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Neuroscience

Zebrafish वयस्क telencephalon की चाकू मार चोट: हड्डीवाला मस्तिष्क Neurogenesis और पुनर्जनन जांच के लिए एक विधि

Published: August 4, 2014 doi: 10.3791/51753
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Toxicology and Genetics, Karlsruhe Institute of Technology

Abstract

वयस्क zebrafish चोट के बाद उनके केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को पुनर्जीवित करने के लिए एक अद्भुत क्षमता है. सेलुलर प्रतिक्रिया और zebrafish वयस्क केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) उत्थान और मरम्मत में शामिल आणविक तंत्र की जांच करने के लिए, हम वयस्क telencephalic चोट का एक zebrafish मॉडल विकसित किया है.

इस दृष्टिकोण में, हम स्वयं zebrafish वयस्क telencephalon में एक इंसुलिन सिरिंज सुई धक्का द्वारा एक चोट उत्पन्न करते हैं. अलग पोस्ट चोट दिनों में, मछली उनके दिमाग बाहर विच्छेदित और सेल प्रसार, gliogenesis, और neurogenesis निरीक्षण करने के लिए उपयुक्त मार्कर के साथ immunohistochemistry और / या स्वस्थानी संकरण (ISH) में से दाग रहे हैं, बलिदान कर रहे हैं. contralateral unlesioned गोलार्द्ध एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है. शाही सेना गहरी अनुक्रमण के साथ उदाहरण के लिए संयुक्त यह विधि zebrafish वयस्क telencephalon न्यूरोजेनेसिस, उत्थान, और मरम्मत में एक भूमिका के साथ नए जीनों के लिए स्क्रीन करने के लिए कर सकते हैं.

Introduction

स्तनधारी वयस्क जीवन के दौरान नए न्यूरॉन्स उत्पन्न करने के लिए एक बहुत ही सीमित क्षमता है, और मस्तिष्क में वयस्क neurogenesis ज्यादातर पार्श्व ventricles के subventricular क्षेत्र (SVZ) में स्थित दो telencephalic क्षेत्रों तक ही सीमित है, और दांतेदार की subgranular क्षेत्र (SGZ) हिप्पोकैम्पस 1 में गाइरस. स्तनधारी भी कुशलतापूर्वक, neurodegenerative रोगों, स्ट्रोक, या चोट की वजह से मस्तिष्क की क्षति की मरम्मत नहीं कर सकते. खोया न्यूरॉन्स की जगह नहीं कर रहे हैं और astrocytes, microglia, और oligodendrocytes सहित glial कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार, के बजाय प्रसार, मनाया जाता है. प्रतिक्रियाशील gliosis नामक इस proliferative प्रक्रिया का एक परिणाम के रूप में घायल हो गए, मस्तिष्क के ऊतकों neuronal और axonal उत्थान 2-4 रोकता है जो एक glial निशान के गठन से सील बंद है.

स्तनधारियों, teleost मछली के विपरीत zebrafish तरह वयस्क अवस्था में बहुतायत से नए न्यूरॉन्स के रूप में और एक उच्च पुनर्योजी और proliferat हैकेंद्रीय तंत्रिका तंत्र 2,5-7 के घावों की मरम्मत के लिए संभावित ive. zebrafish वयस्क मस्तिष्क पूरे जीवन 8-11 दौरान नए न्यूरॉन्स की एक बड़ी संख्या उत्पन्न कि 16 अलग तंत्रिका स्टेम सेल आलों में शामिल है. वयस्क zebrafish मस्तिष्क के इन विशिष्ट प्रसार क्षेत्रों में जन्म न्यूरॉन्स वे परिपक्व और मौजूदा neuronal नेटवर्क 8,10,12-15 में एकीकृत जाएगा जहां उनके लक्ष्य क्षेत्रों की ओर पलायन.

वयस्क zebrafish में पहचान पूर्वज क्षेत्रों के अलावा, telencephalic निलय क्षेत्र सबसे अधिक अध्ययन neuronal स्टेम सेल आलों में से एक है. इस पूर्वज आला में कोशिकाओं को अपनी आकृति विज्ञान, विभाजन की दर और विभिन्न glial या neuronal मार्करों की अभिव्यक्ति के बारे में तीन अलग प्रकार में वर्गीकृत किया जा सकता है. मैं टाइप करें और प्रकार द्वितीय कोशिकाओं लंबी प्रक्रिया है जो कोशिकाओं की तरह रेडियल glial हैं. वे GFAP, nestin, और S100β सहित स्टेम सेल मार्कर व्यक्त करते हैं. प्रकार द्वितीय कोशिकाओं proliferat जबकि मैं कोशिकाओं को पैदा नहीं करते लिखेंई धीरे से, इस तरह के सेल परमाणु प्रतिजन (PCNA) और desoxythymidine analogues के समावेश proliferating के रूप में प्रसार मार्कर की उनकी अभिव्यक्ति इसका सबूत है. प्रकार III कोशिकाओं तेजी से तंत्रिका progenitors बनने के लिए और इस तरह पीएसए NCAM 5,16 के रूप में तंत्रिका मार्कर जीन व्यक्त करने के लिए प्रतिबद्ध हैं कि कोशिकाओं को विभाजित कर रहे हैं.

Teleost मछली के पुनर्योजी क्षमता अच्छी तरह से प्रलेखित रहे हैं, केवल कुछ प्रकाशनों चोट 15,17-22 के जवाब में वयस्क telencephalon में neuronal उत्थान में शामिल सेलुलर और आणविक तंत्र का वर्णन किया और विस्तार से जांच की है. Zebrafish वयस्क केंद्रीय तंत्रिका तंत्र उत्थान और मरम्मत में फंसा तंत्र को समझने के लिए और विधान और पुनर्योजी neurogenesis के बीच समानता और अंतर को समझने के लिए, हम वयस्क telencephalic चोट का एक zebrafish मॉडल विकसित किया है. यहाँ, हम telencephalic hemisph में से एक में एक चोट उत्पन्न करने के लिए नेत्रहीन कैसे वर्णन करेंगेएक सिरिंज सुई की मदद से ERES, एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में contralateral unlesioned पक्ष रखते हुए. हम भी सेल प्रसार और immunohistochemistry द्वारा जीन अभिव्यक्ति में और सीटू संकरण assays में चोट पर परिवर्तन की निगरानी करने के लिए कैसे दिखाई देंगे.

Protocol

Zebrafish प्रौद्योगिकी (किट) कार्लज़ूए संस्थान में विष विज्ञान और जेनेटिक्स (ITG) के संस्थान के मछली सुविधा में बनाए रखा गया. जानवरों पर प्रयोग जर्मन पशु संरक्षण के मानकों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया और Baden-Württemberg सरकार, Regierungspräsidium कार्लज़ूए, जर्मनी (Aktenzeichen 35-9185.81/G-272/12 'Adulte Neurogenese') द्वारा अनुमोदित किया गया.

1. Telencephalon में एक चाकू मार सृजन

  1. संज्ञाहरण
    1. (यह भी एथिल 3 aminobenzoate बुलाया 3 अमीनो benzoic एसिड एथिल एस्टर,) tricaine के एक शेयर समाधान तैयार करने के लिए tricaine पाउडर के 400 मिलीग्राम का उपयोग और 97.9 मिलीलीटर पानी में भंग और 2.1 एमएल 1 एम Tris / एचसीएल बफर (पीएच 9). 5 मिलीलीटर aliquots बनाओ. 7 पीएच को समायोजित करें और उपयोग जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें दुकान.
    2. प्लास्टिक माउस पिंजरों में अपने टैंक से 0.5-1 साल पुराने zebrafish के एक उचित संख्या स्थानांतरण. नोट: के बारे में 12 में से एक वयस्क zebrafish की खोपड़ीउम्र के महीने में अभी भी अपेक्षाकृत नरम है और (धारा 1.2.3 और चित्रा 1A देखें) एक सुई के साथ आसानी से छिद्रित किया जा सकता है.
    3. वयस्क zebrafish anesthetize करने के लिए, स्वच्छ मछली टैंक पानी की ~ 100 मिलीलीटर (tricaine के अंतिम एकाग्रता 0.02% (w / v) tricaine) के साथ एक प्लास्टिक क्रासिंग पिंजरे में 5 एमएल tricaine (शेयर समाधान) गठबंधन.
    4. वे अब और (45-60 सेकंड) कदम नहीं है जब तक एनेस्थेटिक्स में मछली सेते हैं.
  2. Telencephalon चोट
    1. जगह व्यक्तिगत tricaine से लथपथ फोम का एक ब्लॉक में एक भट्ठा में zebrafish anesthetized.
    2. ऊपर से प्रकाश के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत धीरे एक हाथ से मछली पकड़ और ऊपर से सिर के लिए उपयोग की अनुमति देता है कि एक तरह से यह पूरबी.
    3. दूसरे हाथ से खड़ी एक telencephalic गोलार्द्ध (आंकड़े 1 ए -1 बी) के औसत दर्जे का क्षेत्र में खोपड़ी के माध्यम से एक 30 ग्राम सिरिंज (एकीकृत सुई के साथ इंसुलिन सिरिंज) धक्का. telencephalon एक की गोलार्द्धोंखोपड़ी के माध्यम से दिखाई हो. पेश घाव 2 मिमी (चित्रा 1C) से भी गहरा नहीं है कि सुनिश्चित करें. नोट: यह अत्यधिक खोपड़ी से बाहर मस्तिष्क विदारक जब घाव के स्थल की पहचान को कम करने के लिए एक ही गोलार्द्ध में हमेशा घाव शुरू करने की सिफारिश की है.
    4. Telencephalic चोट शुरू करने के बाद, ताजा मछली पानी में मछली की जगह है. वसूली के लिए मछली पानी से भरा एक एल 2 माउस पिंजरे में 10 मछली के लिए ऊपर रखें और एक जल प्रवाह प्रणाली के लिए माउस पिंजरे कनेक्ट. नोट: मछली स्वस्थ हैं और कोई अन्य प्रयोगों से पहले मछली के साथ प्रदर्शन किया गया, तो जीवित रहने की दर ~ आमतौर पर 97% है. मछली पानी के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के अलावा आवश्यक नहीं है. वसूली के बाद, मछली सामान्य रूप से व्यवहार करते हैं: वे, दूध, और दोस्त तैरना.

2. Telencephalic चोट के प्रभाव का विश्लेषण

  1. ब्रेन विच्छेदन और फिक्सेशन
    1. घाव (typicall के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर बरामद मछली पुन: बेहोश करनावाई, 1, 3, 5, और 14 दिनों के 0.02% के साथ घाव (डीपीएल)) पोस्ट (ऊपर और 5 मिनट के लिए बर्फ के पानी में डाल द्वारा उन्हें euthanize के रूप में w / v) tricaine.
    2. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में लथपथ एक कागज ऊतक पर मछली प्लेस और एक तेज कैंची के साथ गहरे नाले के पीछे काटने से शरीर से सिर अलग.
    3. खून बह रहा है की अनुमति देने के क्रम में 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस में सिर रखें. नोट: इस प्रोटोकॉल में आगे कदम उपद्रव हो सकता है जो ऊतकों से रक्त नालियों.
    4. पीबीएस या कमरे के तापमान (आर टी) में 4 घंटे में 4% paraformaldehyde (पीएफए) में 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात सिर को ठीक करें.
    5. एक पेट्री डिश में 1x पीबीएस के साथ दो बार तय सिर धो लें.
    6. एक विदारक माइक्रोस्कोप 23 के तहत 1x पीबीएस में ध्यान से दिमाग काटना. घाव विदारक माइक्रोस्कोप के तहत आम तौर पर दिख रहा है. एक दृश्य घाव बिना दिमाग खारिज किया जाना चाहिए.
    7. 1.5 एमएल 100% मेथनॉल से भरा 2 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब (MeOH) में दिमाग स्थानांतरण और 5x incubating से पहले ट्यूब पलटनाकम से कम 16 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें. नोट: immunohistochemistry के लिए या स्वस्थानी संकरण में जब तक जरूरत दिमाग -20 डिग्री सेल्सियस पर MeOH में कई महीनों के लिए रखा जा सकता है.
  2. Immunohistochemistry के लिए ऊतक तैयारी
    1. 2 मिलीलीटर प्लास्टिक की ट्यूब में एक घटते मेथनॉल श्रृंखला (क्रमिक रूप से 75% MeOH (1x पीबीएस, 0.1% बीच 20 = PTW) के माध्यम से दिमाग rehydrate;. 50% MeOH, 25% MeOH दिमाग (15 दिमाग / 2 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब सेते ) प्रत्येक समाधान में 5 मिनट के लिए.
    2. 5 मिनट के लिए PTW में दिमाग को धो लें. ताजा PTW साथ 4x दोहराएँ.
  3. सेक्शनिंग के लिए दिमाग का एम्बेड
    1. एम्बेड करने के लिए, एक हस्तांतरण pipet (5 मिमी व्यास) के साथ एक पॉलीथीन मोल्डिंग कप ट्रे की गुहाओं में PTW में 2 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब से दिमाग हस्तांतरण.
    2. एक Erlenmeyer फ्लास्क में 1x पीबीएस में 2% agarose (डीएनए ग्रेड) तैयार करें. Agarose पूरी तरह भंग है जब तक 600 डब्ल्यू पर माइक्रोवेव में गरम करें. 10 दिमाग के लिए 50 मिलीलीटर की तैयारी. चलो वेंई agarose उपयोग से पहले कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए शांत हो जाओ. एक पूर्व गर्म हीटिंग ब्लॉक (60 डिग्री सेल्सियस) solidification को रोकने के क्रम में दिमाग embedding जबकि पर agarose रखें.
    3. एक पाश्चर पिपेट (1 मिमी व्यास) का उपयोग कर एक मस्तिष्क से युक्त मोल्ड से 1x पीबीएस निकालें. मस्तिष्क क्षति के लिए नहीं सावधान रहना होगा.
    4. मोल्ड में agarose डालो और इसे पूरी तरह से भरना. तो यह आसान मस्तिष्क एम्बेड करने के लिए बना PTW दूर धोने के लिए agarose में दिमाग चक्कर आने के लिए एक विच्छेदन सुई का उपयोग करें.
    5. ओरिएंट नीचे ढालना उदर पक्ष में मस्तिष्क, ऊपर पृष्ठीय पक्ष और सीधे जगह है.
    6. Agarose शांत करते हैं. तेजी से ठंडा करने के लिए बर्फ पर ढालना जगह है. चरणों को दोहराएँ.
    7. सभी के दिमाग के लिए 2.3.3-2.3.6 दोहराएँ.
  4. Agarose ब्लॉक की ट्रिमिंग
    1. एक विच्छेदन सुई का प्रयोग, agarose ब्लॉक बाहर पॉप.
    2. एक तेज धार के साथ, मस्तिष्क के पीछे अंत में agarose काटा. यकीन है कि इस विमान ते के समानांतर है बनाओlencephalon.
    3. मस्तिष्क के पूर्वकाल अंत में agarose काटें. यह पश्च विमान पर खड़ा है तो फिर ब्लॉक फ्लिप.
    4. मस्तिष्क के पृष्ठीय और उदर पक्षों के समानांतर में कटौती करके agarose के अतिरिक्त हटा दें. यह अपने उदर पक्ष पर स्थित हैं, तो वापस मस्तिष्क फ्लिप.
    5. Telencephalon छोटे विमान में स्थित है जिसमें एक छोटा त्रिकोण (चित्रा 2) के लिए ब्लॉक में कटौती.
  5. सेक्शनिंग के लिए Vibratome तैयारी
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार vibratome तैयार करें. एक नई धार का प्रयोग करें और 10 दिमाग के बाद यह जगह.
    2. सिर्फ ब्लेड के नीचे पहुंचता है कि एक स्तर तक 1x पीबीएस के साथ बफर स्नान भरें.
    3. Vibratome का नमूना डिस्क के शीर्ष पर superglue की एक छोटी सी बिंदी रखें.
    4. ध्यान superglue पर मस्तिष्क को पीछे स्थित है कि विमान जगह. यह 1x पीबीएस में साथ संपर्क में है के रूप में गोंद के रूप में जल्द ही कठोर होगाvibratome बफर स्नान.
    5. सूक्ष्म की जोड़तोड़ का उपयोग बफर ट्रे में नमूना के साथ नमूना डिस्क डालें.
    6. वांछित स्थिति में नमूना डिस्क को घुमाने के लिए जोड़तोड़ का प्रयोग करें. ब्लेड का सामना करना पड़ मस्तिष्क के पृष्ठीय भाग के साथ, सतह के नीचे सिर्फ telencephalon रेखांकित एक तरीका है कि बफर स्नान में ब्लॉक पूरबी. फिर एक 3 मिमी एलन कुंजी के साथ scrw कसने और जोड़तोड़ हटा दें. नोट: clamping के पेंच या clamping के उपकरणों में से एक नमूना डिस्क में अंतराल पर स्थित नहीं होना चाहिए; इन पदों में नमूना डिस्क clamping संभव नहीं है.
  6. ब्रेन सेक्शनिंग
    1. वर्गों इकट्ठा करने के लिए एक 24 अच्छी तरह से थाली तैयार है. Sectioned जा मस्तिष्क के अनुसार, अवरुद्ध बफर के 1 मिलीलीटर (0.1% (के साथ अच्छी तरह से एक को भरने वी / वी) 10% बीच 20, 0.2% (w / v) गोजातीय सीरम albumin (BSA), 1% (v / v) पीबीएस में डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO)).
    2. 50 माइक्रोन मोटाई, 1 मिमी / सेकंड की गति, और 70 हर्ट्ज आवृत्ति पर सेक्शनिंग प्रारंभएक हिल सूक्ष्म तक्षणी का उपयोग कर.
    3. वे ब्लेड से आते हैं और 24 अच्छी तरह से थाली में उन्हें लेने के रूप में agarose की पतली स्लाइसें लेने के लिए एक कृत्रिम ब्रश (1 मिमी) का प्रयोग करें.
  7. Vibratome वर्गों पर immunohistochemistry
    1. बफर (0.1% (v / v) 10% के बीच 20, 0.2% (पीबीएस में w / v) बीएसए, 1% (v / v) DMSO) को रोकने में आरटी पर 1 घंटे के लिए गैर विशिष्ट बंधन साइटों को ब्लॉक.
    2. सतह पर तैरनेवाला निकालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात अवरुद्ध बफर में पतला एंटीबॉडी के 250 μl जोड़ने वैकल्पिक रूप से, आरटी पर 2 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी सेते हैं. फिर PTW में 10 मिनट के लिए 3x धो लो. नोट: PCNA धुंधला हो जाना एक 1:400 कमजोर पड़ने इस्तेमाल के लिए (माउस विरोधी PCNA विवरण सामग्री की तालिका देखें.). कई प्राथमिक एंटीबॉडी एक ही समय में incubated किया जा सकता है.
    3. आरटी पर 2 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी में वर्गों सेते हैं तो PTW में 10 मिनट के लिए 3x धो लो. नोट: PTW में 1:1,000 कमजोर पड़ने, विस्तार सामग्री की तालिका देखें. एकाधिक माध्यमिक एंटीबॉडी एक ही समय में incubated किया जा सकता है.
  8. (वैकल्पिक immunohistochemistry के लिए) बगल में संकरण में वयस्क ब्रेन आरएनए
    1. ब्रेन विच्छेदन और फिक्सेशन (immunohistochemistry के लिए के रूप में एक ही प्रक्रिया):
      1. जांच के संकरण.
      2. Immunohistochemistry के लिए वर्णित के रूप में 2 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूबों में दिमाग rehydrate.
      3. 30 मिनट के लिए PTW में; proteinase कश्मीर (10 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम सान्द्र. ProtK) में दिमाग सेते हैं. ऊष्मायन समय के बाद ProtK / PTW हटाने और बीटी फिक्स में 20 मिनट के लिए फिर से दिमाग को ठीक (4% पीएफए, 4% sucrose, 0.12 मिमी 2 CaCl, 77 मिमी ना 2 4 HPO, 23 मिमी नाह 2 पीओ 4).
      4. PTW में 5 मिनट (0.1% (v / v) बीच 20 पीबीएस में) के लिए दिमाग 5x धो लें.
      5. PTW निकालें और 500 μl में दिमाग कुल्लाHYB बफर (50% (v / v) विआयनीकृत formamide, 5x एसएससी, 500 माइक्रोग्राम / एमएल खमीर tRNA, 50 माइक्रोग्राम / एमएल हेपरिन, 0.1% बीच 20, 9 एमएम citricacid). दिमाग फिर सतह पर तैरनेवाला त्यागें और स्वच्छ HYB बफर के 500 μl जोड़ने और 3-4 घंटे के लिए 65-70 डिग्री सेल्सियस पर सेते ट्यूब के नीचे डूब जब तक प्रतीक्षा करें.
      6. HYB बफर के 400 μl के अंतिम मात्रा में (जांच पर निर्भर करता है) 1:200 या 1:400 शाही सेना जांच पतला. 5 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर पतला आरएनए जांच गरम करें.
      7. दिमाग से सतह पर तैरनेवाला निकालें और शाही सेना जांच जोड़ने, 65-70 डिग्री सेल्सियस (ओ / एन) में सेते हैं. सभी धोने बफर समाधान 70 डिग्री सेल्सियस पर prewarmed और रखा जाना चाहिए
    2. लेबल
      1. 30 मिनट के लिए दो बार धोने बफर 1 की 500 μl (50% formamide, 1x एसएससी, 0.05% बीच 20) के साथ (सभी 4 धोने चरणों के दौरान) 65-70 डिग्री सेल्सियस पर दिमाग को धो लें. बफर 2 (2x एसएससी, 0.1% के बीच 20) द्वारा बफर 1 बदलें, और 15 मिनट के लिए सेते हैं. बफर 2 निकालें और के लिए बफर 3 में (0.2x एसएससी, 0.1% के बीच 20) दिमाग धोने30 मिनट आर, दो बार इस कदम 2 दोहराएँ. बफर 4 (0.1x एसएससी, PTW में 0.05% बीच 20) द्वारा बफर 3 बदलें, 5 मिनट के लिए सेते हैं.
      2. सतह पर तैरनेवाला निकालें और आरटी पर PTW के 500 μl में 5 मिनट के लिए धो लो.
      3. (1x पीबीएस में) 2% agarose में दिमाग एम्बेड और immunohistochemistry के लिए वर्णित के रूप में vibratome वर्गों (50-100 माइक्रोन) में कटौती.
      4. बफर (1x पीबीएस, 0.1% बीच 20, 0.2% (w / v) बीएसए, 1% (v / v) DMSO) अवरुद्ध 500 μl में 5 मिनट के लिए धो 1x.
      5. सतह पर तैरनेवाला निकालें और आरटी पर 2 घंटे के लिए अवरुद्ध बफर 500 μl जोड़ें.
      6. सतह पर तैरनेवाला निकालें और विरोधी डीआईजी एपी युग्मित एंटीबॉडी अवरुद्ध बफर में 1:4,000 पतला 300 μl जोड़ें.
      7. 4 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन सेते
    3. एनबीटी / BCIP धुंधला
      1. आरटी पर PTW बफर के साथ 15 मिनट के लिए 5x धो लें.
      2. धुंधला बफर में 1x कुल्ला. धुंधला बफर में दो बार 5 मिनट (100 मिमी Tris / एचसीएल पीएच 9.5, 50 मिमी 2 MgCl, 100 मिमी NaCl, 0.1% बीच 20) धो लें.
      3. 500 μ साथ सतह पर तैरनेवाला और दाग को दूरएल धुंधला समाधान (3.5 4-Nitroblue tetrazolium क्लोराइड (एनबीटी) की μl और 1 मिलीलीटर धुंधला बफर प्रति 5-Bromo-4-क्लोरो 3 indolyl फॉस्फेट (BCIP)).
      4. PTW साथ 5x लिए 3x rinsing द्वारा धुंधला हो जाना बंद करो.
  9. धारा के बढ़ते
    1. (सामग्री तालिका देखें) एक पानी में घुलनशील, गैर फ्लोरोसेंट बढ़ते माध्यम का उपयोग कर स्लाइड पर वर्गों माउंट.
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में स्लाइड रखें नोट: धुंधला हो जाना भी कई सप्ताह या महीनों के लिए स्थिर है.
    3. एक परिसर या confocal खुर्दबीन के नीचे स्लाइड का विश्लेषण करें.

Representative Results

इस आलेख में वर्णित कार्यप्रवाह का उपयोग करना, एक घाव एक वयस्क zebrafish telencephalon (आंकड़े 1 ए -1 बी) के दाएँ गोलार्द्ध में पेश किया गया था. एक सही लोग घायल हो गए telencephalon (चित्रा -3 सी) के पूरे एक प्रकार का कपड़ा के माध्यम से उदर को पृष्ठीय से फैली कि एक घाव नहर की ओर जाता है. घाव गोलार्द्धों में से एक के लिए प्रतिबंधित किया जाना चाहिए और औसत दर्जे का निलय पार नहीं करना चाहिए. घाव नहर उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी (चित्रा -3 सी) के साथ दिख रहा है और लगभग 35 दिनों के बाद 15 चंगा हो जाएगा.

3-7 डीपीएल में और S100β (3B चित्रा) immunohistochemistry 15 से detectable है, यह पहले से सेल परमाणु प्रतिजन (चित्रा 3A PCNA) proliferating के एक ऊपर विनियमन लोग घायल हो गए के बाद कि दिखाया गया था. PCNA और S100β का धुंधला रेडियल glial कोशिकाओं के प्रसार का संकेत है, अतिव्यापी है.

एफमछली 24: urthermore, oligodendrocyte अग्रदूत साबित कोशिकाओं (OPCs) कल्पना करने के क्रम में, एक चाकू के घाव परख टीजी (EGFP olig2) पर प्रदर्शन किया गया था. एक विरोधी GFP एंटीबॉडी के साथ धुंधला करने पर, घाव नहर के पास OPCs के संचय (चित्रा 3 डी) detectable है. इस संचय क्षणिक है, और OPC समूहों 35 डीपीएल 15 पर अब और नहीं मनाया जाता है.

घाव ठीक से पेश नहीं किया गया था, तो घाव नहर दिखाई नहीं होगा, और ऊपर विनियमन PCNA और S100β या OPCs के संचय का पता लगाने योग्य नहीं होगा. PCNA मस्तिष्क की चोट के लिए सबसे ज्यादा संवेदनशील मार्कर है. चाकू के घाव की दक्षता को सत्यापित करने के लिए और दोनों गोलार्द्धों घायल कर रहे हैं कि बाहर करने के लिए आदेश में, यह दृढ़ता से हमेशा एक विरोधी PCNA एंटीबॉडी के साथ वर्गों दाग की सिफारिश की है. एक सही ढंग से पेश घाव में, PCNA काफी होना चाहिए विनियमित केवल एक ही गोलार्द्धों के में (15 से 4 गुना). ज्यादातर मामलों में यह हैकेवल जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन की निगरानी के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में contralateral unlesioned पक्ष का उपयोग करने के लिए पर्याप्त है, यह अत्यधिक जंगली प्रकार दिमाग की telencephalic गोलार्द्धों में अभिव्यक्ति के साथ नियंत्रण गोलार्द्ध में जीन अभिव्यक्ति की तुलना करने की सिफारिश की है. इस तरह, दोनों गोलार्द्धों को प्रभावित करती है कि जीन की अभिव्यक्ति पर घाव के किसी भी प्रणालीगत प्रभाव का पता लगाया जा सकता है.

चाकू के एक व्यवस्थित प्रतिलेखन नियामकों (टीआरएस) की अभिव्यक्ति की स्क्रीन के साथ संयोजन में परख घाव (25 और श्मिट एट अल., अप्रकाशित) भी न्यूरोजेनेसिस और उत्थान (आंकड़े 4A-4C) में एक संभावित भूमिका के साथ टी.आर. जीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

यह दृष्टिकोण telencephalon में व्यक्त की है और जिनकी अभिव्यक्ति की चोट (चित्रा -4 ए सी) के जवाब में विनियमित ऊपर से विशेष रूप से है कि कारकों की एक संख्या की पहचान की है.

चित्रा 1. वयस्क zebrafish telencephalic वार लोग घायल हो गए योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. ए) एक इंसुलिन सिरिंज सुई एक telencephalic चोट उत्पन्न करने के लिए एक वयस्क zebrafish की खोपड़ी के माध्यम से धक्का दिया है. सफेद लाइन दो telencephalic गोलार्द्धों के बीच सीमा का प्रतिनिधित्व करता है और ग्रीन क्रॉस एक वयस्क zebrafish मस्तिष्क के चाकू के घाव. बी) पृष्ठीय दृश्य की स्थिति को दर्शाता टकराया. प्रमुख मस्तिष्क क्षेत्रों संकेत कर रहे हैं. ग्रीन क्रॉस प्रेरित चोट. सी) telencephalic चोट प्रेरित करने के लिए कार्य करता है जो सुई,, की नोक 2 मिमी उपायों की स्थिति को दर्शाता है. घ्राण बल्ब (ओ), telencephalon (दूरभाष) और ऑप्टिक tectum (ओटी).

चित्रा 2
चित्रा 2. एसएक छंटनी agarose ब्लॉक में एक वयस्क zebrafish मस्तिष्क की chematic प्रतिनिधित्व बस से पहले vibratome सेक्शनिंग. पूर्वकाल ऊपर है. घ्राण बल्ब (ओ), telencephalon (दूरभाष), ऑप्टिक tectum (ओटी), सेरिबैलम (सीबी) और मज्जा (एम). स्केल पट्टी: 500 माइक्रोन.

चित्रा 3
चित्रा 3. घाव चोट वार करने के लिए पुनर्योजी के हिमायती हैं. 5 दिनों में ई.) वयस्क zebrafish मस्तिष्क वार लोग घायल हो गए पर निलय क्षेत्र (तीर) पर विनियमित अप (डीपीएल). एबी) proliferative मार्कर PCNA (ए) और रेडियल glial मार्कर S100β (ख) का घाव पोस्ट. (सी) घाव चैनल उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी (तीर) के तहत दिखाई है. निलय क्षेत्र ग्रीन लाइन ने संकेत दिया है. (डी) Oligodendrocyte अग्रदूत साबित कोशिकाओं (olig2: ईजीएफ पी)) घाव (तीर के स्थल पर जमा हो. स्केल पट्टी: 200 माइक्रोन. सभी पैनलों में, दाएँ गोलार्द्ध lesioned गोलार्द्ध है. पृष्ठीय ऊपर है. डी ए में धराशायी लाइन प्रकार का कपड़ा और subpallium के बीच की सीमा को इंगित करता है.

चित्रा 4
निगरानी की के रूप में चित्रा 4. चोट वार के जवाब में विनियमित ऊपर से जीन का एक उदाहरण है. Eomesa सही telencephalic गोलार्द्ध में (ए, बी) और sox4a (सी) mRNA अभिव्यक्ति (छुरा घोंपा गोलार्द्ध) की मजबूत विनियमन (तीर) नोट 5 डीपीएल में स्वस्थानी संकरण में से. बाएँ गोलार्द्ध रिहाई है और नियंत्रण के रूप में कार्य करता है. (बी) ए पृष्ठीय के पृष्ठीय telencephalic क्षेत्र के एक उच्च बढ़ाई ऊपर से पता चलता है. स्केल पट्टी: ए और सी के लिए 200 माइक्रोन और बी के लिए 55 माइक्रोनएक में लाइन धराशायी और सी प्रकार का कपड़ा और subpallium के बीच अलगाव को इंगित करता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

लघुरूप
एपी Alkaline फॉस्फेट
BCIP 5-Bromo-4-क्लोरो 3'-indolyphosphate
बीएसए गोजातीय सीरम albumin
सीएनएस केंद्रीय तंत्रिका तंत्र
खुदाई Digoxygenin
DMSO डाइमिथाइल sulfoxide
डीपीएल दिन घाव पोस्ट
eomesa Eomesodermin Homolog एक
GFAP Glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन
घंटा घंटा
HYBबफर संकरण बफर
ISH स्वस्थानी संकरण में
MeOH मेथनॉल
एनबीटी नाइट्रो नीले tetrazolium
OPCs Oligodendrocyte अग्रदूत साबित कोशिकाओं
पीबीएस फास्फेट बफर खारा
PCNA सेल परमाणु प्रतिजन proliferating
पीएफए Paraformaldehyde
ProtK Proteinase कश्मीर
पीएसए NCAM Polysialylated neuronal सेल आसंजन अणु
PTW पीबीएस, 0.1% बीच 20
शाही सेना Ribonucleic एसिड
आरटी कमरे के तापमान
SGZ Subgranular क्षेत्र
sox4a जीन -4 ए युक्त SRY बॉक्स
एसएससी खारा सोडियम साइट्रेट
SVZ Subventricular क्षेत्र
टीआरएस ट्रांसक्रिप्शन नियामकों

Discussion

हम यहाँ वयस्क zebrafish की खोपड़ी के माध्यम से एक सुई धक्का द्वारा एक telencephalic चोट प्रेरित करने के लिए, और immunohistochemistry द्वारा और स्वस्थानी संकरण में इस चोट के लिए सेलुलर और आणविक प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन. अन्य मौजूदा तरीकों पर इस तकनीक का मुख्य लाभ अपनी सादगी, गति और लागत कुशलता है. इसलिए, एक कम समय में कई घायल दिमाग के उत्पादन की अनुमति देता है जो इस तकनीक, आसानी से उत्थान और neurogenesis में एक भूमिका के साथ जीन की पहचान करने के लिए सीटू संकरण स्क्रीन में एक बड़े पैमाने के साथ जोड़ा जा सकता है.

चोट किया जाता है जिस पर वयस्क zebrafish की उम्र महत्वपूर्ण है. मछली 15 साल से अधिक उम्र के हैं, खोपड़ी बहुत मुश्किल है और यह खोपड़ी नीचे धक्का दे दिया या बल्कि सफाई से छिद्रित से खंडित किया जा रहा है कि संभव है. इसके विपरीत, छोटी मछली (छोटी से 4 महीने) में चल रहा neurogenesis की एक बहुत कुछ है, वहाँ अभी भी है, जो हो सकता है घास का मैदानप्रतिक्रियाशील neurogenesis के बारे में झूठी सकारात्मक परिणाम के लिए डी.

इस दृष्टिकोण में एक और महत्वपूर्ण कदम चाकू के घाव की दक्षता को सत्यापित करने के लिए और दोनों गोलार्द्धों घायल कर रहे हैं कि बाहर करने के लिए है. यह विरोधी PCNA एंटीबॉडी के साथ वर्गों धुंधला द्वारा नजर रखी जा सकती है. एक सही ढंग से पेश घाव में, PCNA गोलार्द्धों में से केवल एक में विनियमित ऊपर काफी होना चाहिए.

यह प्रेरित यांत्रिक चोट ऐसे गैर विशिष्ट सेल पृथक, क्योंकि माध्यमिक अध: पतन, सूजन और रक्त मस्तिष्क बाधा के विनाश की वृद्धि की कोशिका मृत्यु, और निलय क्षेत्र की क्षति के रूप में और के रूप में कई साइड इफेक्ट हो जाएगा कि दिमाग में रखना जरूरी है मस्तिष्क पैरेन्काइमा में मस्तिष्कमेरु द्रव के संभावित परिणाम के प्रवाह. हालांकि, घायल मछली की चोट से बहुत कम पीड़ित दिखाई देते हैं. 2 मिनट के भीतर ही वे फिर से मुक्त तैर रहे हैं और सामान्य भोजन व्यवहार के बारे में 4 घंटे के भीतर बहाल है. 3 सप्ताह के बाद मैंnjury अब और आकृति विज्ञान दिखाई नहीं देता है. हमारे हाथ में, कई सौ सर्जरी से हम 5 दिनों के बाद घाव पर ऊतक विज्ञान के द्वारा मूल्यांकन के रूप में हम एक 100% की चोट की दर थी कि इस तथ्य के बावजूद एक भी मछली खोना नहीं था.

पिछले वर्षों में ऐसे ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण के रूप में अन्य तकनीकों के ऊतक या सेल प्रकार विशिष्ट पृथक 2 निर्माण करने के लिए zebrafish में विकसित किया गया है. इन तकनीकों का बहुत ही सुंदर और न्यूनतम इनवेसिव हैं हालांकि वे जटिल डीएनए निर्माणों और बहुत थकाऊ और समय लेने वाली हो सकती है, जो कई स्थिर zebrafish ट्रांसजेनिक लाइनों की स्थापना की पीढ़ी पर आधारित हैं. इसलिए, इस तरह इस प्रोटोकॉल में वर्णित परख के रूप में सरल यांत्रिक दृष्टिकोण वयस्क मस्तिष्क neurogenesis और उत्थान अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण रहते हैं.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tricaine Sigma 335.2
10x DPBS (-/-) Life technologies 14200-083
30 G syringe (Omnican 40) B.Braun Melsungen 916162
Polyethylene molding cup tray  Polysciences, Inc 17177C-3
PeqGOLD Universal Agarose  Peqlab 35-1020
Bovine serum albumin Biochrom W 2835919108
Aqua Poly/Mount Polysciences, Inc 18606-20
Tween 20 Carl Roth 9127.1
DMSO Carl Roth A994.2
Dissection needle Carl Roth KX93.1
Paraformaldehyde Carl Roth 335.2
Loctite 414 Schöffler und Wörner 06 1362 0020
Glass slides Labonord 5305103
Cover slips 24 x 60 mm Labonord 5305060
Petri dishes, 94 mm Greiner bio-one 632180
Falcon tubes, 15 ml Greiner bio-one 188261
24-well plate Greiner bio-one 662160
Anti-S100 (1:500) Dako Z031101-2
Anti-PCNA (1:400) Dako M087901
Anti-GFP (1:1,000) Aves Labs GFP-1020
anti-Dig AP-coupled antibody  Roche Diagnostics 11093274910
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP)  Roche Diagnostics 1383221
4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT)  Roche Diagnostics 1383213
Proteinase K Roche Diagnostics 1092766
Polyethylene molding cup tray  Polysciences 17177C-3
Vibratome VT1000S Leica
Confocal microscope Sp5 DM6000 Leica
Dissecting microscope Nikon SMZ 645 Nikon
24-well flat bottomed tissue culture plates  Falcon catalog  353226
Student Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 91150-20
Surgical scissors Fine Science Tools 91460-11
Danio rerio Tg(olig2:EGFP) Shin et al.24
Danio rerio WT strains (e.g., AB2O2)

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References

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Zebrafish वयस्क telencephalon की चाकू मार चोट: हड्डीवाला मस्तिष्क Neurogenesis और पुनर्जनन जांच के लिए एक विधि
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Schmidt, R., Beil, T., Strähle, U., Rastegar, S. Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration. J. Vis. Exp. (90), e51753, doi:10.3791/51753 (2014).

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