Abstract
Volwassen zebravissen hebben een geweldig vermogen om na een blessure hun centrale zenuwstelsel te regenereren. Om de cellulaire respons en de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de zebravis volwassen centrale zenuwstelsel (CNS) regeneratie en reparatie onderzoeken, ontwikkelden we een zebravis model van volwassen telencephalic letsel.
In deze benadering, we handmatig een blessure te genereren door op een insuline naald in de zebravis volwassen telencephalon. Op verschillende bericht letsel dagen, zijn vis opgeofferd, hun hersenen ontleed uit en gekleurd door immunohistochemie en / of in situ hybridisatie (ISH) met geschikte markers om celproliferatie, gliogenesis en neurogenese observeren. De contralaterale hemisfeer unlesioned dient als een interne controle. Deze methode gecombineerd met bijvoorbeeld RNA deep sequencing kan helpen om het scherm voor nieuwe genen met een rol in de zebravis volwassen telencephalon neurogenese, regeneratie en reparatie.
Introduction
Zoogdieren hebben een zeer beperkte capaciteit om nieuwe neuronen te genereren op volwassen leeftijd en volwassen neurogenese in de hersenen is grotendeels beperkt tot twee telencephalic gebieden gelegen aan de subventriculaire zone (SVZ) van de laterale ventrikels en de subgranulaire zone (SGZ) van de dentate gyrus in de hippocampus 1. Zoogdieren evenmin letsel aan de hersenen veroorzaakt door neurodegeneratieve ziekten, beroerte of letsel herstellen efficiënt. Verloren neuronen niet vervangen, maar proliferatie van verschillende soorten gliacellen, zoals astrocyten, microglia en oligodendrocyten, waargenomen. Als gevolg van deze proliferatieve proces genaamd reactieve gliosis, wordt de verwonde hersenweefsel afgedicht door de vorming van een gliale litteken, die neuronale en axonale regeneratie 2-4 remt.
In tegenstelling tot zoogdieren, beenvissen, zoals de zebravis vormen nieuwe neuronen overvloedig in volwassen stadia en hebben een hoge regeneratieve en proliferative potentieel letsels van het centrale zenuwstelsel 2,5-7 herstellen. De zebravis volwassen hersenen bevat 16 verschillende neurale stamcellen niches die een groot aantal nieuwe neuronen te genereren gedurende de gehele levensduur 8-11. Neuronen geboren in deze specifieke proliferatie zones van de volwassen hersenen zebravis migreren naar hun doelgebieden, waar ze zullen rijpen en te integreren in de bestaande neuronale netwerken 8,10,12-15.
Onder de voorlopercellen zones die in volwassen zebravissen, de telencephalic ventriculaire zone is een van de meest bestudeerde neuronale stamcellen niches. Cellen in deze voorlopercellen niche kan worden ingedeeld in drie typen betrekking tot hun morfologie, divisie snelheid en expressie van verschillende gliale en neuronale merkers. Type I en type II cellen radiale gliale als cellen die lange processen. Ze drukken stamcellen markers inclusief GFAP, nestine en S100β. Type I cellen niet vermenigvuldigen, terwijl type II cellen proliferate langzaam, zoals blijkt uit hun expressie van proliferatie merkers zoals prolifererende cel nucleair antigen (PCNA) en de toevoeging van desoxythymidine analogen. Het type III cellen zijn snel delende cellen die zich inzetten voor neurale voorlopercellen en expressbedrijf neurale marker-genen, zoals PSA-NCAM 5,16.
Hoewel de regeneratieve capaciteit van beenvissen goed gedocumenteerd zijn, hebben echter slechts enkele publicaties beschreven en in detail onderzocht de cellulaire en moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij neuronale regeneratie in de volwassen grote hersenen in antwoord op letsels 15,17-22. Om de mechanismen die betrokken zijn bij de zebravis volwassen centrale zenuwstelsel regeneratie en reparatie ontcijferen en de gelijkenissen en de verschillen tussen constitutieve en regeneratieve neurogenese begrijpen, ontwikkelden we een zebravis model van volwassen telencephalic letsel. Hier beschrijven we visueel hoe een blessure te genereren in een van de telencephalic hemispheres met behulp van een injectienaald, terwijl de contralaterale zijde unlesioned als een interne controle. We zullen zien hoe veranderingen na verwonding in celproliferatie en genexpressie door immunohistochemie en in situ hybridisatie assays volgen.
Protocol
Zebravis werden gehandhaafd in de vis-faciliteit van het Instituut voor Toxicologie en Genetica (ITG) in Karlsruhe Institute of Technology (KIT). Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de Duitse dierenbescherming normen en werden goedgekeurd door de regering van Baden-Württemberg, Regierungspräsidium Karlsruhe, Duitsland (Aktenzeichen 35-9185.81/G-272/12 'Adulte neurogenese').
1. Het genereren van een steekwond in de Telencephalon
- Anesthesie
- Om een voorraad oplossing van tricaïne (3-amino benzoëzuurethylester, ook wel ethyl-3-aminobenzoaat) bereiden gebruiken 400 mg tricaïne poeder en los het op in 97,9 ml water en 2,1 ml 1 M Tris / HCl buffer (pH 9). Stel de pH op 7. Voeg 5 ml porties en bewaar ze bij -20 ° C tot gebruik.
- Transfer een passend aantal 0,5-1 jaar oude zebravis uit hun tanks in plastic muis kooien. Opmerking: De schedel van een volwassen zebravissen op ongeveer 12maanden nog relatief zacht en kan gemakkelijk worden geperforeerd met een naald (zie paragraaf 1.2.3 en Figuur 1A).
- De volwassen zebravissen verdoven combineren 5 ml tricaïne (voorraadoplossing) in een plastic kruising kooi met -100 ml zuiver aquarium water (eindconcentratie van tricaïne 0.02% (w / v) tricaïne).
- Incubeer de vis in de anesthesie, totdat ze niet meer bewegen (45-60 sec).
- Telencephalon Injury
- Plaats individuele verdoofd zebravis in een spleet in een blok van-tricaïne doorweekt schuim.
- Volgens een dissectie microscoop met licht van boven zachtjes Houd de vis met een hand en oriënteren op een manier die toegang tot de kop van boven mogelijk maakt.
- Met de andere hand duw een 30 G injectiespuit (insulinespuit met geïntegreerde naald) verticaal door de schedel in het middengebied van een telencephalic halfrond (figuren 1A-1B). De hemisferen van de grote hersenen eenopnieuw zichtbaar door de schedel. Zorg ervoor dat de ingevoerde laesie is niet dieper dan 2 mm (figuur 1C). Opmerking: Het wordt sterk aanbevolen om de laesie altijd introduceren in hetzelfde halfrond naar de identificatie van de plaats van de laesie gemak bij het ontleden van de hersenen uit de schedel.
- Na de introductie van de telencephalic letsel, plaats de vis in verse vis water. Blijf op de 10 vissen in een 2 L muis kooi gevuld met vis water voor het herstel en de muis kooi om een waterstroom systeem. Opmerking: Het overlevingspercentage is meestal ~ 97% als vissen gezond zijn en geen andere experimenten werden uitgevoerd met de vis voor. Toevoeging van antibiotica om de vis water is niet noodzakelijk. Na herstel, vis normaal gedragen: ze zwemmen, voer, en stuurman.
2. Analyseren van het effect van telencephalic Injury
- Brain Dissection en Fixation
- Re-verdoven de teruggewonnen vis op verschillende tijdstippen na laesie (typically, 1, 3, 5 en 14 dagen na laesie (DPL)) met 0,02% (w / v) tricaïne zoals hierboven en euthanize ze door ze gedurende 5 minuten in ijswater.
- Leg de vis op een papieren tissue gedrenkt in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en scheiden het hoofd van het lichaam door te snijden achter de kieuwen met een scherpe schaar.
- Houd de hoofden in 1x PBS gedurende 5 minuten om bloeden te staan. Opmerking: Dit riool bloed uit het weefsel, dat verdere stappen in het protocol kan verstoren.
- Bevestig de koppen overnacht bij 4 ° C in 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS of 4 uur bij kamertemperatuur (RT).
- Was vast hoofden tweemaal met 1x PBS in een petrischaal.
- Ontleden hersenen zorgvuldig in 1x PBS onder een dissectiemicroscoop 23. De laesie is doorgaans zichtbaar onder de stereomicroscoop. Brains zonder zichtbare laesie moet worden weggegooid.
- Transfer hersenen in 2 ml reageerbuisjes gevuld met 1,5 ml 100% Methanol (MeOH) en draai de buizen 5x vóór incubatieze bij -20 ° C gedurende ten minste 16 uur. Opmerking: De hersenen kan enkele maanden in MeOH bewaard bij -20 ° C totdat het nodig is voor immunohistochemie en in situ hybridisatie.
- Tissue Voorbereiding voor Immunohistochemistry
- Hydrateren de hersenen door een afnemende reeks methanol in 2 ml kunststofbuizen (sequentieel 75% MeOH (1 x PBS, 0,1% Tween-20 = PTW). 50% MeOH, 25% MeOH Incubeer de hersenen (15 hersenen / 2 ml reactiebuizen ) gedurende 5 min in elke oplossing.
- Was de hersenen in PTW gedurende 5 minuten. 4x herhalen met verse PTW.
- Inbedding van de Brains voor Snijden
- Voor het inbedden, overdracht van de hersenen van de 2 ml reageerbuis in PTW in de holten van een polyethyleen molding plateau met een transfer pipet (5 mm diameter).
- Bereid 2% agarose (DNA) af in 1x PBS in een erlenmeyer. Verwarmen in de magnetron bij 600 W totdat de agarose volledig is opgelost. Bereid 50 ml voor 10 hersenen. Laat the agarose afkoelen gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur voor gebruik. Houd de agarose op een voorverwarmde verwarmingsblok (60 ° C) terwijl inbedding de hersenen om stolling te voorkomen.
- Verwijder de 1x PBS uit de matrijs die een brein door een Pasteur pipet (1 mm). Wees voorzichtig de hersenen niet te beschadigen.
- Giet agarose in de vorm en vul het geheel. Gebruik een dissectie naald naar de hersenen krul in de agarose weg te wassen PTW het gemakkelijker om de hersenen te bedden.
- Oriënteer de hersenen in de mal ventrale kant naar beneden, dorsale kant naar boven en plaats het recht.
- Laat de agarose afkoelen. Voor een snellere koeling, zet de schimmel op ijs. Herhaal stappen.
- Herhaal 2.3.3-2.3.6 voor alle hersenen.
- Trimmen van de Agarose Block
- Met behulp van een dissectie naald, pop uit de agarose blok.
- Met een scherp scheermes, stuurde de agarose aan het achterste uiteinde van de hersenen. Zorg ervoor dat deze parallel loopt aan het telencephalon.
- Snijd de agarose aan het voorste uiteinde van de hersenen. Dan flip het blok, zodat het staat op de achterste vliegtuig.
- Verwijder de overmaat aan agarose door te snijden in parallel aan dorsale de hersenen en ventrale zijden. Dan draait u de hersenen terug, zodat het ligt op zijn buikzijde.
- Snijd het blok een afgeknotte driehoek waarin de grote hersenen zich op het kleinere oppervlak (figuur 2).
- Voorbereiden van de Vibratome voor Snijden
- Bereid de vibratome volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik een nieuw scheermesje en te vervangen na 10 hersenen.
- Vul het bad buffer met 1 x PBS tot een niveau dat enkel de onderzijde van het blad bereikt.
- Plaats een kleine stip secondelijm op de bovenkant van het monster schijf van de vibratome.
- Plaats het vlak dat zich posterieur van de hersenen van de superlijm voorzichtig. De lijm zal zo snel verharden als het in contact met de 1x PBSde vibratome buffer bad.
- Plaats de objectplaatje het model in de buffer lade met behulp van de manipulator van de microtoom.
- Gebruik de manipulator met het model schijf in de gewenste positie te draaien. Richt het blok in de buffer bad op een manier die de grote hersenen lokaliseert net onder het oppervlak, het dorsale gedeelte van de hersenen tegenover het blad. Draai vervolgens de SCRW met een 3 mm inbussleutel en verwijder de manipulator. Opmerking: De klemschroef of een van de spanmiddelen mag zich niet over het gat in de objectplaatje; in deze posities vastzetten van de objectplaatje niet mogelijk.
- Snijden de Brain
- Bereid een 24-wells plaat bij de afdelingen te verzamelen. Per hersenen worden doorgesneden, vul een putje met 1 ml blokkerende buffer (0,1% (v / v) 10% Tween-20, 0,2% (w / v) runderserumalbumine (BSA), 1% (v / v) dimethylsulfoxide (DMSO) in PBS).
- Begin snijden op 50 urn dikte 1 mm / sec snelheid, en 70 Hzmet behulp van een trillende microtoom.
- Gebruik een synthetische borstel (1 mm) te halen de dunne plakjes agarose als ze komen uit het blad en ze te verzamelen in de 24-well plaat.
- Immunohistochemie op vibratoomcoupes
- Blokkeer niet-specifieke bindingsplaatsen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in blockingbuffer (0,1% (v / v) 10% Tween 20, 0,2% (w / v) BSA, 1% (v / v) DMSO in PBS).
- Verwijder het supernatant en voeg 250 ul antilichaam verdund in blokkerende buffer gedurende de nacht bij 4 ° C. Alternatief incubeer het primaire antilichaam gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Was daarna 3x gedurende 10 min in PTW. Opmerking: Voor PCNA kleuring gebruiken een 1:400 verdunning (muis anti-PCNA Voor details zie tabel van materialen.). Meervoudige primaire antilichamen kunnen worden geïncubeerd tegelijk.
- Incubeer de secties in het secundair antilichaam gedurende 2 uur bij kamertemperatuur daarna wassen 3x gedurende 10 min in PTW. Opmerking: 1:1000 verdunning in PTW, voor detail zie tabel van materialen. Meerdere secundaire antilichamen kunnen worden geïncubeerd tegelijk.
- Adult Brain RNA in situ hybridisatie (alternatief voor immunohistochemie)
- Brain Dissection en fixatie (dezelfde procedure als voor immunohistochemie):
- Hybridisatie van de probe.
- Hydrateren hersenen in 2 ml reageerbuizen zoals beschreven voor immunohistochemie.
- Incubeer hersenen in proteïnase K (ProtK;. 10 ug / ml eindconcentratie) in PTW gedurende 30 minuten. Na incubatie tijd verwijderen ProtK / PTW en zet de hersenen opnieuw gedurende 20 min in BT-Fix (4% PFA, 4% sucrose, 0,12 mM CaCl2, 77 mM Na 2 HPO 4, 23 mM NaH 2 PO 4).
- Was 5x hersenen gedurende 5 min in PTW (0,1% (v / v) Tween-20 in PBS).
- Verwijder PTW en spoel de hersenen in 500 piHYB buffer (50% (v / v) gedeïoniseerd formamide, 5x SSC, 500 ug / ml gist tRNA, 50 ug / ml heparine, 0,1% Tween-20, 9 mM citroenzuur). Wacht tot hersenen naar de bodem van de buis dan de bovenstaande vloeistof en voeg 500 ul van schone HYB buffer en incuberen bij 65-70 ° C gedurende 3-4 uur.
- Verdun de RNA probe 1:200 of 1:400 (afhankelijk van de probe) in 400 pl eindvolume van HYB buffer. Verwarm de verdunde RNA probe bij 70 ° C gedurende 5 minuten.
- Verwijder supernatant uit de hersenen en voeg de RNA probe, incuberen bij 65-70 ° C (O / N). Alle wasbuffer oplossingen moeten worden voorverwarmd en bewaard bij 70 ° C.
- Labeling
- Was de hersenen bij 65-70 ° C (gedurende alle 4 wasstappen) met 500 ui wasbuffer 1 (50% formamide, 1 x SSC, 0,05% Tween 20) tweemaal gedurende 30 minuten. Vervang buffer 1 met buffer 2 (2x SSC, 0,1% Tween 20) en incubeer gedurende 15 minuten. Verwijder buffer 2 en was hersenen in buffer 3 (0,2 x SSC, 0,1% Tween 20) for 30 min, tweemaal Herhaal deze stap 2. Vervang buffer 3 door buffer 4 (0,1 x SSC, 0,05% Tween 20 in PTW), incubeer gedurende 5 minuten.
- Verwijder de supernatant en was gedurende 5 min in 500 ui PTW bij KT.
- Embed hersenen in 2% agarose (in 1x PBS) en knip vibratoomcoupes (50-100 urn) zoals beschreven voor immunohistochemie.
- Wash 1x gedurende 5 min in 500 pl blokkerende buffer (1x PBS, 0,1% Tween-20, 0,2% (w / v) BSA, 1% (v / v) DMSO).
- Verwijder de supernatant en voeg 500 ul blokkeerbuffer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
- Verwijder supernatant en voeg 300 ul anti-Dig AP-gekoppeld antilichaam verdund 1:4000 in het blokkeren van buffer.
- Incubeer o / n bij 4 ° C.
- NBT / BCIP kleuring
- Was 5x 15 min met PTW buffer bij kamertemperatuur.
- Spoel 1x in vlekken buffer. Was tweemaal 5 min in vlekken buffer (100 mM Tris / HCl pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20).
- Verwijder supernatant en vlek met 500 μl kleurstofoplossing (3,5 gl 4-nitroblauwtetrazolium chloride (NBT) en 5-broom-4-chloor-3-indolyl-fosfaat (BCIP) per 1 ml kleurbuffer).
- Stop kleuring door spoelen 3x tot 5x met PTW.
- Brain Dissection en fixatie (dezelfde procedure als voor immunohistochemie):
- Montage van de afdelingen
- Monteer de secties op dia's met behulp van een in water oplosbare, niet-fluorescerende montage medium (zie de tabel Materials).
- Houd dia in de koelkast bij 4 ° C. Opmerking: De kleuring is stabiel gedurende enkele weken of zelfs maanden.
- Analyseer de dia onder een verbinding of confocale microscoop.
Representative Results
De in dit artikel beschreven werkstroom, werd een laesie ingebracht in de rechterhelft van een volwassen zebravissen telencephalon (Figuren 1A-1B). Een correcte verwonding leidt tot een laesie kanaal dat zich uitstrekt van dorsale ventrale de hele pallium van de grote hersenen (Figuur 3C). Het letsel moet worden beperkt tot een van de hemisferen en mag niet de mediale ventrikel te steken. Het letsel kanaal is zichtbaar met helder veld microscopie (figuur 3C) en zal genezen na ongeveer 35 dagen 15.
Eerder werd aangetoond dat na verwonding een up-regulatie van prolifererende celkernantigeen (PCNA, figuur 3A) en S100β (figuur 3B) en 3 tot 7 RAP detecteerbaar door immunohistochemie 15. De kleuring van PCNA en S100β overlappingen aangeeft proliferatie van radiale gliacellen.
Furthermore, teneinde oligodendrocyt-voorlopercellen (OPC) visualiseren, werd een steekwond assay uitgevoerd op de Tg (Olig2: EGFP) vis 24. Na kleuring met anti-GFP-antilichaam, accumulatie van OPC dicht bij de laesie kanaal detecteerbaar (Figuur 3D). Deze opeenstapeling is van voorbijgaande aard, en OPC clusters worden niet meer waargenomen bij 35 dpl 15.
Als het letsel niet goed is ingevoerd, zal de laesie kanaal niet zichtbaar zijn, en up-regulatie van PCNA en S100β of accumulatie van OPC's zal niet detecteerbaar zijn. PCNA is de meest gevoelige marker voor hersenletsel. Om de efficiëntie van de steekwond te verifiëren en uit te sluiten dat beide hersenhelften zijn gewond, is het sterk aanbevolen om altijd vlekken op de secties met een anti-PCNA antilichaam. In een correct ingevoerd laesie moet PCNA aanzienlijk up-gereguleerd (tot 4 maal 15) in slechts een van de hemisferen. Hoewel in de meeste gevallen isvoldoende om alleen de contralaterale unlesioned kant als een interne controle met betrekking tot veranderingen in genexpressie controleren, is het sterk aanbevolen om de genexpressie te vergelijken in de controle halfrond met de expressie in telencephalic hemisferen van wild type hersenen. Zo kan systemische effecten van de laesie op genexpressie dat zou beïnvloeden beide hemisferen gedetecteerd.
De steekwond assay in combinatie met een systematische expressie scherm van transcriptie regulatoren (TR) (25 en Schmidt et al.., Ongepubliceerd) kunnen ook worden gebruikt TR genen met mogelijke rol bij neurogenese en regeneratie (Figuren 4A-4C).
Deze benadering heeft een aantal factoren die zijn uitgedrukt in de grote hersenen en waarvan de expressie specifiek up-gereguleerd in reactie op verwonding (figuur 4A-C) geïdentificeerd.
Figuur 2. SChematic voorstelling van een volwassen zebravis hersenen in een bijgesneden agarose blok net voor vibratome snijden. Anterior is up. Reukbol (ob), grote hersenen (tel), optische tectum (ot), cerebellum (cb) en merg (m). Schaal bar: 500 micrometer.
Figuur 3. Regeneratieve reacties op wond letsel steken. AD) Volwassen zebravis hersenen op 5 dagen na de laesie (DPL). AB) De proliferatieve marker PCNA (A) en de radiale gliale marker S100β (B) zijn up-gereguleerd in de ventriculaire zone (pijlen) op stab verwonden. (C) Het letsel kanaal is zichtbaar onder helderveld (pijlen). De ventriculaire zone wordt aangegeven met de groene lijn. (D) Oligodendrocyte voorlopercellen (Olig2: EGFP +) ophopen op de plaats van laesie (pijlen). Schaal bar: 200 micrometer. In alle panelen, de rechter hersenhelft is de laesie halfrond. Dorsale is up. De stippellijn in A tot en met D geeft de grens tussen het pallium en de subpallium.
Figuur 4. Voorbeeld genen up-gereguleerd in reactie op verwonding steken. Merk de sterke opwaartse regulatie (pijlen) van eomesa (A, B) en sox4a (C) mRNA expressie in de rechter hemisfeer telencephalic (gestoken halfrond) wordt bewaakt door in situ hybridisatie bij 5 DPL. De linker hersenhelft is ongedeerd en dient als controle. (B) Toont een sterkere vergroting van de dorsale telencephalic regio A. Dorsale is up. Schaalbalk: 200 urn voor A en C en 55 urn voor B.stippellijn in A en C geeft de scheiding tussen het pallium en de subpallium. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| AFKORTINGEN | |
| AP | Alkalische fosfatase |
| BVIE | 5-broom-4-chloor-3'-indolyphosphate |
| BSA | Runderserumalbumine |
| CNS | Centrale zenuwstelsel |
| Graven | Digoxygenine |
| DMSO | Dimethylsulfoxide |
| dpl | Dagen na de laesie |
| eomesa | Eomesodermin homoloog een |
| GFAP | Gliale fibrillaire zure eiwit |
| hr | Uur |
| HYBbuffer | Hybridisatiebuffer |
| ISH | in situ hybridisatie |
| MeOH | Methanol |
| NBT | Nitro-blauw tetrazolium |
| OPC's | Oligodendrocyt voorlopercellen |
| PBS | Fosfaat gebufferde zoutoplossing |
| PCNA | Uitdijende celkernantigeen |
| PFA | Paraformaldehyde |
| ProtK | Proteinase K |
| PSA-NCAM | Polysialylated neuronale celadhesie molecule |
| PTW | PBS, 0,1% Tween-20 |
| RNA | Ribonucleïnezuur |
| RT | Kamertemperatuur |
| SGZ | Subgranulaire zone |
| sox4a | SRY-doos met gen 4a |
| SSC | Zoutoplossing-natriumcitraat |
| SVZ | Subventriculaire zone |
| TR | Transcriptie regulatoren |
Discussion
We beschrijven hier een methode om een telencephalic beschadiging te induceren door op een naald door de schedel van de volwassen zebravissen, en de cellulaire en moleculaire reactie hierop schade door immunohistochemie en in situ hybridisatie analyse. Het belangrijkste voordeel van deze techniek andere bestaande benaderingen zijn eenvoud, snelheid en kostenefficiëntie. Daarom kan deze techniek, die in korte tijd productie van veel gewonden hersenen kan gemakkelijk gecombineerd worden met een grootschalige in situ hybridisatie scherm om genen met een rol in regeneratie en neurogenese.
De leeftijd van de volwassen zebravissen waarop de schade wordt uitgevoerd is van cruciaal belang. Als de vissen ouder dan 1,5 jaar, de schedel te hard en het is mogelijk dat de schedel wordt omlaag geduwd of gebroken in plaats van netjes geperforeerd. In tegenstelling, bij jongere vissen (jonger dan 4 maanden), is er nog veel van neurogenese gaande, die misschien wel lead vals-positieve resultaten met betrekking tot reactief neurogenese.
Een andere belangrijke stap in deze benadering is om de efficiëntie van de steekwond verifiëren en sluiten dat beide hemisferen gewond. Dit kan worden gevolgd door het kleuren van de secties met de anti-PCNA-antilichaam. In een correct ingevoerd laesie moet PCNA aanzienlijk up-gereguleerd in slechts een van de hemisferen.
Het is belangrijk om in gedachten te houden dat de geïnduceerde mechanische verwonding verschillende bijwerkingen zoals niet-specifieke cel ablatie, verhoogde celdood als gevolg van secundaire degeneratie, ontsteking en vernietiging van de bloed-hersenbarrière, en beschadiging van ventriculaire zone en zo zal hebben een mogelijk gevolg stroming van het hersenvocht in de hersenen parenchym. Echter, de gewonde vis lijken weinig last van de blessure. Binnen 2 minuten zijn ze vrij zwemmen weer en normale eetgedrag wordt hersteld binnen ongeveer 4 uur. Na 3 weken injury is morfologisch niet meer zichtbaar. In onze handen, van enkele honderden operaties hebben we niet een enkele vis te verliezen, ondanks het feit dat we een 100% percentage letsels zoals vastgesteld door histologie op 5 dagen na de laesie.
In de laatste jaren andere technieken zoals transgene benaderingen zijn ontwikkeld in zebravis weefsel of celtype specifieke ablatie 2 produceren. Hoewel deze technieken zijn zeer elegant en minimaal invasieve ze zijn gebaseerd op het genereren van complexe DNA-constructen en de instelling van verschillende stabiele transgene zebravis lijnen die zeer vervelend en tijdrovend zijn. Daarom eenvoudige mechanische benaderingen zoals de in dit protocol beschreven assay blijven een belangrijk instrument om volwassen hersenen neurogenese en regeneratie te bestuderen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine | Sigma | 335.2 | |
| 10x DPBS (-/-) | Life technologies | 14200-083 | |
| 30 G syringe (Omnican 40) | B.Braun Melsungen | 916162 | |
| Polyethylene molding cup tray | Polysciences, Inc | 17177C-3 | |
| PeqGOLD Universal Agarose | Peqlab | 35-1020 | |
| Bovine serum albumin | Biochrom | W 2835919108 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences, Inc | 18606-20 | |
| Tween 20 | Carl Roth | 9127.1 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
| Dissection needle | Carl Roth | KX93.1 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.2 | |
| Loctite 414 | Schöffler und Wörner | 06 1362 0020 | |
| Glass slides | Labonord | 5305103 | |
| Cover slips 24 x 60 mm | Labonord | 5305060 | |
| Petri dishes, 94 mm | Greiner bio-one | 632180 | |
| Falcon tubes, 15 ml | Greiner bio-one | 188261 | |
| 24-well plate | Greiner bio-one | 662160 | |
| Anti-S100 (1:500) | Dako | Z031101-2 | |
| Anti-PCNA (1:400) | Dako | M087901 | |
| Anti-GFP (1:1,000) | Aves Labs | GFP-1020 | |
| anti-Dig AP-coupled antibody | Roche Diagnostics | 11093274910 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Roche Diagnostics | 1383221 | |
| 4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Roche Diagnostics | 1383213 | |
| Proteinase K | Roche Diagnostics | 1092766 | |
| Polyethylene molding cup tray | Polysciences | 17177C-3 | |
| Vibratome VT1000S | Leica | ||
| Confocal microscope Sp5 DM6000 | Leica | ||
| Dissecting microscope Nikon SMZ 645 | Nikon | ||
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon catalog | 353226 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Danio rerio Tg(olig2:EGFP) | Shin et al.24 | ||
| Danio rerio WT strains (e.g., AB2O2) |
References
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72, 429-461 (2012).
- Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis. Nat Rev Neurosci. 12, 88-104 (2011).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32, 638-647 (2009).
- Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Dev. 8, 3 (2013).
- Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the central nervous system of teleost fish. Eur J Neurosci. 34, 917-929 (2011).
- Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. Teleost fish as a model system to study successful regeneration of the central nervous system. Curr Top Microbiol Immunol. 367, 193-233 (2013).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295, 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Dev Biol. 295, 263-277 (2006).
- Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain. J Comp Neurol. 488, 290-319 (2005).
- Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29, 745-757 (2007).
- Hinsch, K., Zupanc, G. K. Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis. Neuroscience. 146, 679-696 (2007).
- Lindsey, B. W., Darabie, A., Tropepe, V. The cellular composition of neurogenic periventricular zones in the adult zebrafish forebrain. J Comp Neurol. 520, 2275-2316 (2012).
- Marz, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58, 870-888 (2010).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240, 2221-2231 (2011).
- Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223, 131-147 (2013).
- Ayari, B., El Hachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon. J Neurotrauma. 27, 959-972 (2010).
- Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis. Glia. 60, 343-357 (2011).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Dis Model Mech. 5, 200-209 (2012).
- Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Dev Cell. 23, 1230-1237 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138, 4831-4841 (2011).
- Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338, 1353-1356 (2012).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Shin, J., Park, H. C., Topczewska, J. M., Mawdsley, D. J., Appel, B. Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics. Methods Cell Sci. 25, 7-14 (2003).
- Armant, O., et al. Genome-wide, whole mount in situ analysis of transcriptional regulators in zebrafish embryos. Dev Biol. 380, 351-362 (2013).
