corte em 50 mM espessura, 1mm / s de velocidade e freqüência de 70 Hzutilizando um micrótomo de vibração.
- Use uma escova sintética (1 mm) para pegar as fatias finas de agarose como eles saem da lâmina e coletá-los na placa de 24 poços.
- Imunohistoquímica em Vibratome Seções
- Bloquear sítios de ligação não específicos durante 1 h à TA, em tampão (0,1% (v / v), 10% de Tween 20, 0,2% (w / v) de BSA, 1% (v / v) de DMSO em PBS) de bloqueio.
- Remover o sobrenadante e adicionar 250 ul de anticorpo diluído em tampão de bloqueio, durante a noite a 4 ° C. Alternativamente, a incubação do anticorpo primário durante 2 horas à temperatura ambiente. Em seguida, lave 3x por 10 min em PTW. Nota: Para a coloração PCNA usar uma diluição 1:400 (mouse anti-PCNA Para mais detalhes veja a tabela de materiais.). Os anticorpos primários múltiplos podem ser incubadas, ao mesmo tempo.
- Incubar as secções em anticorpo secundário durante 2 h à RT, em seguida, lavar 3x durante 10 minutos em PTW. Nota: 1:1.000 diluição em PTW, para o detalhe veja tabela de materiais. Anticorpos secundários múltiplos podem ser incubadas, ao mesmo tempo.
- RNA cérebro adulto in situ Hybridization (alternativamente para imuno-histoquímica)
- Cérebro Dissecção e Fixação (mesmo procedimento que para imuno-histoquímica):
- Hibridização de sonda.
- Rehidratar cérebros em dois tubos de reacção ml como descrito por imuno-histoquímica.
- Incubar cérebros em proteinase K (ProtK;. 10 ug / ml de concentração final) em PTW durante 30 min. Após o tempo de incubação remover ProtK / PTW e fixar os cérebros novamente durante 20 min em BT-Fix (PFA a 4%, 4% de sacarose, 0.12 mM de CaCl2, 77 mM de Na 2 HPO 4, 23 mM de NaH 2 PO 4).
- Lavar cérebros 5x durante 5 minutos em PTW (0,1% (v / v) de Tween-20 em PBS).
- Remover PTW e lave o cérebro em 500 mLTampão HYB (50% (v / v) de formamida desionizada, 5x SSC, 500 ug / ml de tRNA de levedura, 50 ug / ml de heparina, 0,1% de Tween-20, 9 mM citricacid). Espere até que o cérebro afundar para o fundo do tubo, em seguida, descartar o sobrenadante e adicionar 500 ul de tampão HYB limpo e incubar a 65-70 ° C durante 3-4 horas.
- Dilui-se a sonda de RNA de 1:200 ou 1:400 (dependendo da sonda) em 400 ul de volume final de tampão HYB. Aquece-se a sonda de RNA diluído a 70 ° C durante 5 min.
- Remover o sobrenadante a partir de cérebros e adicionar a sonda de RNA, incuba-se a 65-70 ° C (S / N). Todas as soluções-tampão de lavagem deve ser pré-aquecida e mantida a 70 ° C.
- Labeling
- Lave os cérebros a 65-70 ° C (durante todas as quatro fases de lavagem) com 500 ul de tampão de lavagem 1 (50% de formamida, 1 x SSC, 0,05% Tween 20), duas vezes, durante 30 min. Substituir um tampão por tampão de 2 (2 x SSC, 0,1% de Tween 20), e incubar durante 15 min. Remover o tampão de lavagem 2 e cérebros em tampão 3 (0,2 x SSC, 0,1% de Tween 20) for 30 min, repita este passo 2 duas vezes. Substituir tampão 3 por intermédio 4 (0,1 x SSC, 0,05% de Tween 20 em PTW), incubar durante 5 min.
- Remover o sobrenadante e lava-se durante 5 minutos em 500 ul de PTW à TA.
- Cérebros incorporar em agarose a 2% (em PBS 1x) e cortar secções vibratome (50-100 um), como descrito para a imuno-histoquímica.
- Lavar 1x durante 5 minutos em 500 ul de tampão de bloqueio (1 x PBS, 0,1% de Tween-20, 0,2% (w / v) de BSA, 1% (v / v) DMSO).
- Remover o sobrenadante e adicionar 500 ul de tampão de bloqueio durante 2 horas à temperatura ambiente.
- Remover o sobrenadante e adicionar 300 ul de anti-Dig anticorpo acoplado a AP diluída 1:4.000 em tampão de bloqueio.
- Incubar o / n, a 4 ° C.
- NBT / BCIP Coloração
- Lavar 5x durante 15 min com tampão de PTW à TA.
- Lavar 1x em tampão de coloração. Lavar duas vezes 5 min em tampão de coloração (100 mM Tris / HCl pH 9,5, 50 mM de MgCl 2, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween-20).
- Remover o sobrenadante e mancha com 500 μl solução de coloração (3,5 ul de cloreto de tetrazólio 4-Nitroblue (NBT) e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) por 1 ml de tampão de coloração).
- Pare de coloração de lavagem 3 a 5 vezes com PTW.
- Cérebro Dissecção e Fixação (mesmo procedimento que para imuno-histoquímica):
- Montagem das Seções
- Montar as seções em slides usando um meio de montagem não fluorescente solúvel em água (consulte a tabela de materiais).
- Mantenha os slides na geladeira a 4 ° C. Nota: A coloração é estável durante várias semanas ou mesmo meses.
- Analisar os slides no âmbito de um composto ou um microscópio confocal.
Representative Results
Usando o fluxo de trabalho descrito neste artigo, a lesão foi introduzido no hemisfério direito do telencéfalo adulto zebrafish (Figuras 1A-1B). Um ferimento correcta leva a um canal que se estende a partir da lesão dorsal para ventral através de todo o palio do telencéfalo (Figura 3C). A lesão deve ser limitada a um dos hemisférios e não devem atravessar o ventrículo medial. O canal lesão é visível com microscopia de campo claro (Figura 3C) e será curado após aproximadamente 35 dias 15.
Foi anteriormente demonstrado que após o ferimento uma sobre-regulação de proliferação celular do antigénio nuclear (PCNA, Figura 3A) e S100β (Figura 3B) em 3 a 7 DPL é detectável por imuno-histoquímica 15. A coloração de PCNA e S100β é sobreposta, indicando a proliferação de células gliais radiais.
Furthermore, a fim de visualizar as células precursoras de oligodendrócitos (OPCs), um ensaio de facada ferida foi realizada na Tg (olig2: EGFP) de peixe 24. Após a coloração com um anticorpo anti-GFP, a acumulação de OPCs em estreita proximidade com o canal de lesão é detectável (Figura 3D). Esse acúmulo é transitória, e os clusters OPC não são mais observadas em 35 dpl 15.
Se a lesão não foi introduzida correctamente, o canal lesão não será visível, e aumento da regulação do PCNA e S100β ou acumulação de OPCs não será detectável. PCNA é o marcador mais sensível para lesões cerebrais. A fim de verificar a eficiência da facada e de excluir que os dois hemisférios são feridos, é altamente recomendável para sempre manchar as seções com um anticorpo anti-PCNA. Em uma lesão introduzida correctamente, PCNA deve ser significativamente sobre-regulada (até 4 vezes 15) em apenas um dos hemisférios. Embora na maioria dos casos, ésuficiente para usar apenas o lado não lesionado contralateral como controle interno para monitorar mudanças na expressão gênica, é altamente recomendável para comparar a expressão gênica no hemisfério controle com a expressão em hemisférios telencefálicos de cérebros de tipo selvagem. Deste modo, quaisquer efeitos sistémicos da lesão na expressão do gene que iria afectar os dois hemisférios podem ser detectados.
O ensaio de golpe de feridas em combinação com uma tela de expressão sistemática de reguladores da transcrição (TRs) (25 e Schmidt et al., Não publicado) pode também ser utilizado para identificar genes de TR, com um possível papel na neurogénese e regeneração (Figuras 4A-4C).
Esta abordagem foi identificado um número de factores que são expressos no telencéfalo e cuja expressão é especificamente sobre-regulada, em resposta a uma lesão (Figura 4A-C).
Figura 2. Srepresentação chematic de um cérebro de peixe-zebra adulto em um bloco de agarose aparadas pouco antes vibratome corte. anterior é para cima. Bulbo olfatório (OB), telencéfalo (tel), tecto óptico (ot), cerebelo (CB) e medula (m). Barra de escala: 500 mm.
Figura 3. Respostas regenerativas para apunhalar lesão ferida. AD) Adulto cérebro de peixe-zebra em 5 dias após a lesão (DPL). AB) O PCNA proliferativa marcador (A) e o marcador glial radial S100β (B) são sobre-regulada na zona ventricular (setas) após ferimento por arma branca. (C) O canal de lesão é visível sob iluminação de campo claro (setas). A zona ventricular é indicada pela linha verde. (D) as células precursoras de oligodendrócitos (olig2: EGPF +) se acumulam no local da lesão (setas). Barra de escala: 200 um. Em todos os painéis, o hemisfério direito é o hemisfério lesionado. Dorsal é para cima. A linha tracejada na A a D indica a fronteira entre o Pálio ea subpallium.
Figura 4. Um exemplo de genes up-regulados em resposta a esfaquear lesão. Observe o forte aumento da regulação (setas) de eomesa (A, B) e sox4a (C) expressão de mRNA no hemisfério telencefálico direita (hemisfério esfaqueado) como monitorado por hibridação in situ em 5 DPL. O hemisfério esquerdo é ileso e serve como controle. (B) mostra uma maior ampliação da região telencefálico dorsal de A. Dorsal é para cima. Barra de escala: 200 mm para A e C e de 55 mm para B. Olinha tracejada na A e C indica a separação entre o Pálio ea subpallium. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| SIGLAS | |
| AP | Fosfatase Alcalina |
| BCIP | 5-bromo-4-cloro-3'-indolyphosphate |
| BSA | Albumina de soro bovino |
| CNS | Sistema nervoso central |
| Escavação | Digoxigenina |
| DMSO | Dimetil sulfóxido |
| dpl | Dias após a lesão |
| eomesa | Eomesodermin homólogo um |
| GFAP | Proteína ácida fibrilar glial |
| hr | Hora |
| HYBamortecedor | Tampão de hibridação |
| ISH | a hibridação in situ |
| MeOH | Metanol |
| NBT | Nitro-azul de tetrazólio |
| OPCs | As células precursoras de oligodendrócitos |
| PBS | Salina tamponada com fosfato |
| PCNA | Antígeno nuclear de proliferação celular |
| PFA | Paraformaldeído |
| ProtK | Proteinase K |
| PSA-NCAM | Molécula de adesão celular neuronal polissialilados |
| PTW | PBS, 0,1% de Tween-20 |
| RNA | Ácido ribonucléico |
| RT | A temperatura ambiente |
| SGZ | Zona subgranular |
| sox4a | SRY-box contendo 4a gene |
| SSC | Citrato de sódio salino |
| ZSV | Zona subventricular |
| TRs | Reguladores de transcrição |
Discussion
Descrevemos aqui um método para induzir uma lesão telencefálico empurrando uma agulha através do crânio do peixe-zebra adulto, e analisar a reação celular e molecular para esta lesão por imuno-histoquímica e hibridização in situ. A principal vantagem desta técnica em relação a outras abordagens existentes é a sua simplicidade, rapidez e eficiência de custos. Portanto, esta técnica, que permite a produção de muitos cérebros feridas num curto período de tempo, pode ser facilmente combinada com um grande escala na tela de hibridação in situ para identificar genes com um papel na regeneração e neurogenesis.
A idade do peixe-zebra adultos em que a lesão é realizada é crucial. Se o peixe estiver com mais de 1,5 anos, o crânio é muito difícil e é possível que o crânio está sendo empurrada para baixo ou fraturado em vez de forma limpa perfurado. Em contraste, nos peixes mais jovens (menores de 4 meses), ainda há um monte de neurogênese em curso, o que pode lead a resultados falsos positivos em relação a neurogênese reativa.
Outro passo fundamental nesta abordagem é verificar a eficiência da facada e de excluir que os dois hemisférios são feridos. Isto pode ser monitorizado através da coloração das secções com o anticorpo anti-PCNA. Em uma lesão introduzida correctamente, PCNA deve ser significativamente sobre-regulada em apenas um dos hemisférios.
É importante ter em mente que a lesão mecânica induzida vai ter vários efeitos secundários, tais como a ablação não específica de células, o aumento da morte celular por causa da degeneração secundária, inflamação e destruição da barreira sangue-cérebro, e lesão da zona ventricular e quanto uma possível consequência de fluxo do fluido cerebrospinal para o parênquima cerebral. No entanto, os peixes feridos parecem sofrer muito pouco da lesão. Dentro de 2 min eles são natação livre novamente e comportamento normal de alimentação é restaurada dentro de cerca de 4 horas. Após 3 semanas, o injury não é morfologicamente mais visível. Em nossas mãos, a partir de várias centenas de cirurgias não perdemos um único peixe, apesar do fato de que nós tivemos uma taxa de lesões 100%, avaliada pela histologia em 5 dias após a lesão.
Nos últimos anos, outras técnicas, tais como as abordagens transgénicas têm sido desenvolvidos em peixes-zebra para produzir tecido ou ablação específica de células tipo 2. Embora estas técnicas são muito elegante e minimamente invasivo que se baseiam na produção de construções de ADN complexas e a criação de várias linhas de peixes-zebra transgénicos estáveis que podem ser muito tediosa e morosa. Portanto, abordagens mecânicas simples, tais como o ensaio descrito no presente protocolo permanecer uma ferramenta importante para estudar a neurogénese cérebro adulto e regeneração.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine | Sigma | 335.2 | |
| 10x DPBS (-/-) | Life technologies | 14200-083 | |
| 30 G syringe (Omnican 40) | B.Braun Melsungen | 916162 | |
| Polyethylene molding cup tray | Polysciences, Inc | 17177C-3 | |
| PeqGOLD Universal Agarose | Peqlab | 35-1020 | |
| Bovine serum albumin | Biochrom | W 2835919108 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences, Inc | 18606-20 | |
| Tween 20 | Carl Roth | 9127.1 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
| Dissection needle | Carl Roth | KX93.1 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.2 | |
| Loctite 414 | Schöffler und Wörner | 06 1362 0020 | |
| Glass slides | Labonord | 5305103 | |
| Cover slips 24 x 60 mm | Labonord | 5305060 | |
| Petri dishes, 94 mm | Greiner bio-one | 632180 | |
| Falcon tubes, 15 ml | Greiner bio-one | 188261 | |
| 24-well plate | Greiner bio-one | 662160 | |
| Anti-S100 (1:500) | Dako | Z031101-2 | |
| Anti-PCNA (1:400) | Dako | M087901 | |
| Anti-GFP (1:1,000) | Aves Labs | GFP-1020 | |
| anti-Dig AP-coupled antibody | Roche Diagnostics | 11093274910 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Roche Diagnostics | 1383221 | |
| 4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Roche Diagnostics | 1383213 | |
| Proteinase K | Roche Diagnostics | 1092766 | |
| Polyethylene molding cup tray | Polysciences | 17177C-3 | |
| Vibratome VT1000S | Leica | ||
| Confocal microscope Sp5 DM6000 | Leica | ||
| Dissecting microscope Nikon SMZ 645 | Nikon | ||
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon catalog | 353226 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Danio rerio Tg(olig2:EGFP) | Shin et al.24 | ||
| Danio rerio WT strains (e.g., AB2O2) |
References
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