Abstract
Vuxna zebrafisk har en fantastisk förmåga att återskapa sin centrala nervsystemet efter skada. För att undersöka den cellulära svar och de molekylära mekanismer som är inblandade i zebrafisk vuxna centrala nervsystemet (CNS) förnyelse och reparation, vi utvecklat en zebrafisk modell för vuxen telencephalic skada.
I denna strategi, vi genererar en skada manuellt genom att trycka en insulininjektionsnålen i zebrafisk vuxna telencefalon. Vid olika postskade dagar, fisken avlivas, deras hjärnor dissekerades ut och färgades genom immunhistokemi och / eller in situ-hybridisering (ISH) med lämpliga markörer för att observera cellproliferation, gliogenesis och neurogenes. Den kontra unlesioned halvklotet fungerar som en intern kontroll. Denna metod i kombination med t.ex. RNA djupt sekvensering kan hjälpa till skärmen för nya gener med en roll i zebrafisk vuxen telencefalon neurogenesis, förnyelse och reparation.
Introduction
Däggdjur har en mycket begränsad förmåga att generera nya nervceller under vuxenlivet, och vuxen neurogenes i hjärnan är oftast begränsad till två telencephalic regioner som ligger vid subventrikulära zonen (SVZ) av de laterala ventriklarna, och den subgranular zonen (SGZ) i gyrus gyrus i hippocampus 1. Däggdjur kan inte heller reparera skador i hjärnan orsakad av neurodegenerativa sjukdomar, stroke, eller skador, effektivt. Förlorade neuroner inte ersätts och istället proliferation av olika typer av gliaceller, inklusive astrocyter, mikroglia och oligodendrocyter, observeras. Som en konsekvens av denna proliferativa process kallad reaktiv glios är skadad hjärnvävnad avtätad genom bildning av en glia-ärr, som inhiberar neuronal och axonal återbildning 2-4.
I motsats till däggdjur, teleost fisk som zebrafisk bilda nya nervceller rikligt i vuxenstadier och har en hög regenerativa och proliferative potential för att reparera skador i det centrala nervsystemet 2,5-7. Den zebrafisk vuxna hjärnan innehåller 16 olika neurala stamceller nischer som genererar ett stort antal nya nervceller under hela livet 8-11. Nervceller födda i dessa specifika spridningszoner den vuxna zebrafisk hjärnan migrera till målområdena, där de kommer att mogna och integreras i de befintliga neuronala nätverk 8,10,12-15.
Bland prekursorcellerna zoner som identifierats i vuxen zebrafisk, är det telencephalic kammarzonen en av de mest studerade neuronala stamceller nischer. Celler i denna stamfader nisch kan delas in i tre olika typer om deras morfologi, division hastighet och uttryck av olika gliaceller eller neuronala markörer. Typ I och typ II-celler är radiella gliaceller liknande celler som har långa processer. De uttrycker stamceller markörer inklusive GFAP, nestin och S100β. Typ I cellerna inte föröka sig medan typ II-celler proliferate långsamt, vilket framgår av deras uttryck av proliferationsmarkörer såsom prolifererande cellkärnantigen (PCNA) och införlivandet av desoxythymidine analoger. Typ III cellerna snabbt delande celler som har åtagit sig att bli neurala stamceller och uttrycka neurala markörgener, såsom PSA-NCAM 5,16.
Även de regenerativa kapacitet teleost fisk är väl dokumenterade, har bara några publikationer beskrivs och undersöks i detalj de cellulära och molekylära mekanismer som är involverade i neuronal regeneration i den vuxna telencefalon som svar på skada 15,17-22. För att dechiffrera de mekanismer som är inblandade i zebrafisk vuxna centrala nervsystemet förnyelse och reparation och för att förstå likheter och skillnader mellan konstitutiva och regenerativ neurogenes, vi utvecklat en zebrafisk modell för vuxen telencephalic skada. Här kommer vi att beskriva visuellt hur man skapar en skada i en av de telencephalic hemispheres med hjälp av en sprutnål, medan det kontralate unlesioned sidan som en intern kontroll. Vi kommer också att visa hur man kan övervaka förändringar vid skador i celltillväxt och genuttryck genom immunhistokemi och in situ hybridisering analyser.
Protocol
Zebrafisk bibehölls i fiskanläggningen för Institutet för toxikologi och genetik (ITG) vid Karlsruhe Institute of Technology (KIT). Försök på djur har utförts i enlighet med de tyska djurskyddsnormer och godkändes av regeringen i Baden-Württemberg, Regierungspräsidium Karlsruhe, Tyskland (Aktenzeichen 35-9185.81/G-272/12 'Adulte Neurogenese').
1. Generera ett sticksår i telencefalon
- Anestesi
- För att framställa en förrådslösning av tricaine (3-amino-bensoesyra-etylester, som också kallas etyl 3-aminobensoat) använda 400 mg tricaine pulver och lös den i 97,9 ml vatten och 2,1 ml 1 M Tris / HCl-buffert (pH 9). Justera pH-värdet till 7. Se 5 ml alikvoter och förvara dem vid -20 ° C fram till användning.
- Överför ett lämpligt antal 0,5-1 år gammal zebrafisk från sina tankar i plast mus burar. Obs! Skallen av en vuxen zebrafisk på ca 12månaders ålder är fortfarande relativt mjuk och kan perforeras lätt med en nål (se avsnitt 1.2.3 och Figur 1A).
- För att söva vuxna zebrafisk, kombinera 5 ml tricaine (stamlösning) i en plast korsning bur med ~ 100 ml ren akvarium vatten (slutkoncentration av tricaine 0,02% (vikt / volym) tricaine).
- Inkubera fisken i bedövningsmedel tills de inte rör sig längre (45-60 sek).
- Telencefalon Injury
- Placera individ sövda zebrafisk i en skåra i ett block av tricaine indränkta skum.
- Under ett dissektionsmikroskop med ljus från den övre håll försiktigt fisken med en hand och orientera den på ett sätt som tillåter åtkomst till huvudet från toppen.
- Med den andra handen pressa en 30 G spruta (insulinspruta med integrerad nål) vertikalt genom skallen i mediala området av en telencephalic halvklotet (figurerna 1A-1B). De halvklot av telencefalon aåter synlig genom skallen. Se till att den införda lesionen är inte djupare än 2 mm (figur 1C). OBS: Vi rekommenderar starkt att införa skadan alltid i samma halvklotet för att underlätta identifieringen av platsen för skadan när dissekera hjärnan ur skallen.
- Efter införandet av telencephalic skada, placera fisken i färsk fisk vatten. Håll dig till 10 fiskar i en 2 L mus bur fylld med fisk vatten för återvinning och anslut musen buren till ett vattenflödessystem. Anm: Överlevnadsgraden är vanligtvis ~ 97% om fisken är friska och inga andra experiment utfördes med fisken innan. Tillsats av antibiotika till fisken vatten är inte nödvändig. Efter återhämtning, fisk beter sig normalt: de simmar, foder, och kompis.
2. Analysera effekten av Telencephalic skada
- Brain Dissection och Fixering
- Åter söva den återvunna fisk vid olika tidpunkter efter lesion (typically, 1, 3, 5 och 14 dagar efter lesion (DPL)) med 0,02% (vikt / volym) tricaine såsom ovan och avliva dem genom att sätta dem i isvatten under 5 min.
- Placera fisken på en tissuepappers indränkt i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och separera huvudet från kroppen genom att skära bakom gälarna med en vass sax.
- Hålla huvudet i 1x PBS under 5 min för att medge blödning. OBS: Detta tömmer blod från vävnaden, vilket kan störa ytterligare steg i protokollet.
- Fixa huvudena över natten vid 4 ° C i 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS eller 4 h vid rumstemperatur (RT).
- Tvätta fasta huvuden två gånger med 1x PBS i en petriskål.
- Dissekera hjärnor försiktigt i 1x PBS under ett dissekera mikroskop 23. Lesionen är vanligtvis synlig under dissektionsmikroskop. Brains utan en synlig skada skall kasseras.
- Överför hjärnor i 2 ml provrör fyllda med 1,5 ml 100% metanol (MeOH) och vänd rören 5x innan inkuberingdem vid -20 ° C under åtminstone 16 timmar. Anmärkning: De hjärnor kan förvaras under flera månader i MeOH vid -20 ° C tills det behövs för immunohistokemi eller in situ hybridisering.
- Tissue Förberedelser för Immunohistokemi
- Rehydrera hjärnorna genom en fallande metanol serie i 2 ml plaströr (i tur och ordning 75% MeOH (1x PBS, 0,1% Tween-20 = PTW),. 50% MeOH, 25% MeOH Inkubera hjärnor (15 hjärnor / 2 ml reaktionsrör ) under 5 minuter i varje lösning.
- Tvätta hjärnorna i PTW under 5 min. Upprepa 4x med färsk tvåhjuliga motorfordon.
- Inbäddning av hjärnorna för sektionering
- För att bädda in, överföra hjärnor från 2 ml reaktionsröret i PTW in i håligheterna i en polyeten gjutning kopp bricka med en överföring pipett (5 mm i diameter).
- Bered 2% agaros (DNA-kvalitet) i 1x PBS i en Erlenmeyerkolv. Värm i mikrovågsugn på 600 W tills agaros upplöses helt. Förbered 50 ml för 10 hjärnor. Låt the agaros svalna i 3 minuter i rumstemperatur före användning. Håll agarosen på en förvärmd värmeblock (60 ° C) medan inbäddning hjärnorna för att förhindra stelning.
- Avlägsna 1x PBS från formen innehåller en hjärna med användning av en Pasteur-pipett (1 mm diameter). Se till att inte skada hjärnan.
- Häll agaros i formen och fyll den helt. Använd sedan en dissektion nål att virvla hjärnan i agaros för att tvätta bort det tvåhjuliga motorfordon vilket gör det lättare att bädda in i hjärnan.
- Orient hjärnan i formen ventrala sidan nedåt, ryggsidan uppåt och placera den rakt.
- Låt agarosen svalna. För snabbare kylning, placera formen på is. Upprepa steg.
- Upprepa 2.3.3-2.3.6 för alla hjärnor.
- Trimning av agaros Block
- Med hjälp av en dissektion nål, pop ut agarosen blocket.
- Med ett skarpt rakblad, skär agarosen vid den bakre änden av hjärnan. Se till att detta plan är parallellt med telencephalon.
- Skär agarosen vid den främre änden av hjärnan. Sedan vända blocket så att det står på den bakre planet.
- Avlägsna överskott av agaros med ett snitt som är parallellt med hjärnans dorsala och ventrala sidor. Vänd sedan hjärnan tillbaka så att den ligger på dess ventrala sidan.
- Skär blocket till en stympad triangel där telencephalon är belägen vid den mindre plan (fig. 2).
- Förbereda Vibratome för sektione
- Förbered vibratome enligt tillverkarens anvisningar. Använd ett nytt rakblad och byt ut den efter 10 hjärnor.
- Fyll buffert bad med 1 x PBS till en nivå som precis når botten av bladet.
- Placera en liten prick av superlim ovanpå preparatskivan av vibratome.
- Placera försiktigt den planet som ligger posteriort om hjärnan på superlim. Limmet härdar så snart som det är i kontakt med 1 x PBS ivibratome buffertbad.
- Sätt i preparatskivan med provet i buffertbrickan med hjälp av roboten i mikrotomen.
- Använd roboten att rotera preparatskivan till den önskade positionen. Rikta in blocket i bufferten bad på ett sätt som lokaliserar telencephalon strax under ytan, med den dorsala delen av hjärnan som vetter mot bladet. Dra sedan åt SCRW med en 3 mm insexnyckel och ta bort roboten. Obs: klämskruv eller en av klämanordningar får inte placeras över gapet i preparatskivan; i dessa positioner fastspänning preparatskivan är inte möjlig.
- Sektione hjärnan
- Bered en 24-brunnsplatta för att samla sektionerna. Per hjärnan som skall sektioneras, fylla en bra med en ml av blockeringsbuffert (0,1% (vol / vol) 10% Tween-20, 0,2% (vikt / volym) bovint serumalbumin (BSA), 1% (volym / volym) dimetylsulfoxid (DMSO) i PBS).
- Börja sektionering vid 50 | im tjocklek, 1 mm / sekund hastighet och 70 Hz frekvensmed användning av en vibrerande mikrotom.
- Använd en syntetisk pensel (1 mm) för att plocka upp den tunna skivor av agaros som de kommer ut bladet och samla dem i 24-brunnar.
- Immunohistokemi på vibratome Sektioner
- Blockera icke-specifika bindningsställen för en timme vid rumstemperatur i blockeringsbuffert (0,1% (vol / vol) 10% Tween 20, 0,2% (vikt / volym) BSA, 1% (volym / volym) DMSO i PBS).
- Avlägsna supernatanten och tillsätt 250 | il av antikropp utspädd i blockeringsbuffert över natten vid 4 ° C. Alternativt inkubera den primära antikroppen under 2 h vid RT. Tvätta sedan 3x 10 min i PTW. Obs! PCNA färgning använda en 1:400 utspädning (mus-anti-PCNA För detaljer se tabell av material.). Flera primära antikroppar kan inkuberas samtidigt.
- Inkubera avsnitt i sekundär antikropp under 2 timmar vid RT sedan tvätta 3 x 10 min i PTW. OBS: 1:1000 utspädning i PTW, för detaljer se tabell av material. Flera sekundära antikroppar kan inkuberas samtidigt.
- Vuxna hjärnan RNA in situ hybridisering (alternativt till immunohistokemi)
- Brain Dissection och Fixering (samma procedur som för immunhistokemi):
- Hybridisering av sonden.
- Rehydrera hjärnor i 2 ml reaktionsrören som beskrivits för immunhistokemi.
- Inkubera hjärnorna i proteinas K (ProtK,. 10 | ig / ml slutlig koncentration) i tvåhjuliga motorfordon för 30 min. Efter inkubationstid bort ProtK / PTW och fixa hjärnorna igen i 20 min i BT-Fix (4% PFA, 4% sackaros, 0,12 mM CaCl2, 77 mM Na 2 HPO 4, 23 mM NaH 2 PO 4).
- Tvätta hjärnor 5x under 5 min i tvåhjuliga motorfordon (0,1% (v / v) Tween-20 i PBS).
- Ta PTW och skölj hjärnorna på 500 lHYB-buffert (50% (vol / vol) avjoniserad formamid, 5 x SSC, 500 fig / ml jäst tRNA, 50 | ig / ml heparin, 0,1% Tween-20, 9 mM citronsyra). Vänta tills hjärnor sjunka till botten av röret sedan kasta supernatanten och tillsätt 500 | il av ren HYB-buffert och inkubera vid 65-70 ° C under 3-4 timmar.
- Späd RNA-sond till 1:200 eller 1:400 (beroende på proben) i 400 | il slutlig volym på HYB-buffert. Värm upp den utspädda RNA-sond vid 70 ° C under 5 min.
- Avlägsna supernatanten från hjärnan och lägga till RNA-sond, inkubera vid 65-70 ° C (O / N). Alla tvättbuffertlösningar bör förvärmdes och hölls vid 70 ° C.
- Märkning
- Tvätta hjärnorna vid 65-70 ° C (under alla fyra tvättsteg) med 500 ^ il tvättbuffert 1 (50% formamid, 1 x SSC, 0,05% Tween 20) två gånger under 30 min. Byt bufferten en av buffert 2 (2x SSC, 0,1% Tween 20) och inkubera under 15 min. Avlägsna buffert 2 och tvätta hjärnor i buffert 3 (0,2 x SSC, 0,1% Tween 20) for 30 min, upprepa detta steg två gånger. Byt bufferten 3 av buffert 4 (0,1 x SSC, 0,05% Tween 20 i tvåhjuliga motorfordon), inkubera i 5 min.
- Avlägsna supernatanten och tvätta i 5 minuter i 500 | il av tvåhjuliga motorfordon vid RT.
- Använd hjärnor i 2% agaros (i 1 x PBS) och skär vibratome sektioner (50 till 100 mikrometer), såsom beskrivits för immunhistokemi.
- Tvätta 1x under 5 min i 500 | il blockeringsbuffert (1 x PBS, 0,1% Tween-20, 0,2% (vikt / volym) BSA, 1% (volym / volym) DMSO).
- Avlägsna supernatanten och tillsätt 500 | il blockerande buffert under 2 h vid RT.
- Avlägsna supernatanten och tillsätt 300 | il anti-DIG-AP-kopplad antikropp utspädd 1:4,000 i blockeringsbuffert.
- Inkubera o / n vid 4 ° C.
- NBT / BCIP Färgning
- Tvätta 5x till 15 min med PTW buffert vid RT.
- Skölj 1x i färgning buffert. Tvätta två gånger 5 min i färgningsbuffert (100 mM Tris / HCl pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20).
- Avlägsna supernatanten och fläcken med 500 μl färgningslösning (3,5 ^ il 4-Nitroblue tetrazoliumklorid (NBT) och 5-brom-4-klor-3-indolyl-fosfat (BCIP) per 1 ml färgningsbuffert).
- Sluta färgning genom att skölja 3x till 5x med tvåhjuliga motorfordon.
- Brain Dissection och Fixering (samma procedur som för immunhistokemi):
- Montering av avsnitten
- Montera avsnitten på slides med användning av en vattenlöslig, icke-fluorescerande monteringsmedium (se tabellen Material).
- Håll glasen i kylskåpet vid 4 ° C. Anmärkning: Färg är stabil under flera veckor eller månader.
- Analysera de glider under en förening eller konfokalmikroskop.
Representative Results
Med hjälp av arbetsflödet beskrivs i denna artikel, har en skada infördes i den högra hjärnhalvan av en vuxen zebrafisk telencefalon (figurerna 1A-1B). En korrekt såra leder till en skada kanal som sträcker sig från rygg till ventrala igenom hela palliet av telencefalon (figur 3C). Lesionen bör begränsas till en av de halvklot och borde inte korsa den mediala ventrikeln. Lesionen kanal är synlig med ljusa fält mikroskopi (Figur 3C) och kommer att bli helad efter ca 35 dagar 15.
Man har tidigare visat att efter sårskada en uppreglering av prolifererande cellkärnantigen (PCNA, fig. 3A) och S100β (figur 3B) vid 3-7 DPL är detekterbar genom immunhistokemi 15. Den färgning av PCNA och S100β är överlappande, vilket tyder på spridning av radiella gliaceller.
Furthermore, för att visualisera oligodendrocyt prekursorceller (OPCs), var ett sticksår analys utförd på Tg (OLIG2: EGFP) fisk 24. Efter färgning med en anti-GFP-antikropp, är ansamling av OPCs i nära anslutning till lesionen kanalen detekterbar (Figur 3D). Denna ansamling är övergående, och OPC kluster inte observerats längre vid 35 DPL 15.
Om skadan inte har införts på rätt sätt, kommer att skada kanalen inte syns, och uppreglering av PCNA och S100β eller ansamling av OPCs inte kommer att upptäckas. PCNA är den känsligaste markören för hjärnskada. För att kontrollera effektiviteten i sticksår och att utesluta att båda hjärnhalvorna är skadade, rekommenderas det starkt att alltid färga sektioner med en anti-PCNA-antikropp. I en korrekt infört lesion bör PCNA vara betydligt uppregleras (upp till 4 gånger 15) i endast ett av halvkloten. Även om i de flesta fall ärtillräckligt att endast använda den kontra unlesioned sidan som en intern kontroll för att övervaka förändringar i genuttryck, är det starkt rekommenderat att jämföra genuttrycket i kontrollhalvklotet med uttrycket i telencephalic halvklot av vildtyp hjärnor. På detta sätt kan de systemiska effekter av lesionen på genuttryck som skulle påverka båda hjärnhalvorna skall detekteras.
Den sticksår analys i kombination med en systematisk expression skärm av transkriptionsregulatorer (TRS) (25 och Schmidt et al., Opublicerad) kan även användas för att identifiera TR gener med en möjlig roll i neurogenes och regenerering (fig 4A-4C).
Detta tillvägagångssätt har identifierat ett antal faktorer som uttrycks i telencefalon och vars uttryck är specifikt uppreglerad som svar på skada (Figur 4A-C).
Figur 2. Schematic representation av en vuxen zebrafisk hjärnan i ett trimmat agaros blocket precis innan vibratome snittning. Anterior är upp. Luktbulben (ob), telencefalon (tel), optisk tectum (ot), lillhjärnan (cb) och förlängda märgen (m). Skala bar: 500 um.
Figur 3. Regenerativ svar på sticksår skada. AD) Vuxen zebrafisk hjärnan vid 5 dagar efter lesion (DPL). AB) Den proliferativa markören PCNA (A) och den radiella gliaceller markör S100β (B) är uppreglerade vid den ventrikulära zonen (pilar) vid hugg sårskada. (C) Den lesion kanal är synlig under ljusa fältbelysningen (pilar). Den ventrikulära zon indikeras av den gröna linjen. (D) Oligodendrocyte precursorceller (OLIG2: EGFP +) ackumuleras vid platsen för lesion (pilar). Skala bar: 200 nm. I alla paneler, är den högra hjärnhalvan den skadade hemisfären. Rygg är upp. Den streckade linjen i A-D indikerar gränsen mellan palliet och subpallium.
Figur 4. Ett exempel på gener som uppregleras som svar att stab skada. Notera den starka upp-regleringen (pilar) av eomesa (A, B) och sox4a (C) mRNA-expression i den högra telencephalic hemisfären (hackat halvklotet), vilket övervakades med in situ hybridisering vid 5 DPL. Den vänstra hjärnhalvan är oskadade och fungerar som kontroll. (B) visar en högre förstoring av den dorsala telencephalic region A. Dorsal är uppe. Scale bar: 200 ^ m för A och C och 55 ^ m för B.streckad linje i A och C anger avståndet mellan palliet och subpallium. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| FÖRKORTNINGAR | |
| AP | Alkaline Phosphatase |
| BCIP | 5-brom-4-klor-3'-indolyphosphate |
| BSA | Bovint serumalbumin |
| CNS | Centrala nervsystemet |
| Dig | Digoxigenin |
| DMSO | Dimetylsulfoxid |
| DPL | Dagar efter lesion |
| eomesa | Eomesodermin homolog en |
| GFAP | Gliafibrillärt surt protein |
| hr | Timme |
| HYBbuffert | Hybridisering buffert |
| ISH | in situ-hybridisering |
| MeOH | Metanol |
| NBT | Nitro-blå tetrazolium |
| OPCs | Oligodendrocyte prekursorceller |
| PBS | Fosfatbuffrad saltlösning |
| PCNA | Prolifererande cellkärnantigen |
| PFA | Paraformaldehyd |
| ProtK | Proteinas K |
| PSA-NCAM | Polysialylated neuronal cellvidhäftningsmolekyl |
| PTW | PBS, 0,1% Tween-20 |
| RNA | Ribonukleinsyra |
| RT | Rumstemperatur |
| SGZ | Subgranular zon |
| sox4a | SRY-box som innehåller genen 4a |
| SSC | Saline-natriumcitrat |
| SVZ | Subventrikulära zonen |
| TR | Transkriptionsregulatorer |
Discussion
Vi beskriver här en metod för att inducera en telencephalic skada genom att trycka på en nål genom skallen av den vuxna zebrafisk, och att analysera cellulär och molekylär reaktion på denna skada genom immunhistokemi och hybridisering in situ. Den största fördelen med denna teknik jämfört med andra existerande tillvägagångssätt är dess enkelhet, snabbhet och kostnadseffektivitet. Därför kan denna teknik, som möjliggör produktion av många skadade hjärnor på en kort tid, enkelt kombineras med en storskalig in situ hybridisering skärmen för att identifiera gener med en roll i regenerering och neurogenes.
Åldern på den vuxna zebrafisk på vilken skade utförs är avgörande. Om fisken är äldre än 1,5 år, är skallen för hårt och det är möjligt att skallen skjuts ned eller slås sönder snarare än rent perforerad. Däremot i yngre fisk (yngre än 4 månader), finns det fortfarande en hel del neurogenes händer, som kanske lead till falskt positiva resultat när det gäller reaktiv neurogenes.
Ett annat kritiskt steg i denna metod är att kontrollera effektiviteten av sticksår och för att utesluta att båda hemisfärerna är skadade. Detta kan övervakas genom färgning av sektionerna med anti-PCNA-antikropp. I en korrekt infört lesion bör PCNA vara betydligt uppregleras i endast en av hjärnhalvorna.
Det är viktigt att ha i åtanke att den inducerade mekanisk skada kommer att ha flera biverkningar såsom icke-specifik cell ablation, ökad celldöd på grund av sekundär degeneration, inflammation och destruktion av blod-hjärnbarriären, och skada på ventrikulära zonen och som en möjlig konsekvens flöde av cerebrospinalvätskan i hjärnparenkymet. Men de skadade fisken verkar lida mycket lite från skadan. Inom 2 min de är fria simning igen och normalt ätbeteende återställs inom ungefär 4 timmar. Efter 3 veckor i ig skada är morfologiskt inte syns längre. I våra händer, från flera hundra operationer vi inte förlora en enda fisk, trots att vi hade en 100% skada takt som bedöms av histologi vid 5 dagar efter lesion.
Under de senaste åren andra tekniker såsom transgena metoder har utvecklats i zebrafisk för att producera vävnad eller celltyp specifika ablation 2. Även om dessa tekniker är mycket elegant och minimalt invasiv de är baserade på generering av komplicerade DNA-konstruktioner och inrättandet av flera stabila zebrafisk transgena linjer som kan vara mycket tröttande och tidskrävande. Därför enkla mekaniska metoder såsom den analys som beskrivs i detta protokoll förblir ett viktigt verktyg för att studera vuxna hjärnan neurogenes och förnyelse.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine | Sigma | 335.2 | |
| 10x DPBS (-/-) | Life technologies | 14200-083 | |
| 30 G syringe (Omnican 40) | B.Braun Melsungen | 916162 | |
| Polyethylene molding cup tray | Polysciences, Inc | 17177C-3 | |
| PeqGOLD Universal Agarose | Peqlab | 35-1020 | |
| Bovine serum albumin | Biochrom | W 2835919108 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences, Inc | 18606-20 | |
| Tween 20 | Carl Roth | 9127.1 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
| Dissection needle | Carl Roth | KX93.1 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.2 | |
| Loctite 414 | Schöffler und Wörner | 06 1362 0020 | |
| Glass slides | Labonord | 5305103 | |
| Cover slips 24 x 60 mm | Labonord | 5305060 | |
| Petri dishes, 94 mm | Greiner bio-one | 632180 | |
| Falcon tubes, 15 ml | Greiner bio-one | 188261 | |
| 24-well plate | Greiner bio-one | 662160 | |
| Anti-S100 (1:500) | Dako | Z031101-2 | |
| Anti-PCNA (1:400) | Dako | M087901 | |
| Anti-GFP (1:1,000) | Aves Labs | GFP-1020 | |
| anti-Dig AP-coupled antibody | Roche Diagnostics | 11093274910 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Roche Diagnostics | 1383221 | |
| 4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Roche Diagnostics | 1383213 | |
| Proteinase K | Roche Diagnostics | 1092766 | |
| Polyethylene molding cup tray | Polysciences | 17177C-3 | |
| Vibratome VT1000S | Leica | ||
| Confocal microscope Sp5 DM6000 | Leica | ||
| Dissecting microscope Nikon SMZ 645 | Nikon | ||
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon catalog | 353226 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Danio rerio Tg(olig2:EGFP) | Shin et al.24 | ||
| Danio rerio WT strains (e.g., AB2O2) |
References
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72, 429-461 (2012).
- Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis. Nat Rev Neurosci. 12, 88-104 (2011).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32, 638-647 (2009).
- Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Dev. 8, 3 (2013).
- Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the central nervous system of teleost fish. Eur J Neurosci. 34, 917-929 (2011).
- Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. Teleost fish as a model system to study successful regeneration of the central nervous system. Curr Top Microbiol Immunol. 367, 193-233 (2013).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295, 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Dev Biol. 295, 263-277 (2006).
- Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain. J Comp Neurol. 488, 290-319 (2005).
- Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29, 745-757 (2007).
- Hinsch, K., Zupanc, G. K. Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis. Neuroscience. 146, 679-696 (2007).
- Lindsey, B. W., Darabie, A., Tropepe, V. The cellular composition of neurogenic periventricular zones in the adult zebrafish forebrain. J Comp Neurol. 520, 2275-2316 (2012).
- Marz, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58, 870-888 (2010).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240, 2221-2231 (2011).
- Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223, 131-147 (2013).
- Ayari, B., El Hachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon. J Neurotrauma. 27, 959-972 (2010).
- Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis. Glia. 60, 343-357 (2011).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Dis Model Mech. 5, 200-209 (2012).
- Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Dev Cell. 23, 1230-1237 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138, 4831-4841 (2011).
- Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338, 1353-1356 (2012).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Shin, J., Park, H. C., Topczewska, J. M., Mawdsley, D. J., Appel, B. Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics. Methods Cell Sci. 25, 7-14 (2003).
- Armant, O., et al. Genome-wide, whole mount in situ analysis of transcriptional regulators in zebrafish embryos. Dev Biol. 380, 351-362 (2013).
