Abstract
Voksen zebrafisk har en forbløffende evne til at regenerere deres centrale nervesystem efter skade. For at undersøge det cellulære respons og de molekylære mekanismer, der er involveret i zebrafisk voksen centralnervesystemet (CNS) regenerering og reparation, har vi udviklet en zebrafisk model af voksne telencephalic skade.
I denne tilgang, vi manuelt generere en skade ved at skubbe til en insulinsprøjte nål i zebrafisk voksen telencephalon. På forskellige indlæg skade dage, fisk aflivet, deres hjerner dissekeres ud og farves ved immunhistokemi og / eller in situ-hybridisering (ISH) med passende markører til at observere celleproliferation, gliogenesis og neurogenese. Den kontralaterale unlesioned halvkugle tjener som en intern kontrol. Denne metode kombineret med f.eks RNA dyb sekventering kan hjælpe til at screene for nye gener med en rolle i zebrafisk voksen telencephalon neurogenese, regenerering og reparation.
Introduction
Pattedyr har en meget begrænset kapacitet til at generere nye neuroner i løbet af voksenlivet, og voksen neurogenese i hjernen er for det meste begrænset til to telencephalic regioner beliggende ved subventricular zone (SVZ) i de laterale ventrikler, og subgranular zone (SGZ) i tandet gyrus i hippocampus 1. Pattedyr kan heller ikke reparere skader på hjernen forårsaget af neurodegenerative sygdomme, slagtilfælde eller skader effektivt. Lost neuroner erstattes ikke, og i stedet spredning af forskellige typer af gliaceller, herunder astrocytter, mikroglia og oligodendrocytter overholdes. Som en konsekvens af denne proliferativ proces kaldes reaktiv gliose, er de sårede hjernevæv afspærret af dannelsen af en glial ar, som hæmmer neuronale og axonal regenerering 2-4.
I modsætning til pattedyr, benfisk som zebrafisk danne nye neuroner rigeligt i voksne stadier og har en høj regenerative og proliferative potentiale til at reparere læsioner i centralnervesystemet 2,5-7. Zebrafisk voksne hjerne indeholder 16 distinkte neurale stamceller nicher, der genererer et stort antal nye neuroner i hele levetid 8-11. Neuroner født i disse specifikke sprednings zoner af den voksne zebrafisk hjerne vandrer til deres målområder, hvor de vil modnes og integrere i de eksisterende neuronale netværk 8,10,12-15.
Blandt progenitor zoner er identificeret i voksen zebrafisk den telencephalic ventrikulær zone er en af de mest undersøgte neuronale stamceller nicher. Celler i denne stamfader niche kan inddeles i tre forskellige typer med hensyn til deres morfologi, division sats og udtryk af forskellig glial eller neuronale markører. Type I og type II-celler radial glia lignende celler, som har lange processer. De udtrykker stamceller markører herunder GFAP, nestin og S100β. Type I celler ikke proliferere medens type II-celler proliferate langsomt, som det fremgår af deres udtryk for spredning markører såsom prolifererende celler (PCNA) og indarbejdelse af desoxythymidine analoger. Type III celler hurtigt dividere celler, der er forpligtet til at blive neurale forfædre og udtrykke neurale markørgener, såsom PSA-NCAM 5,16.
Skønt de regenerative kapacitet benfisk er veldokumenteret, har kun få publikationer beskrevet og undersøgt i detaljer de cellulære og molekylære mekanismer involveret i neuronal regenerering i den voksne telencephalon reaktion på skade 15,17-22. At dechifrere de mekanismer, der er impliceret i zebrafisk voksen centralnervesystemet regenerering og reparation og til at forstå ligheder og forskelle mellem konstitutive og regenerativ neurogenesis udviklede vi en zebrafisk model af voksne telencephalic skade. Her vil vi beskrive visuelt hvordan man kan generere en skade i en af de telencephalic hemisphEres ved hjælp af en kanyle, samtidig med at den kontralaterale unlesioned side som en intern kontrol. Vi vil også vise, hvordan man kan overvåge ændringer efter skade i celledeling og genekspression ved immunhistokemi og in situ hybridisering assays.
Protocol
Zebrafisk blev opretholdt i fisken facilitet for Institut for Toksikologi og Genetik (ITG) ved Karlsruhe Institute of Technology (KIT). Forsøg med dyr blev udført i overensstemmelse med de tyske normer dyrebeskyttelse og blev godkendt af regeringen i Baden-Württemberg, Regierungspräsidium Karlsruhe, Tyskland (Aktenzeichen 35-9185.81/G-272/12 'Adulte Neurogenese ").
1.. Generering af en stiksår i telencephalon
- Anæstesi
- For at fremstille en stamopløsning af tricaine (3-amino-benzoesyre-ethylester, også kaldet ethyl-3-aminobenzoat) anvender 400 mg tricaine pulver og opløse den i 97,9 ml vand og 2,1 ml 1 M Tris / HCI-buffer (pH 9). Justér pH til 7.. Lav 5 ml portioner og gemme dem ved -20 ° C indtil brug.
- Overfør et passende antal 0,5-1 år gammel zebrafisk fra deres kampvogne ind i plastik mus bure. Bemærk: Skallen af en voksen zebrafisk på omkring 12måneder er stadig relativt blød og kan være perforeret nemt med en nål (se afsnit 1.2.3 og figur 1A).
- At bedøve den voksne zebrafisk, kombinere 5 ml tricaine (stamopløsning) i en plastik passage bur med ~ 100 ml ren akvarium vand (slutkoncentration af tricaine 0,02% (w / v) tricaine).
- Inkubér fisk i bedøvelsesmidler, indtil de ikke bevæger sig længere (45-60 sek).
- Telencephalon Injury
- Place individ bedøvede zebrafisk i en slids i en blok af tricaine-gennemblødt skum.
- Under et dissektionsmikroskop med lys fra den øverste holder forsigtigt fisk med den ene hånd og orientere det på en måde, der giver adgang til hovedet fra toppen.
- Med den anden hånd skubbe en 30 G injektionssprøjte (insulinsprøjte med integreret nål) lodret gennem kraniet ind i midterområdet af en telencephalic halvkugle (figurerne 1A-1B). Halvkugler af telencephalon enre synlig gennem kraniet. Sørg for, at den indførte læsionen ikke er dybere end 2 mm (jf. figur 1c). Bemærk: Det anbefales stærkt at introducere læsionen altid ind i den samme halvkugle for at lette identifikationen af stedet for læsion når dissekere hjernen ud af kraniet.
- Efter at have introduceret den telencephalic skade, placer fisken i frisk fisk vand. Hold dig til 10 fisk i en 2 L mus bur fyldt med fisk vand til genopretning og tilslutte musen bur til en vand flow-system. Bemærk: Den overlevelse er normalt ~ 97%, hvis fisk er sundt og ingen andre forsøg blev udført med fisk før. Tilsætning af antibiotika til fisk vand er ikke nødvendigt. Efter inddrivelsen, fisk opføre sig normalt: de svømmer, foder og mate.
2.. Analysere effekten af Telencephalic Injury
- Brain Dissektion og fiksering
- Re-bedøve den genvundne fisk på forskellige tidspunkter efter læsion (typically, 1, 3, 5 og 14 dage efter læsion (DPL)) med 0,02% (w / v) tricaine som ovenfor og aflive dem ved at sætte dem i isvand i 5 minutter.
- Placer fisk på en papirserviet vædet i phosphatbufret saltvand (PBS) og adskille hovedet fra kroppen ved at skære bag gællerne med en skarp saks.
- Holde hovedet i 1x PBS i 5 minutter for at muliggøre blødning. Bemærk: Denne dræner blod fra vævet, hvilket kan forstyrre yderligere skridt i protokollen.
- Lave hovederne natten over ved 4 ° C i 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS eller 4 timer ved stuetemperatur (RT).
- Vask faste hoveder to gange med 1x PBS i en petriskål.
- Dissekere hjerner omhyggeligt i 1x PBS under et dissektionsmikroskop 23. Læsionen er normalt synlige under dissektionsmikroskop. Brains uden en synlig læsion skal kasseres.
- Overfør hjerner i 2 ml reagensglas fyldt med 1,5 ml 100% methanol (MeOH) og vend rørene 5x før inkuberedem ved -20 ° C i mindst 16 timer. Bemærk: Hjernerne kan opbevares i flere måneder i MeOH ved -20 ° C indtil brug for immunohistokemi eller in situ hybridisering.
- Tissue Forberedelse til Immunohistokemi
- Rehydrere hjerner gennem en faldende methanol serie i 2 ml plastrør (sekventielt 75% MeOH (1x PBS, 0,1% Tween-20 = PTW). 50% MeOH, 25% MeOH inkuberes hjerner (15 hjerne / 2 ml reaktionsrør ) i 5 minutter i hver opløsning.
- Vask hjerner i PTW i 5 min. Gentag 4x med frisk PTW.
- Indlejring af hjernerne til Skæring
- Til indlejring overføre hjerner fra 2 ml reaktion rør i PTW ind i hulrum i en polyethylen-støbning kop bakke med en overførsel pipette (diameter 5 mm).
- Forbered 2% agarose (DNA-kvalitet) i 1x PBS i en Erlenmeyerkolbe. Varm det i mikrobølgeovn på 600 W, indtil agarosen er opløst fuldstændigt. Forbered 50 ml til 10 hjerner. Lad the agarose afkøle i 3 minutter ved stuetemperatur før brug. Hold agarose på en forvarmet varmeblok (60 ° C), mens indlejring hjerner for at forhindre størkning.
- Fjern 1x PBS fra formen indeholder et hjernen ved hjælp af en Pasteur-pipette (diameter 1 mm). Vær forsigtig med ikke at beskadige hjernen.
- Hæld agarose i formen og fylde det helt. Så brug en dissektion nål til at hvirvle hjernen i agarose at vaske væk PTW gør det lettere at integrere hjernen.
- Orient hjernen i formen ventrale nedad, dorsalsiden op og placere det lige.
- Lad agarose afkøle. For hurtigere afkøling, placerer formen på is. Gentag trin.
- Gentag 2.3.3-2.3.6 for alle hjerner.
- Trimning Agarosens Block
- Ved hjælp af en dissektion nål, pop ud agarose blok.
- Med en skarp barberblad skåret agarosen ved den bageste ende af hjernen. Sørg for, at denne plan er parallel med telencephalon.
- Skær agarose ved den forreste ende af hjernen. Derefter vende blokken, så den står på den bageste flyet.
- Fjern det overskydende agarose ved at skære parallelt med hjernens dorsale og ventrale sider. Derefter vende hjernen tilbage, så den ligger på sin ventrale side.
- Skær blok til en trunkeret trekant, hvor telencephalon er placeret på mindre plan (figur 2).
- Klargøring af Vibratome for Skæring
- Forbered vibratome i henhold til producentens anvisninger. Brug en ny barberblad og erstatte det efter 10 hjerner.
- Fyld buffer bad med 1x PBS til et niveau, der lige når bunden af vingen.
- Placer en lille prik af superlim på toppen af prøven skive af vibratome.
- Placer forsigtigt flyet, der er placeret posteriort til hjernen på superlim. Limen hærder, så snart den er i kontakt med 1x PBSden vibratome buffer bad.
- Indsæt objektpladen med modellen i bufferen skuffen ved hjælp af manipulator mikrotomens.
- Brug manipulator til at rotere modellen disken i den ønskede position. Vend blokken i bufferen bad på en måde, der lokaliserer telencephalon lige under overfladen med den dorsale del af hjernen overfor bladet. Stram derefter SCRW med en 3 mm unbrakonøgle og fjern manipulator. Bemærk: Den klemskruen eller en af de fastspændingsanordningerne må ikke placeres over hullet i objektpladen; i disse positioner fastspænde objektpladen er ikke mulig.
- Sektionering hjernen
- Der fremstilles en 24-brønds plade til at samle sektioner. Per hjernen, der skal skæres, fylde en brønd med 1 ml blokerende buffer (0,1% (v / v) 10% Tween-20, 0,2% (w / v) bovint serumalbumin (BSA), 1% (v / v) dimethylsulfoxid (DMSO) i PBS).
- Start skæring ved 50 um tykkelse 1 mm / sek hastighed og 70 Hz frekvensved hjælp af en vibrerende mikrotom.
- Brug en syntetisk børste (1 mm) for at afhente de tynde skiver af agarose, som de kommer fra bladet og samle dem i 24-brønds plade.
- Immunohistokemi på vibratome Sektioner
- Blokere ikke-specifikke bindingssteder i 1 time ved stuetemperatur i blokeringspuffer (0,1% (v / v) 10% Tween 20, 0,2% (w / v) BSA, 1% (v / v) DMSO i PBS).
- Supernatanten fjernes, og der tilsættes 250 ul antistof fortyndet i blokeringsbuffer natten over ved 4 ° C. Alternativt inkuberes primære antistof i 2 timer ved stuetemperatur. Vask derefter 3x 10 min i PTW. Bemærk: PCNA farvning bruge en 1:400 fortynding (muse-anti-PCNA For detaljer se tabel af materialer.). Flere primære antistoffer kan inkuberes på samme tid.
- Inkuber sektioner i sekundært antistof i 2 timer ved stuetemperatur derefter vaskes 3x i 10 minutter i PTW. Bemærk: 1:1000 fortynding i PTW, for detaljer se tabel af materialer. Flere sekundære antistoffer inkuberes samtidig.
- Voksen Brain RNA in situ hybridisering (alternativt til immunhistokemi)
- Brain Dissektion og fiksering (samme procedure som for immunhistokemi):
- Hybridisering af proben.
- Rehydrere hjerner i 2 ml reagensglas som beskrevet for immunhistokemi.
- Inkuber hjerner i proteinase K (ProtK. 10 ug / ml slutkoncentration) i PTW i 30 minutter. Efter inkubationstid fjerne ProtK / PTW og løse hjerner igen i 20 min i BT-Fix (4% PFA, 4% saccharose, 0,12 mM CaCl2, 77 mM Na 2 HPO 4, 23 mM NaH 2 PO 4).
- Vask hjerner 5x i 5 min i PTW (0,1% (v / v) Tween-20 i PBS).
- Fjern PTW og skyl hjernerne i 500 piHYB puffer (50% (v / v) deioniseret formamid, 5x SSC, 500 ug / ml gær-tRNA, 50 ug / ml heparin, 0,1% Tween-20, 9 mM citricacid). Vent hjerner synke til bunden af røret og derefter kasseres supernatanten, og der tilsættes 500 pi rent HYB puffer og inkuberes ved 65-70 ° C i 3-4 timer.
- Fortynd RNA-probe til 1:200 eller 1:400 (afhængigt af sonden) i 400 ul slutvolumen på HYB puffer. Opvarm fortyndet RNA-probe ved 70 ° C i 5 min.
- Fjern supernatanten fra hjerne og tilføje RNA-probe, inkuberes ved 65-70 ° C (O / N). Alle vask bufferopløsninger bør forvarmet og holdt ved 70 ° C.
- Mærkning
- Vask hjerner ved 65-70 ° C (i alle 4 vasketrin) med 500 ul vaskepuffer 1 (50% formamid, 1x SSC, 0,05% Tween 20) to gange i 30 minutter. Udskift puffer 1 af buffer 2 (2x SSC, 0,1% Tween 20) og inkuberes i 15 min. Fjern buffer 2 og vask hjerner i buffer 3 (0,2 x SSC, 0,1% Tween 20) for 30 min, skal du gentage dette trin 2 to gange. Erstat buffer 3 af buffer 4 (0,1 x SSC, 0,05% Tween 20 i PTW), inkuberes i 5 min.
- Fjern supernatanten og vask i 5 min i 500 ul PTW ved RT.
- Integrer hjerner i 2% agarose (i 1x PBS) og skære vibratome sektioner (50-100 um) som beskrevet for immunhistokemi.
- Wash 1x i 5 minutter i 500 pi blokeringspuffer (1x PBS, 0,1% Tween-20, 0,2% (w / v) BSA, 1% (v / v) DMSO).
- Fjern supernatanten og tilsættes 500 pi blokerende buffer i 2 timer ved stuetemperatur.
- Fjern supernatanten og tilsæt 300 ul anti-Dig AP-koblet antistof fortyndet 1:4,000 i blokeringsbuffer.
- Inkuber o / n ved 4 ° C.
- NBT / BCIP Farvning
- Vask 5x i 15 min med PTW buffer ved RT.
- Skyl 1x i farvningsbuffer. Vask to gange 5 minutter i farvning buffer (100 mM Tris / HCI pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCI, 0,1% Tween-20).
- Fjern supernatanten og pletten med 500 μl farveopløsning (3,5 pi 4-Nitroblue tetrazoliumchlorid (NBT) og 5-brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat (BCIP) per 1 ml farvning buffer).
- Stop farvning ved at skylle 3x til 5x med PTW.
- Brain Dissektion og fiksering (samme procedure som for immunhistokemi):
- Montering af sektioner
- Monter afsnittene om objektglas ved hjælp af et vandopløseligt, ikke-fluorescerende monteringsmedium (se Materialer tabel).
- Hold dias i køleskabet ved 4 ° C. Bemærk: Den farvning er stabil i flere uger eller endda måneder.
- Analyser dias under en forbindelse eller konfokal mikroskop.
Representative Results
Brug af arbejdsgangen er beskrevet i denne artikel, var en læsion indført i den højre hjernehalvdel af en voksen zebrafisk telencephalon (figur 1A-1B). En korrekt sårdannelse fører til en læsion kanal, der strækker sig fra ryg til ventralt gennem hele pallium af telencephalon (figur 3C). Læsionen bør begrænses til en af halvkugler og må ikke krydse den mediale ventrikel. Læsionen kanalen er synlig med lysfeltmikroskopi (figur 3C) og vil blive helet efter cirka 35 dage 15..
Det blev tidligere vist, at efter sårdannelse en opregulering af prolifererende celler (PCNA, figur 3A) og S100β (figur 3B) på 3 til 7 dpl kan påvises ved immunhistokemi 15. Den farvning af PCNA og S100β er overlappende, hvilket indikerer spredning af radiale gliaceller.
Furthermore for at visualisere oligodendrocyt precursorceller (OPCs) blev et stiksår assay udføres på Tg (olig2: EGFP) fisk 24. Efter farvning med et anti-GFP-antistof, akkumulering af OPCs tæt på læsionen kanalen er påviselig (figur 3D). Denne ophobning er forbigående, og OPC klynger ikke overholdes længere ved 35 DPL 15.
Hvis læsionen ikke var indført korrekt, vil læsionen kanalen ikke være synlig, og opregulering af PCNA og S100β eller akkumulering af OPCs vil ikke kunne spores. PCNA er den mest følsomme markør for hjerneskade. For at kontrollere effektiviteten af stiksår og udelukke, at begge hjernehalvdele er såret, er det stærkt anbefales altid at plette sektionerne med et anti-PCNA antistof. I et korrekt introduceret læsion bør PCNA være betydeligt opreguleret (op til 4 gange 15) i kun én af de halvkugler. Selv om der i de fleste tilfælde ertilstrækkeligt kun at anvende den kontralaterale unlesioned side som en intern kontrol for at overvåge ændringer i genekspression, er det stærkt anbefales at sammenligne genekspression i kontrolgruppen halvkugle med udtrykket i telencephalic halvkugler af vildtype hjerner. På denne måde kan de systemiske virkninger af læsion på genekspression, som ville påvirke begge halvkugler påvises.
Den stiksår assayet i kombination med et systematisk ekspression skærm af transskription regulatorer (TR'er) (25 og Schmidt et al. Upubliceret) kan også anvendes til at identificere TR gener med en mulig rolle i neurogenese og regenerering (4A-4C).
Denne tilgang har identificeret en række faktorer, der er udtrykt i telencephalon og hvis udtryk er specifikt opreguleret i respons på skade (figur 4A-C).
Figur 2. Schematic repræsentation af en voksen zebrafisk hjerne i en trimmet agarose blok lige før vibratome sektionering. Anterior er op. Lugtekolben (ob), telencephalon (tel), optisk tectum (OT), cerebellum (CB) og medulla (m). Skala bar: 500 um.
Figur 3.. Regenerative svar til stiksår skade. AD) Voksen zebrafisk hjerne på 5 dage efter læsion (DPL). AB) Den proliferative markør PCNA (A) og den radiale glial markør S100β (B) er opreguleret i den ventrikulære zone (pile) på stikke såret. (C) Den læsion kanal er synlig under lyse feltbelysning (pile). Den ventrikulære zone er angivet ved den grønne linie. (D) oligodendrocyt prækursorceller (olig2: EGFP +) akkumuleres på stedet for læsioner (pile). Skala bar: 200 um. I alle paneler, den højre hjernehalvdel er den læderede hemisfære. Dorsal er op. Den stiplede linje i A til D angiver grænsen mellem pallium og subpallium.
Bemærk stærk opregulering (pile) af eomesa (A, B) og sox4a (C)-mRNA-ekspression i den rigtige telencephalic halvkugle (stukket halvkugle) som overvåget fig. 4. Et eksempel på gener opreguleret i respons til at stikke skade. ved in situ hybridisering ved 5 DPL. Den venstre hjernehalvdel er uskadt og tjener som kontrol. (B) viser en større forstørrelse af den dorsale telencephalic region A. Dorsal op. Skala bar: 200 um for A og C og 55 um til B.stiplet linie i A og C angiver adskillelsen mellem pallium og subpallium. Klik her for at se en større version af dette tal.
| FORKORTELSER | |
| AP | Alkalisk phosphatase |
| BCIP | 5-brom-4-chlor-3'-indolyphosphate |
| BSA | Bovint serumalbumin |
| CNS | Centralnervesystemet |
| Dig | Digoxygenin |
| DMSO | Dimethylsulfoxid |
| DPL | Dage efter læsion |
| eomesa | Eomesodermin homolog a |
| GFAP | Gliafibrillært surt protein |
| hr | Time |
| HYBbuffer | Hybridiseringsbuffer |
| ISH | in situ-hybridisering |
| MeOH | Methanol |
| NBT | Nitro-blue tetrazolium |
| OPCs | Oligodendrocyt precursorceller |
| PBS | Phosphatbufret saltvand |
| PCNA | Prolifererende cellekerneantigen |
| PFA | Paraformaldehyd |
| ProtK | Proteinase K |
| PSA-NCAM | Polysialylated neuronal celleadhæsionsmolekyle |
| PTW | PBS, 0,1% Tween-20 |
| RNA | Ribonukleinsyre |
| RT | Rumtemperatur |
| SGZ | Subgranular zone |
| sox4a | SRY-boks, som indeholder gen 4a |
| SSC | Saline-natriumcitrat |
| SVZ | Subventricular zone |
| TRs | Transskription regulatorer |
Discussion
Vi beskriver her en metode til at inducere et telencephalic skade ved at skubbe en nål gennem kraniet af den voksne zebrafisk, og til at analysere den cellulære og molekylære reaktion på denne skade ved immunhistokemi og in situ hybridisering. Den største fordel ved denne teknik i forhold til andre eksisterende metoder er dets enkelhed, hastighed og omkostningseffektivitet. Derfor kan denne teknik, der tillader produktion af mange kvæstede hjerner i en kort tid, let kombineres med en storstilet in situ-hybridisering skærmen for at identificere gener med en rolle i regenerering og neurogenese.
Alderen på den voksne zebrafisk, hvor skaden er udført, er afgørende. Hvis fisken er ældre end 1,5 år kraniet er for hårdt, og det er muligt, at skallen bliver skubbet ned eller brækkede snarere end rent perforeret. I modsætning hertil yngre fisk (yngre end 4 måneder), er der stadig en masse af neurogenese foregår, hvilket kan lead til falske positive resultater med hensyn til reaktiv neurogenesis.
Et andet afgørende skridt i denne tilgang er at kontrollere effektiviteten af stiksår og udelukke, at begge hjernehalvdele er såret. Dette kan overvåges ved farvning af sektioner med anti-PCNA-antistof. I et korrekt introduceret læsion bør PCNA være betydeligt opreguleret i kun én af de halvkugler.
Det er vigtigt at huske på, at den inducerede mekanisk skade vil have flere bivirkninger såsom ikke-specifik celle ablation, øget celledød på grund af sekundær degeneration, inflammation og destruktion af blod-hjerne-barrieren, og beskadigelse af ventrikulær zone og som en mulig konsekvens strøm af cerebrospinalvæsken i hjernen parenkym. Men de sårede fisk vises, til at lide meget lidt fra skaden. Inden for 2 min, de er fritsvømmende igen og normal fodring adfærd er genoprettet inden for ca 4 timer. Efter 3 uger injury morfologisk ikke længere synlig. I vores hænder, fra flere hundrede operationer vi ikke mister en eneste fisk på trods af at vi havde en skade på 100% som vurderet ved histologi på 5 dage efter læsion.
I de seneste år er der udviklet andre teknikker, såsom transgene tilgange i zebrafisk til at producere væv eller celletype specifik ablation 2. Selv om disse teknikker er meget elegant og minimalt invasive de er baseret på den generation af komplicerede DNA-konstruktioner og etablering af flere stabile zebrafisk transgene linier, som kan være meget besværligt og tidskrævende. Derfor simple mekaniske tilgange såsom analysen beskrevet i denne protokol fortsat være et vigtigt værktøj til at studere voksne hjerne neurogenese og regeneration.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine | Sigma | 335.2 | |
| 10x DPBS (-/-) | Life technologies | 14200-083 | |
| 30 G syringe (Omnican 40) | B.Braun Melsungen | 916162 | |
| Polyethylene molding cup tray | Polysciences, Inc | 17177C-3 | |
| PeqGOLD Universal Agarose | Peqlab | 35-1020 | |
| Bovine serum albumin | Biochrom | W 2835919108 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences, Inc | 18606-20 | |
| Tween 20 | Carl Roth | 9127.1 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
| Dissection needle | Carl Roth | KX93.1 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.2 | |
| Loctite 414 | Schöffler und Wörner | 06 1362 0020 | |
| Glass slides | Labonord | 5305103 | |
| Cover slips 24 x 60 mm | Labonord | 5305060 | |
| Petri dishes, 94 mm | Greiner bio-one | 632180 | |
| Falcon tubes, 15 ml | Greiner bio-one | 188261 | |
| 24-well plate | Greiner bio-one | 662160 | |
| Anti-S100 (1:500) | Dako | Z031101-2 | |
| Anti-PCNA (1:400) | Dako | M087901 | |
| Anti-GFP (1:1,000) | Aves Labs | GFP-1020 | |
| anti-Dig AP-coupled antibody | Roche Diagnostics | 11093274910 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Roche Diagnostics | 1383221 | |
| 4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Roche Diagnostics | 1383213 | |
| Proteinase K | Roche Diagnostics | 1092766 | |
| Polyethylene molding cup tray | Polysciences | 17177C-3 | |
| Vibratome VT1000S | Leica | ||
| Confocal microscope Sp5 DM6000 | Leica | ||
| Dissecting microscope Nikon SMZ 645 | Nikon | ||
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon catalog | 353226 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Danio rerio Tg(olig2:EGFP) | Shin et al.24 | ||
| Danio rerio WT strains (e.g., AB2O2) |
References
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72, 429-461 (2012).
- Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis. Nat Rev Neurosci. 12, 88-104 (2011).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32, 638-647 (2009).
- Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Dev. 8, 3 (2013).
- Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the central nervous system of teleost fish. Eur J Neurosci. 34, 917-929 (2011).
- Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. Teleost fish as a model system to study successful regeneration of the central nervous system. Curr Top Microbiol Immunol. 367, 193-233 (2013).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295, 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Dev Biol. 295, 263-277 (2006).
- Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain. J Comp Neurol. 488, 290-319 (2005).
- Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29, 745-757 (2007).
- Hinsch, K., Zupanc, G. K. Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis. Neuroscience. 146, 679-696 (2007).
- Lindsey, B. W., Darabie, A., Tropepe, V. The cellular composition of neurogenic periventricular zones in the adult zebrafish forebrain. J Comp Neurol. 520, 2275-2316 (2012).
- Marz, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58, 870-888 (2010).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240, 2221-2231 (2011).
- Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223, 131-147 (2013).
- Ayari, B., El Hachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon. J Neurotrauma. 27, 959-972 (2010).
- Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis. Glia. 60, 343-357 (2011).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Dis Model Mech. 5, 200-209 (2012).
- Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Dev Cell. 23, 1230-1237 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138, 4831-4841 (2011).
- Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338, 1353-1356 (2012).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Shin, J., Park, H. C., Topczewska, J. M., Mawdsley, D. J., Appel, B. Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics. Methods Cell Sci. 25, 7-14 (2003).
- Armant, O., et al. Genome-wide, whole mount in situ analysis of transcriptional regulators in zebrafish embryos. Dev Biol. 380, 351-362 (2013).
