Abstract
יש לי דג הזברה מבוגר יכולת מדהימה להתחדש מערכת העצבים המרכזית שלהם לאחר פציעה. כדי לחקור את התגובה התאית והמנגנונים המולקולריים מעורבים בהתחדשות מבוגרת דג הזברה מערכת עצבים מרכזי (CNS) ותיקון, שפיתחנו מודל דג הזברה של פגיעת telencephalic מבוגרת.
בגישה זו, שאנו מייצרים באופן ידני על ידי לחיצת פגיעת מחט מזרק אינסולין לtelencephalon מבוגרת דג הזברה. בימים שלאחר פציעה שונות, דגים הקריבו, המוח שלהם הם גזורים החוצה ומוכתם על ידי אימונוהיסטוכימיה ו / או בכלאה באתר (ISH) עם סמנים מתאימים להתבונן התפשטות תאים, gliogenesis, ונוירוגנזה. חצי הכדור unlesioned הנגדי משמש כבקרה פנימית. שיטה זו בשילוב למשל עם רצף עמוק RNA יכול לעזור למסך לגנים חדשים עם תפקיד בנוירוגנזה telencephalon המבוגר, התחדשות, ותיקון דג הזברה.
Introduction
ליונקים יש יכולת מוגבלת מאוד ליצירת תאי עצב חדש במהלך חיים בוגרים, ונוירוגנזה הבוגרת במוח בעיקר מוגבלת לשני אזורי telencephalic ממוקמים באזור subventricular (SVZ) של חדרים לרוחב, ואזור subgranular (SGZ) של משוננת gyrus בהיפוקמפוס 1. יונקים גם לא יכולים לתקן את הנזק במוח שנגרם על ידי מחלות ניווניות, שבץ, או פציעות, ביעילות. נוירונים שאבדו אינם מוחלפים ובמקום ריבוי סוגים שונים של תאי גליה, כוללים האסטרוציטים, מיקרוגלים, וoligodendrocytes של, הוא ציין. כתוצאה מתהליך השגשוג הזה שנקראת דבקה תגובתי, רקמת המוח נפגעה חסומה על ידי ההיווצרות של צלקת גליה, אשר מעכבת התחדשות עצבית וaxonal 2-4.
בניגוד ליונקים, דגי חוליות כמו דג הזברה ליצור נוירונים חדשים בשפע בשלבים בוגרים ויש לי משובי וproliferat גבוהיםive פוטנציאל לתיקון נגעים במערכת העצבים המרכזית 2,5-7. המוח מבוגר דג הזברה מכיל 16 נישות עצביות שונות בתאי גזע שיוצרות מספר רב של תאי עצב חדשים במהלך כל חיי 8-11. נוירונים שנולדו באזורי ההתפשטות הספציפיים אלה של מוח דג הזברה המבוגר להגר לאזורי היעד שלהם, שבו הם יבשילו ולהשתלב ברשתות עצביות קיימות 8,10,12-15.
בין אזורי האב שזוהו בדג זברה מבוגרת, אזור חדרית telencephalic הוא אחד מהנישות של תאי גזע עצביים הנחקרות ביותר. תאים בנישה של אב זה יכול להיות מסווג לשלושה סוגים ברורים לגבי המורפולוגיה, השיעור והביטוי של גליה שונה או סמנים עצביים החלוקה שלהם. אני סוג ותאי סוג II הם גליה רדיאלי כמו תאים שיש להם תהליכים ארוכים. הם מבטאים סמני תאי גזע כולל GFAP, nestin, וS100β. אני תאי סוג לא להתרבות ואילו הסוג השני תאים proliferatדואר לאט, כפי שמעיד ביטוים של סמני התפשטות כגון מתרבים אנטיגן התא גרעיני (PCNA) ושילוב של אנלוגים desoxythymidine. תאי III הסוג מהירים מתחלקים תאים שמחויבים להפכו אבות עצביים ולבטא גני סמן עצביים, כגון PSA-NCAM 5,16.
למרות יכולות התחדשות של דגי חוליות מתועדות היטב, רק כמה פרסומים שתיארו וחקרו בפירוט המנגנונים התאיים ומולקולריים מעורבים בהתחדשות עצבית בtelencephalon המבוגר בתגובה לפציעה 15,17-22. לפענח את המנגנונים מעורבים בהתחדשות דג הזברה מבוגרת של מערכת עצבים מרכזית ותיקון ולהבין את קווי דמיון ואת ההבדלים בין נוירוגנזה המכוננת ומשובים, פיתחנו מודל דג הזברה של פגיעת telencephalic מבוגרת. כאן, אנו מתארים באופן חזותי כיצד ליצור פגיעה באחד מhemisph telencephalicEres בעזרת מחט מזרק, תוך שמירה על צד unlesioned הנגדי כבקרה פנימית. אנחנו גם נציג כיצד לעקוב אחר שינויים על פציעה בשגשוג תאים וביטוי גנים על ידי אימונוהיסטוכימיה ובמבחני הכלאה באתר.
Protocol
דג הזברה נשמרה במתקן הדגים של המכון לטוקסיקולוגיה והגנטיקה (ITG) בקרלסרוהה המכון טכנולוגי (KIT). ניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם לסטנדרטים להגנת בעלי חיים הגרמנים ואושרו על ידי הממשלה באדן וירטמברג, Regierungspräsidium קרלסרוהה, גרמניה (Aktenzeichen 35-9,185.81 / G-272/12 'Adulte Neurogenese').
.1 יצירת פצע דקירה בtelencephalon
- הרדמה
- כדי להכין פתרון מניות של tricaine (אתיל אסתר חומצת benzoic 3-אמינו, המכונה גם אתיל 3-aminobenzoate) להשתמש 400 מ"ג של אבקת tricaine ולפזר אותו ב97.9 מ"ל מים ו2.1 מ"ל 1 חיץ M טריס / HCl (pH 9). התאם את רמת החומציות ל.7 Make 5 aliquots מ"ל ולאחסן אותם ב-20 ° C עד שימוש.
- העבר את המספר מתאים של דג הזברה ישנה 0.5-1 שנה מהטנקים שלהם לתוך כלובי עכבר פלסטיק. הערה: הגולגולת של דג הזברה מבוגרת בכ -12חודשים של גיל הוא עדיין רכים יחסית ויכולים להיות מחוררים בקלות עם מחט (ראה סעיף 1.2.3 והאיור 1 א).
- כדי להרדים את דג הזברה המבוגר, משלב 5 מ"ל tricaine (פתרון מניות) בכלוב מעבר פלסטיק עם דגים מכל מים נקיים (ריכוז הסופי של 0.02% tricaine (w / v) tricaine) ~ 100 מ"ל.
- דגירה הדגים בהרדמה עד שהם לא זזים יותר (שניות 45-60).
- Telencephalon פגיעה
- הנח דג הזברה מורדם בודדת לתוך חריץ בבלוק של קצף ספוג tricaine.
- תחת מיקרוסקופ לנתח עם אור מלמעלה בעדינות להחזיק את הדגים ביד אחת ולכוון אותו באופן שמאפשר גישה לראש מהחלק העליון.
- עם היד השנייה דוחף 30 מזרק G (מזרק אינסולין עם מחט משולבת) אנכי דרך הגולגולת לאזור המדיאלי של חצי הכדור אחד telencephalic (איורים 1 א-1B). ההמיספרות של telencephalonמחדש גלוי דרך הגולגולת. לוודא כי הנגע הציג אינו עמוק יותר מ 2 מ"מ (איור 1 ג). הערה: מומלץ מאוד להציג את הנגע תמיד לאותו חצי הכדור כדי להקל על זיהוי של האתר של נגע כאשר לנתח את המוח של הגולגולת.
- אחרי שהצגתי את פגיעת telencephalic, הנח את הדג למים דגים טריים. שמור עד 10 דגים בכלוב 2 עכבר L מלא במי דגים להתאוששות ולחבר את כלוב העכבר למערכת זרימת מים. הערה: שיעור ההישרדות הוא בדרך כלל ~ 97% אם דגים הם בריאים ואין ניסויים אחרים שבוצעו עם הדגים בעבר. תוספת של אנטיביוטיקה למים דגים לא הכרחית. לאחר התאוששות, דגים להתנהג כרגיל: הם שוחים, להאכיל, ובן זוג.
2. ניתוח ההשפעה של telencephalic פגיעה
- המוח Dissection וקיבוע
- Re-לטשטש הדגים התאוששו בנקודות זמן שונות לאחר הנגע (typically, 1, 3, 5, ו14 ימים שלאחר פגיעה (DPL)) עם 0.02% (w tricaine / V) כאמור לעיל ולהרדים אותם על ידי לשים אותם לתוך מי קרח למשך 5 דקות.
- מניחים את הדגים על ממחטת נייר הספוגה בפוספט שנאגרו מלוח (PBS) ולהפריד את הראש מהגוף על ידי חיתוך מאחורי הזימים עם מספריים חדים.
- שמור את הראשים ב1x PBS במשך 5 דקות על מנת לאפשר לדימום. שים לב: זה מנקז את דם מהרקמה, דבר שעלול להפריע את המשך צעדיו בפרוטוקול.
- תקן את ראשי לילה בשעה 4 ° C בparaformaldehyde% 4 (PFA) ב-PBS או 4 שעות בטמפרטורת חדר (RT).
- שטפו ראשים קבועים פעמיים עם 1x PBS בצלחת פטרי.
- לנתח את המוח בזהירות ב1x PBS תחת מיקרוסקופ לנתח 23. הנגע הוא בדרך כלל גלוי תחת מיקרוסקופ לנתח. מוחות ללא נגע גלוי צריכים להיות מושלכים.
- העבר את המוח לתוך 2 צינורות תגובת מיליליטר מלאים במתנול 1.5 מיליליטר 100% (MeOH) ולהפוך את צינורות 5x לפני דוגריםשלהם ב-20 מעלות צלזיוס למשך לפחות 16 שעות. הערה: יכול להיות כל הזמן המוח במשך מספר חודשים בMeOH ב -20 ° C עד הצורך לאימונוהיסטוכימיה או הכלאה באתר.
- הכנת רקמה לאימונוהיסטוכימיה
- רעננותם המוח באמצעות סדרת מתנול יורדת בצינורות 2 מ"ל פלסטיק (ברצף 75% MeOH (1x PBS, 0.1% Tween-20 = PTW); MeOH, 15 מוח / 2 מ"ל צינורות 50% 25% MeOH דגירה המוח (תגובה. ) במשך 5 דקות בכל פתרון.
- שטוף את מוחם בPTW במשך 5 דקות. חזור על 4x עם PTW הטרי.
- הטבעה של המוח לחתך
- להטבעה, להעביר את המוח מצינור תגובת 2 מ"ל בPTW לתוך החללים של מגש כוס דפוס פוליאתילן עם pipet העברה (בקוטר 5 מ"מ).
- הכן agarose 2% (כיתה DNA) בPBS 1x בבקבוק Erlenmeyer. מחממים אותה במיקרוגל ב600 W עד agarose נמס לגמרי. הכן 50 מ"ל ל10 מוח. בואו הדואר agarose להתקרר למשך 3 דקות בטמפרטורת חדר לפני השימוש. שמור agarose על בלוק חימום מחומם מראש (C ° 60) תוך הטבעת המוח כדי למנוע התמצקות.
- הסר את PBS 1x מהעובש המכיל מוח אחד באמצעות פיפטה פסטר (בקוטר של 1 מ"מ). היזהר שלא לגרום נזק למוח.
- יוצקים agarose לתוך התבנית ולמלא אותו לגמרי. לאחר מכן השתמשתי במחט לנתיחה כדי לערבל את המוח בagarose כדי לשטוף את PTW מה שמקל להטביע את המוח.
- אוריינט המוח בצד הגחון העובש למטה, למעלה בצד גב ומניחים אותו ישר.
- בואו agarose להתקרר. לקירור מהיר יותר, הנח את התבנית על קרח. חזור על שלבים.
- חזור 2.3.3-2.3.6 לכל המוחות.
- זמירה של הבלוק agarose
- באמצעות מחט לנתיחה, קופץ החוצה בלוק agarose.
- בסכין גילוח חד, לחתוך את agarose בקצה האחורי של המוח. ודא המטוס הזה הוא מקביל לtelencephalon.
- חותך את agarose בקצה הקדמי של המוח. אז להעיף את הבלוק כך שהוא עומד על המטוס האחורי.
- להסיר את העודפים של agarose על ידי חיתוך במקביל לגב של המוח וצדדי הגחון. אז להעיף את המוח אחורי, כך שהוא שוכב על צד הגחון שלה.
- חותך את הגוש למשולש קטום שבי telencephalon ממוקמת במטוס הקטן יותר (איור 2).
- הכנת Vibratome עבור חתך
- הכן את vibratome על פי הוראות היצרן. השתמש בסכין גילוח חדש ולהחליף אותו אחרי 10 מוח.
- מלא את אמבט החיץ עם 1x PBS לרמה שרק מגיעה לתחתית של הלהב.
- הנח נקודה קטנה של דבק מגע בחלקו העליון של דיסק הדגימה של vibratome.
- בזהירות להניח את המטוס שנמצא אחורי למוח בדבק המגע. הדבק יקשיח ברגע שהיא נמצאת בקשר עם PBS 1x בהאמבטיה חיץ vibratome.
- הכנס את דיסק הדגימה עם הדגימה למגש החיץ באמצעות מניפולטור של microtome.
- השתמש מניפולטור כדי לסובב את דיסק הדגימה למיקום הרצוי. כוון את הבלוק באמבטיה החיץ באופן שמאתר את telencephalon רק מתחת לפני השטח, עם חלק הגבי של המוח פונה לכיוון הלהב. ואז להדק את scrw עם מפתח אלן 3 מ"מ ולהסיר מניפולטור. הערה: בורג ההידוק או אחד מהתקני ההידוק לא חייב להיות ממוקמים על הפער בדיסק הדגימה; בתפקידים אלה מהדק את דיסק הדגימה אינו אפשרי.
- חתך המוח
- הכן צלחת 24 גם כדי לאסוף את החלקים. למוח להיות מחולק, למלא אחד גם עם 1 מ"ל של (0.1% חיץ החסימה (V / V) 10% Tween-20, 0.2% (w / v) אלבומין בסרום שור (BSA), 1% (v / v) sulfoxide דימתיל (DMSO) בPBS).
- התחל חתך ב50 מיקרומטר עובי, מ"מ 1 / מהירות שניות, ו70 תדר Hzבאמצעות microtome רוטט.
- להשתמש במברשת סינתטית (1 מ"מ) כדי להרים את פרוסות דקות של agarose כפי שהם באים מאת הלהב ולאסוף אותם בצלחת 24 גם.
- אימונוהיסטוכימיה על סעיפים Vibratome
- לחסום את אתרי הקישור שאינם ספציפיים עבור שעה 1 ב RT בחסימת מאגר (0.1% (v / v) Tween 10% 20, 0.2% (w BSA, 1% (v DMSO / V) / V) ב-PBS).
- הסר את supernatant ולהוסיף 250 μl של נוגדן בדילול מלא בחסימת מאגר הלילה בשעה 4 ° C. לחלופין, דגירה הנוגדן הראשוני במשך שעה 2 ב RT. לאחר מכן לשטוף 3x עבור 10 דקות בPTW. הערה: עבור מכתים PCNA להשתמש דילול 1:400 (עכבר אנטי PCNA לפרטים ראו טבלה של חומרים.). ניתן מודגרות נוגדנים ראשוניים מרובים באותו הזמן.
- דגירה הסעיפים בנוגדנים משני עבור שעה 2 ב RT ולאחר מכן לשטוף 3x עבור 10 דקות בPTW. הערה: 1:1,000 דילול בPTW, לפירוט ראה טבלה של חומרים. ניתן מודגרות נוגדנים משניים מרובים באותו הזמן.
- RNA מבוגרים המוח באתרו הכלאה (לחלופין אימונוהיסטוכימיה)
- המוח Dissection וקיבוע (הליך זהה לאימונוהיסטוכימיה):
- הכלאה של חללית.
- רעננותם מוחות ב2 צינורות תגובת מיליליטר כפי שתואר עבור אימונוהיסטוכימיה.
- דגירה המוח בproteinase K (ProtK;. 10 מיקרוגרם / קונצרט כלשהו סופי מיליליטר) בPTW ל30 דקות. לאחר זמן דגירה להסיר ProtK / PTW ולתקן את מוחם שוב ל20 דקות בBT-Fix (PFA 4%, סוכרוז 4%, 0.12 מ"מ CaCl 2, 77 מ"מ Na 2 HPO 4, 23 מ"מ אא 2 PO 4).
- שטוף את המוח של 5x למשך 5 דקות בPTW (0.1% (v / v) Tween-20 PBS).
- הסר PTW ולשטוף את מוחם ב500 μlחיץ היב (50% (v / v) פוראמיד deionized, 5x SSC, 500 מיקרוגרם / tRNA שמרי מיליליטר, 50 מיקרוגרם / מיליליטר הפרין, Tween-20 0.1%, 9 מ"מ citricacid). חכה עד שמוחם לשקוע לתחתית של התחתית ואז להשליך את supernatant ולהוסיף 500 μl של חיץ היב הנקי ולדגור על C ° 65-70 ל3-4 שעות.
- לדלל את הבדיקה RNA ל1:200 או 1:400 (תלוי בבדיקה) ב400 נפח סופי μl של חיץ היב. מחממים את הבדיקה RNA המדולל ב 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- הסר supernatant מהמוחה ולהוסיף את הבדיקה RNA, דגירה על C ° 65-70 (O / N). יש prewarmed כל הפתרונות לשטוף החיץ והמשיכו ב70 ° C.
- תיוג
- שטוף את מוחם בC ° 65-70 (במהלך כל 4 שלבי הכביסה) עם 500 μl של חיץ לשטוף 1 (פוראמיד 50%, 1x SSC, 0.05% Tween 20) פעמיים ל30 דקות. החלף חיץ 1 על ידי חיץ 2 (2x SSC, 0.1% Tween 20), דגירה במשך 15 דקות. הסרת חיץ 2 ולשטוף את המוח בחיץ 3 (SSC 0.2X, 0.1% Tween 20) עבורr 30 דקות, לחזור על פעולה זו 2 פעמיים. החלף חיץ 3 על ידי חיץ 4 (SSC 0.1x, 0.05% Tween 20 בPTW), דגירה של 5 דקות.
- הסר supernatant ולשטוף למשך 5 דקות ב500 μl של PTW ב RT.
- שבץ המוח בagarose 2% (ב1x PBS) ולחתוך חלקי vibratome (50-100 מיקרומטר) כפי שתואר עבור אימונוהיסטוכימיה.
- לשטוף 1x למשך 5 דקות ב500 μl חסימת חיץ (1x PBS, Tween-20 0.1%, 0.2% (w / v) ארגון ה-BSA, 1% (v / v) DMSO).
- הסר supernatant ולהוסיף 500 μl חסימת חיץ במשך שעה 2 ב RT.
- הסר supernatant ולהוסיף 300 μl נוגדן בשילוב-AP אנטי לחפור בדילול 1:4,000 בחסימת מאגר.
- דגירה o / n ב 4 ° C.
- NBT / BCIP מכתים
- שטוף 5x לדקות 15 עם חיץ PTW ב RT.
- יש לשטוף 1x חיץ מכתים. לשטוף פעמיים 5 דקות בחיץ מכתים (100 מ"מ טריס / HCl pH 9.5, 50 מ"מ MgCl 2, 100 mM NaCl, Tween-20 0.1%).
- הסר supernatant וכתם עם 500 μפתרון מכתים ליטר (3.5 μl של כלוריד 4-Nitroblue tetrazolium (NBT) ו-5-Bromo-4-כלורו-3-indolyl פוספט (BCIP) לכל 1 מיליליטר חיץ מכתים).
- תפסיק מכתים ידי שטיפת 3x פי 5 עם PTW.
- המוח Dissection וקיבוע (הליך זהה לאימונוהיסטוכימיה):
- הרכבה של סעיפים
- הר את הסעיפים בשקופיות באמצעות, הרכבה בינונית לא פלורסנט מסיס במים (ראה טבלת החומרים).
- שמור שקופיות במקרר ב 4 ° C. הערה: הכתמים הוא יציבים במשך כמה שבועות או אפילו חודשים.
- נתח את השקופיות מתחת למתחם או מיקרוסקופ confocal.
Representative Results
שימוש בזרימת העבודה מתוארת במאמר זה, נגע הוכנס לאונה הימנית של telencephalon דג הזברה מבוגר (איורים 1 א-1B). פציעה נכונה מובילה לתעלת נגע המשתרעת מגב אל הגחון דרך כל pallium של telencephalon (איור 3 ג). הנגע צריך להיות מוגבל לאחת מהאונות ולא צריך לחצות את החדר המדיאלי. תעלת הנגע גלויה עם מיקרוסקופיה בהירה שדה (איור 3 ג) ותהיה נרפאה לאחר כ 35 ימים 15.
הוא הראה בעבר כי לאחר פציעתם עד ויסות של מתרבים אנטיגן גרעין התא (PCNA; איור 3 א) וS100β (איור 3 ב) בשעה 3 עד 7 DPL ניתן לזהות על ידי אימונוהיסטוכימיה 15. ההכתמה של PCNA וS100β היא חופף, מה שמעיד התפשטות של תאי גלייה רדיאלי.
Furthermore, כדי להמחיש תאים מבשר oligodendrocyte (OPCs), assay פצע דקירה בוצע על Tg (olig2: EGFP) דגים 24. לאחר צביעה עם נוגדן אנטי-GFP, הצטברות של OPCs בסמיכות לתעלת הנגע ניתן לזהות (איור 3D). הצטברות זו היא חולפת, ואשכולות OPC לא נצפו עוד ב35 DPL 15.
אם הנגע לא הוצג כראוי, תעלת הנגע לא תהיה גלויה, ועד הוויסות של PCNA וS100β או הצטברות של OPCs לא תהיה זיהוי. PCNA הוא הסמן רגיש ביותר לפגיעה מוחית. על מנת לאמת את היעילות של פצע הדקירה וכדי לשלול כי שני ההמיספרות פצועים, מומלץ מאוד תמיד להכתים את החלקים עם נוגדן אנטי PCNA. בנגע הציג בצורה נכונה, PCNA צריך להיות באופן משמעותי (עד 4 פי 15) רק באחת מהאונות מוסדרות למעלה. למרות שברוב המקרים הואמספיק כדי להשתמש רק בצד הנגדי unlesioned כבקרה פנימית כדי לעקוב אחר שינויים בביטוי גנים, מומלץ מאוד להשוות ביטוי גנים בחצי כדור השליטה עם הביטוי בההמיספרות telencephalic של מוח מסוג בר. בדרך זו, כל תופעות מערכתיות של הנגע על ביטוי גנים שישפיע על שני חצאים ניתן לאתרם.
דקירת פצע assay בשילוב עם מסך שיטתי ביטוי של רגולטורים שעתוק (TRS) (25 ושמידט et al., לא פורסם) יכול לשמש גם לזיהוי גנים TR עם תפקיד אפשרי בנוירוגנזה והתחדשות (איורים 4 א-4C).
גישה זו זיהתה מספר גורמים שבאים לידי ביטוי בtelencephalon וביטויו הוא מוסדר מעלה במיוחד בתגובה לפציעה (איור 4A-C).
איור 2. Sייצוג chematic של מוח דג הזברה מבוגר בבלוק agarose גזוז ממש לפני vibratome חתך. הקדמי הוא למעלה. הנורה חוש הריח (OB), telencephalon (טל), tectum האופטי (OT), המוח הקטן (CB) ומדולה (מ '). סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר.
איור 3. תגובות הרגנרציה לדקור פציעת פצע. מוח דג הזברה למבוגר לספירה) בשעה 5 ימים הודעת נגע (DPL). PCNA שגשוג הסמן () וסמן גליה רדיאלי S100β (ב AB)) הוא מוסדר מעלה באזור חדרית (חיצים) על פציעת דקירה. (C) ערוץ הנגע גלוי תחת תאורה בהירה שדה (חיצים). אזור חדרית מצויינים על ידי הקו הירוק. תאים (ד ') מבשר oligodendrocyte (olig2: EGFP +) לצבור באתר של נגע (חיצים). סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. בכל הפנלים, האונה הימנית היא האונה lesioned. גב הוא למעלה. הקו המקווקו לD מציין את הגבול בין pallium וsubpallium.
איור 4. דוגמא של גנים מעלה מוסדר-בתגובה לדקור פציעה. הערה עד הוויסות החזקה (חיצים) של eomesa (A, B) וביטוי sox4a (C) mRNA בחצי כדור telencephalic תקין (בחצי הכדור נדקר) כפיקוח על ידי הכלאה באתר ב5 DPL. ההמיספרה השמאלית היא ללא כל פגע ומשמשת כבקרה. (ב) מראה בהגדלה גבוהה יותר של אזור telencephalic הגבי של א הגבי היא למעלה. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר עבור A ו-C ו55 מיקרומטר לB.קו מקווקו ובC מציינת את ההפרדה בין pallium וsubpallium. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| קיצורים | |
| AP | אלקליין פוספטאז |
| BCIP | 5-bromo-4-כלורו-3'-indolyphosphate |
| ארגון ה-BSA | אלבומין בסרום שור |
| מערכת העצבים המרכזית | מערכת עצבים מרכזית |
| לחפור | Digoxygenin |
| DMSO | sulfoxide דימתיל |
| DPL | ימים שלאחר פגיעה |
| eomesa | homolog Eomesodermin |
| GFAP | חלבון חומצי fibrillary גליה |
| שעה | שעה |
| היבחוצץ | מאגר הכלאה |
| ISH | הכלאה באתר |
| MeOH | מתנול |
| NBT | tetrazolium הכחול ניטרו |
| OPCs | תאים מבשר oligodendrocyte |
| PBS | פוספט שנאגרו מלוח |
| PCNA | מתרבים אנטיגן גרעין התא |
| PFA | Paraformaldehyde |
| ProtK | Proteinase K |
| PSA-NCAM | מולקולת הידבקות תא עצבית Polysialylated |
| PTW | 20 Tween-PBS, 0.1% |
| RNA | חומצה ריבונוקלאית |
| RT | טמפרטורת חדר |
| SGZ | אזור subgranular |
| sox4a | SRY קופסה המכילה 4 א הגן |
| SSC | ציטראט מלוחים נתרן |
| SVZ | אזור subventricular |
| TRS | רגולטורים תמלול |
Discussion
אנו מתארים כאן שיטה כדי לגרום לפגיעת telencephalic ידי דחיפת מחט דרך הגולגולת של דג הזברה המבוגר, ולנתח את התגובה התאית ומולקולרית לפגיעה זו על ידי אימונוהיסטוכימיה וכלאה באתרו. היתרון העיקרי של שיטה זו על פני גישות אחרות קיימות הוא הפשטות, מהירותו ויעילות כלכלית. לכן, בטכניקה זו, המאפשרת ייצור של מוח נפגע רבים בזמן קצר, יכולה להיות משולבת בקלות עם בקנה מידה גדולה במסך הכלאה באתר לזיהוי גנים בעלי תפקיד בהתחדשות ונוירוגנזה.
גיל דג הזברה המבוגר שבפגיעה מתבצעת הוא קריטי. אם הדגים ישנים יותר 1.5 שנים, הגולגולת היא קשה מדי וזה אפשרי, כי הגולגולת הוא נדחפה למטה או שבר ולא בצורה נקיה מחורר. לעומת זאת, בדגים צעירים (מתחת לגיל 4 חודשים), יש עדיין הרבה נוירוגנזה קורה, שאולי לאהד לתוצאות חיוביות כוזבות לגבי נוירוגנזה תגובתי.
עוד צעד קריטי בגישה זו הוא כדי לוודא את היעילות של פצע הדקירה וכדי לשלול כי שני ההמיספרות פצועים. זה יכול להיות במעקב על ידי צביעת החלקים עם הנוגדן אנטי PCNA. בנגע הציג בצורה נכונה, PCNA צריך להיות באופן משמעותי מוסדר למעלה רק באחת משתי מחציות המוח.
חשוב לזכור כי הפגיעה מכאנית המושרית תהיה כמה תופעות לוואי כגון אבלציה אינה ספציפית תא, מוות של תאים גדל בגלל ניוון המשני, דלקת והרס של מחסום דם המוח, ונזק של אזור חדרית וכמו זרימה אפשרית תוצאה של נוזל השדרה למוח parenchyma. עם זאת, הדגים הפצועים נראים סובלים מעט מאוד מהפציעה. תוך 2 דקות הם חייה שוב חופשית ונורמלית התנהגות האכלה משוחזרת בתוך כ 4 שעות. לאחר 3 שבועות injury הוא מורפולוגית אינה גלוי יותר. בידיים שלנו, מכמה מאה ניתוחים שאנחנו לא אבדנו את דג בודד למרות שהיו לנו שיעור פגיעה 100% כפי שהוערך על ידי היסטולוגיה ב 5 ימים לאחר נגע.
בשנים האחרונות טכניקות אחרות כגון גישות מהונדסים פותחו בדג הזברה לייצר רקמה או אבלציה סוג תא מסוימת 2. למרות שהשיטות אלה הן מאוד אלגנטיות ופולשנית שהם מבוססים על הדור של בונה DNA מסובכת והקמה של מספר קווים מהונדסים דג הזברה יציב אשר יכול להיות מאוד משעמם וזמן רב. לכן, גישות פשוטות מכאניות כגון assay שתואר בפרוטוקול זה יישאר כלי חשוב ללמוד נוירוגנזה מוח בוגרת והתחדשות.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine | Sigma | 335.2 | |
| 10x DPBS (-/-) | Life technologies | 14200-083 | |
| 30 G syringe (Omnican 40) | B.Braun Melsungen | 916162 | |
| Polyethylene molding cup tray | Polysciences, Inc | 17177C-3 | |
| PeqGOLD Universal Agarose | Peqlab | 35-1020 | |
| Bovine serum albumin | Biochrom | W 2835919108 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences, Inc | 18606-20 | |
| Tween 20 | Carl Roth | 9127.1 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
| Dissection needle | Carl Roth | KX93.1 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.2 | |
| Loctite 414 | Schöffler und Wörner | 06 1362 0020 | |
| Glass slides | Labonord | 5305103 | |
| Cover slips 24 x 60 mm | Labonord | 5305060 | |
| Petri dishes, 94 mm | Greiner bio-one | 632180 | |
| Falcon tubes, 15 ml | Greiner bio-one | 188261 | |
| 24-well plate | Greiner bio-one | 662160 | |
| Anti-S100 (1:500) | Dako | Z031101-2 | |
| Anti-PCNA (1:400) | Dako | M087901 | |
| Anti-GFP (1:1,000) | Aves Labs | GFP-1020 | |
| anti-Dig AP-coupled antibody | Roche Diagnostics | 11093274910 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Roche Diagnostics | 1383221 | |
| 4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Roche Diagnostics | 1383213 | |
| Proteinase K | Roche Diagnostics | 1092766 | |
| Polyethylene molding cup tray | Polysciences | 17177C-3 | |
| Vibratome VT1000S | Leica | ||
| Confocal microscope Sp5 DM6000 | Leica | ||
| Dissecting microscope Nikon SMZ 645 | Nikon | ||
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon catalog | 353226 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Danio rerio Tg(olig2:EGFP) | Shin et al.24 | ||
| Danio rerio WT strains (e.g., AB2O2) |
References
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72, 429-461 (2012).
- Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis. Nat Rev Neurosci. 12, 88-104 (2011).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32, 638-647 (2009).
- Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Dev. 8, 3 (2013).
- Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the central nervous system of teleost fish. Eur J Neurosci. 34, 917-929 (2011).
- Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. Teleost fish as a model system to study successful regeneration of the central nervous system. Curr Top Microbiol Immunol. 367, 193-233 (2013).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295, 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Dev Biol. 295, 263-277 (2006).
- Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain. J Comp Neurol. 488, 290-319 (2005).
- Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29, 745-757 (2007).
- Hinsch, K., Zupanc, G. K. Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis. Neuroscience. 146, 679-696 (2007).
- Lindsey, B. W., Darabie, A., Tropepe, V. The cellular composition of neurogenic periventricular zones in the adult zebrafish forebrain. J Comp Neurol. 520, 2275-2316 (2012).
- Marz, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58, 870-888 (2010).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240, 2221-2231 (2011).
- Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223, 131-147 (2013).
- Ayari, B., El Hachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon. J Neurotrauma. 27, 959-972 (2010).
- Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis. Glia. 60, 343-357 (2011).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Dis Model Mech. 5, 200-209 (2012).
- Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Dev Cell. 23, 1230-1237 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138, 4831-4841 (2011).
- Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338, 1353-1356 (2012).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Shin, J., Park, H. C., Topczewska, J. M., Mawdsley, D. J., Appel, B. Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics. Methods Cell Sci. 25, 7-14 (2003).
- Armant, O., et al. Genome-wide, whole mount in situ analysis of transcriptional regulators in zebrafish embryos. Dev Biol. 380, 351-362 (2013).
