Abstract
Zebrafish adulto ha una straordinaria capacità di rigenerare il loro sistema nervoso centrale dopo l'infortunio. Per studiare la risposta cellulare ed i meccanismi molecolari coinvolti nella zebrafish adulto sistema nervoso centrale (SNC) rigenerazione e la riparazione, abbiamo sviluppato un modello di zebrafish di lesioni telencefalica adulto.
In questo approccio, generiamo manualmente un infortunio spingendo una siringa di insulina nel telencefalo adulto zebrafish. A diversi giorni di pregiudizio dopo, i pesci sono sacrificati, i loro cervelli sono sezionati fuori e colorate con immunoistochimica e / o ibridazione in situ (ISH) con marcatori appropriati per osservare la proliferazione cellulare, gliogenesi, e neurogenesi. L'emisfero controlaterale unlesioned serve come controllo interno. Questo metodo combinato, ad esempio con l'RNA sequenziamento profondo può aiutare a schermata di nuovi geni con un ruolo nella neurogenesi telencefalo zebrafish adulto, la rigenerazione e la riparazione.
Introduction
I mammiferi hanno una capacità molto limitata di generare nuovi neuroni durante la vita adulta, e la neurogenesi adulta nel cervello è in gran parte limitato a due regioni telencefalici situate nella zona subventricolare (SVZ) dei ventricoli laterali, e la zona subgranulare (SGZ) del dentate circonvoluzione nell'ippocampo 1. Mammiferi inoltre, non può riparare i danni del cervello causata da malattie neurodegenerative, ictus o lesioni, in modo efficiente. Neuroni persi non vengono sostituiti e invece proliferazione di differenti tipi di cellule gliali, compresi astrociti, microglia, oligodendrociti e, si osserva. Come conseguenza di questo processo proliferativo chiamato gliosi reattiva, il tessuto cerebrale danneggiato è isolata ermeticamente dalla formazione di una cicatrice gliale, che inibisce neuronale e rigenerazione assonale 2-4.
A differenza di mammiferi, pesci teleostei come il pesce zebra formare nuovi neuroni abbondantemente in stadi adulti e hanno una rigenerante elevato e proliferative potenziale per riparare lesioni del sistema nervoso centrale 2,5-7. Il cervello adulto zebrafish contiene 16 distinte nicchie staminali neurali che generano un gran numero di nuovi neuroni durante tutta la vita 8-11. I neuroni nati in queste specifiche zone di proliferazione del cervello zebrafish adulto migrano le loro aree di destinazione, dove potranno maturare e integrare nelle reti neuronali esistenti 8,10,12-15.
Tra le zone progenitrici identificati in zebrafish adulti, la zona ventricolare telencefalico è una delle nicchie staminali neuronali più studiati. Le cellule in questo progenitore di nicchia possono essere classificate in tre tipi distinti quanto riguarda la loro morfologia, il tasso di divisione e di espressione di gliali diversa o marcatori neuronali. Tipo I e le cellule di tipo II sono gliali radiali come le cellule che hanno processi lunghi. Essi esprimono cellule staminali marcatori tra cui GFAP, nestin, e S100β. Tipo I le cellule non proliferano, mentre le cellule di tipo II proliferate lentamente, come dimostra la loro espressione di marcatori di proliferazione, quali proliferazione cellulare antigene nucleare (PCNA) e l'incorporazione di analoghi desoxythymidine. Le celle di tipo III sono in rapida divisione delle cellule che si sono impegnati a diventare progenitori neurali ed esprimere geni marcatori neurali, come il PSA-NCAM 5,16.
Anche se le capacità rigenerative dei pesci teleostei sono ben documentati, solo poche pubblicazioni hanno descritto e studiato in dettaglio i meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella rigenerazione neuronale nel telencefalo adulti in risposta al danno 15,17-22. Per decifrare i meccanismi implicati nella zebrafish adulto centro di rigenerazione del sistema nervoso e la riparazione e per comprendere le somiglianze e le differenze tra neurogenesi costitutivo e rigenerativa, abbiamo sviluppato un modello di zebrafish di lesioni telencefalica adulto. Qui, descriveremo visivamente come generare un infortunio in uno dei hemisph telencefalicaeres con l'aiuto di un ago di siringa, mantenendo il lato unlesioned controlaterale come controllo interno. Mostreremo anche come monitorare i cambiamenti su lesioni nella proliferazione cellulare e l'espressione genica mediante immunoistochimica e in saggi di ibridazione in situ.
Protocol
Zebrafish sono stati mantenuti nella struttura pesci dell'Istituto di Tossicologia e Genetica (ITG) a Karlsruhe Institute of Technology (KIT). Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le norme di protezione degli animali tedeschi e sono stati approvati dal governo del Baden-Württemberg, Regierungspräsidium Karlsruhe, Germania (Aktenzeichen 35-9185.81/G-272/12 'Adulte Neurogenese').
1. Generazione di una coltellata nel Telencefalo
- Anestesia
- Per preparare una soluzione stock di tricaine (3-ammino benzoico etile, chiamato anche etil 3-amminobenzoato) utilizzano 400 mg di polvere tricaine e dissolverlo in 97,9 ml di acqua e 2,1 ml di 1 M Tris / HCl (pH 9). Regolare il pH a 7. Fai aliquote di 5 ml e conservare a -20 ° C fino al loro utilizzo.
- Trasferire un numero adeguato di 0,5-1 anni zebrafish dai loro carri armati in gabbie di plastica del mouse. Nota: Il cranio di un zebrafish adulto a circa 12mesi di età è ancora relativamente morbido e verranno perforati facilmente con un ago (vedere la sezione 1.2.3 e Figura 1A).
- Per anestetizzare il zebrafish adulto, unire 5 tricaine ml (soluzione) in una gabbia incrocio di plastica con ~ 100 ml di acqua acquario pulita (concentrazione finale del tricaine 0,02% (w / v) tricaine).
- Incubare il pesce in anestetici fino a che non si muovono più (45-60 sec).
- Telencefalo Injury
- Inserire individuo anestetizzato zebrafish in una fessura in un blocco di schiuma tricaine-impregnati.
- Sotto un microscopio da dissezione con luce dall'alto tenere delicatamente il pesce con una mano e orientarlo in modo tale da consentire l'accesso alla testa dall'alto.
- Con l'altra mano spingere una siringa da 30 G (siringa da insulina con ago integrato) verticalmente attraverso il cranio nella regione mediale di un emisfero telencefalico (Figure 1A-1B). Gli emisferi del telencefalo unnuovamente visibile attraverso il cranio. Assicurarsi che la lesione introdotta non è più profondo di 2 millimetri (Figura 1C). Nota: Si raccomanda di introdurre la lesione sempre nello stesso emisfero per facilitare l'identificazione del sito di lesione quando sezionare il cervello dal cranio.
- Dopo aver introdotto l'infortunio telencefalica, mettere il pesce in acqua il pesce fresco. Continuate a 10 pesci in una gabbia 2 L del mouse riempito d'acqua i pesci per il recupero e collegare la gabbia del mouse ad un sistema di flusso d'acqua. Nota: Il tasso di sopravvivenza è di solito ~ 97% se i pesci sono sani e non altri esperimenti sono stati effettuati con il pesce prima. L'aggiunta di antibiotici all'acqua pesce non è necessario. Dopo il recupero, i pesci si comportano normalmente: nuotano, mangimi, e il compagno.
2. Analizzando l'effetto di telencefaliche Injury
- Cervello Dissection e Fixation
- Re-anestetizzare il pesce recuperato a tempi diversi dopo la lesione (typically, 1, 3, 5, e 14 giorni dopo lesione (dpl)) con 0,02% (w / v) tricaine come sopra e li eutanasia mettendoli in acqua e ghiaccio per 5 min.
- Mettere il pesce su un fazzoletto di carta imbevuta di tampone fosfato salino (PBS) e separare la testa dal corpo tagliando dietro le branchie con una forbice affilata.
- Conservare le teste in 1x PBS per 5 minuti per consentire sanguinamento. Nota: Questo drena il sangue dal tessuto, che può turbare ulteriori passi nel protocollo.
- Fissare le teste notte a 4 ° C in 4% paraformaldeide (PFA) in PBS o 4 ore a temperatura ambiente (RT).
- Lavare teste fisse due volte con PBS 1x in una capsula di Petri.
- Sezionare il cervello con cura in 1x PBS sotto un microscopio da dissezione 23. La lesione è di solito visibile sotto il microscopio da dissezione. Brains senza una lesione visibile devono essere eliminati.
- Trasferire il cervello in 2 provette ml riempiti con 1,5 ml di metanolo 100% (MeOH) e invertire i tubi 5x prima incubazioneli a -20 ° C per almeno 16 ore. Nota: I cervelli possono essere conservati per alcuni mesi in MeOH a -20 ° C fino al momento della immunoistochimica o ibridazione in situ.
- Preparazione di tessuto per immunoistochimica
- Reidratare il cervello attraverso una serie di metanolo discendente in 2 ml di tubi di plastica (sequenza 75% MeOH (1x PBS, 0.1% Tween-20 = PTW). MeOH 50%, 25% MeOH Incubare il cervello (15 cervella / 2 ml tubi di reazione ) per 5 min in ciascuna soluzione.
- Lavare i cervelli in PTW per 5 min. Ripetere 4x con fresco PTW.
- Incorporare le Brains per il sezionamento
- Per incorporare, trasferire i cervelli dal tubo da 2 ml in PTW nelle cavità di un vassoio tazza stampaggio di polietilene con una pipetta di trasferimento (5 mm di diametro).
- Preparare 2% agarosio (grado DNA) in 1x PBS in una beuta. Riscaldare nel forno a microonde a 600 W fino a quando l'agarosio è disciolto completamente. Preparare 50 ml per 10 cervelli. Lasciate the raffreddare rivolto verso il basso per 3 minuti a temperatura ambiente prima dell'uso. Mantenere l'agarosio su una piastra riscaldante pre-riscaldato (60 ° C) mentre incorporamento cervello per evitare la solidificazione.
- Rimuovere la PBS 1x dallo stampo contenente un cervello utilizzando una pipetta Pasteur (diametro 1 mm). Fare attenzione a non danneggiare il cervello.
- Versare agarosio nello stampo e riempirlo del tutto. Quindi utilizzare un ago dissezione a turbinare il cervello in agarosio per lavare via il PTW rendendo più facile incorporare il cervello.
- Orientare il cervello nella parte ventrale dello stampo verso il basso, lato dorsale e posizionarlo dritto.
- Lasciare che il agarosio raffreddare. Per il raffreddamento più veloce, posizionare lo stampo sul ghiaccio. Ripetere i passaggi.
- Ripetere 2.3.3-2.3.6 per tutti i cervelli.
- Taglio del agarosio Block
- Utilizzando un ago dissezione, estrarre il blocco di agarosio.
- Con una lama di rasoio affilata, tagliare l'agarosio alla fine posteriore del cervello. Assicurarsi che questo piano è parallelo al TElencephalon.
- Tagliare il agarosio al termine anteriore del cervello. Poi capovolgere il blocco in modo che si erge sul piano posteriore.
- Rimuovere l'eccesso di agarosio tagliando in parallelo alla dorsale del cervello e lati ventrali. Poi capovolgere il cervello indietro in modo che giaccia sul suo lato ventrale.
- Tagliare il blocco di un triangolo troncato in cui telencefalo si trova in corrispondenza del piano inferiore (Figura 2).
- Preparazione del Vibratome per il sezionamento
- Preparare il vibratome secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare una nuova lama di rasoio e sostituirlo dopo 10 cervelli.
- Riempire la vasca tampone con PBS 1x a un livello che raggiunge solo la parte inferiore della lama.
- Collocare un piccolo punto di colla sulla parte superiore del disco esemplare di vibratome.
- Posizionare accuratamente il piano che si trova posteriormente al cervello sulla colla. La colla si indurisce appena è a contatto con il PBS 1x inla vasca del buffer vibratome.
- Inserire il disco campione con il campione nel cassetto buffer utilizzando il manipolatore del microtomo.
- Utilizzare il manipolatore per ruotare il disco di preparato nella posizione desiderata. Orientare il blocco nel bagno buffer in modo che individua telencefalo appena sotto la superficie, con la parte dorsale del cervello di fronte alla lama. Quindi serrare il SCRW con una chiave a brugola 3 mm e rimuovere il manipolatore. Nota: La vite di serraggio o uno dei dispositivi di fissaggio non devono trovarsi sul buco nel disco di preparato; in queste posizioni di bloccaggio del disco di preparato non è possibile.
- Sezionato il cervello
- Preparare una piastra da 24 pozzetti per raccogliere le sezioni. Per cervello da sezionare, riempire un pozzetto di 1 ml di tampone di bloccaggio (0.1% (v / v) 10% Tween-20, 0,2% (w / v) di siero albumina bovina (BSA), 1% (v / v) dimetilsolfossido (DMSO) in PBS).
- Inizia sezionamento a 50 micron di spessore, velocità di 1 mm / sec e 70 Hzutilizzando un microtomo vibrante.
- Utilizzare un pennello sintetico (1 mm) per raccogliere le fettine di agarosio come vengono fuori la lama e li raccolgono nella piastra da 24 pozzetti.
- Immunoistochimica su vibratome Sezioni
- Bloccare non specifici siti di legame per 1 ora a RT in tampone di bloccaggio (0.1% (v / v) 10% Tween 20, 0,2% (w / v) BSA, 1% (v / v) di DMSO in PBS).
- Rimuovere il surnatante e aggiungere 250 microlitri di anticorpo diluito in tampone di bloccaggio notte a 4 ° C. In alternativa, incubare l'anticorpo primario per 2 ore a temperatura ambiente. Quindi lavare 3x per 10 min a PTW. Nota: Per la colorazione PCNA utilizzare una diluizione 1:400 (topo anti-PCNA Per i dettagli si veda tabella dei materiali.). Anticorpi primari multipli possono essere incubate allo stesso tempo.
- Incubare le sezioni anticorpo secondario per 2 ore a temperatura ambiente poi lavare 3x per 10 min a PTW. Nota: 1:1000 diluizione in PTW, per i dettagli vedere la tabella dei materiali. Anticorpi secondari multipli possono essere incubate allo stesso tempo.
- Adulto RNA Cervello in situ ibridazione (in alternativa a immunoistochimica)
- Cervello Dissection e Fixation (stessa procedura per immunoistochimica):
- Ibridazione di sonda.
- Reidratare il cervello in 2 provette ml come descritto per immunoistochimica.
- Incubare cervelli in proteinasi K (ProtK;. 10 ug / ml conc finale) in PTW per 30 min. Dopo il periodo di incubazione rimuovere ProtK / PTW e fissare di nuovo il cervello per 20 minuti in BT-Fix (4% PFA, 4% di saccarosio, 0,12 mM CaCl 2, 77 mM Na 2 HPO 4, 23 mM NaH 2 PO 4).
- Lavare cervelli 5x per 5 min in PTW (0,1% (v / v) Tween-20 in PBS).
- Rimuovere PTW e sciacquare il cervello in 500 microlitriTampone HYB (50% (v / v) formammide deionizzata, 5x SSC, 500 ug / ml tRNA di lievito, 50 ug / ml di eparina, 0.1% Tween-20, 9 mM citricacid). Attendere fino cervelli depositano sul fondo della provetta poi scartare il surnatante e aggiungere 500 ml di tampone HYB pulito e incubare a 65-70 ° C per 3-4 ore.
- Diluire la sonda di RNA a 1:200 o 1:400 (in base alla sonda) in volume finale di 400 microlitri di tampone HYB. Riscaldare la sonda RNA diluito a 70 ° C per 5 min.
- Rimuovere il surnatante dal cervello e aggiungere la sonda RNA, incubare a 65-70 ° C (O / N). Tutte le soluzioni tampone di lavaggio devono essere preriscaldata e mantenuti a 70 ° C.
- Etichettatura
- Lavare il cervello a 65-70 ° C (durante tutte le 4 fasi di lavaggio) con 500 ml di tampone di lavaggio 1 (50% formammide, 1x SSC, 0,05% Tween 20) due volte per 30 min. Sostituire tampone 1 di tampone 2 (2x SSC, 0,1% Tween 20), e incubare per 15 min. Rimuovere il tampone 2 e lavare il cervello in tampone 3 (0.2x SSC, 0,1% Tween 20) for 30 min, ripetere questa operazione due volte. Sostituire il tampone 3 da buffer di 4 (SSC 0.1x, 0.05% Tween 20 in PTW), incubare per 5 min.
- Rimuovere il surnatante e lavare per 5 minuti in 500 ml di PTW a RT.
- Cervelli incorporare nel 2% agarosio (in 1x PBS) e tagliare vibratome sezioni (50-100 micron), come descritto per immunoistochimica.
- Lavare 1x per 5 min in 500 microlitri di tampone bloccante (1x PBS, 0.1% Tween-20, 0,2% (w / v) BSA, 1% (v / v) di DMSO).
- Rimuovere il surnatante e aggiungere 500 microlitri di tampone bloccante per 2 ore a temperatura ambiente.
- Rimuovere il surnatante e aggiungere 300 microlitri anti-Dig anticorpo AP-coupled diluito 1:4,000 in tampone di bloccaggio.
- Incubare o / n a 4 ° C.
- NBT / BCIP colorazione
- Lavare 5x per 15 min con tampone PTW a RT.
- Sciacquare 1x in tampone colorazione. Lavare due volte 5 min in tampone colorazione (100 mM Tris / HCl pH 9,5, 50 mM MgCl 2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20).
- Rimuovere il surnatante e macchia con 500 μl soluzione colorante (3,5 ml di 4-Nitroblue cloruro tetrazolio (NBT) e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) per 1 ml di tampone colorazione).
- Smettere di colorazione risciacquando 3x a 5x con PTW.
- Cervello Dissection e Fixation (stessa procedura per immunoistochimica):
- Montaggio delle sezioni
- Montare le sezioni su vetrini utilizzando un mezzo di montaggio non fluorescente solubile in acqua (vedere la tabella dei materiali).
- Conservare i vetrini in frigorifero a 4 ° C. Nota: La colorazione è stabile per diverse settimane o addirittura mesi.
- Analizzare le diapositive sotto un composto o microscopio confocale.
Representative Results
Utilizzando il flusso di lavoro descritto in questo articolo, una lesione è stata introdotta nel emisfero destro di un telencefalo zebrafish adulto (Figure 1A-1B). Una corretta ferimento conduce ad un canale lesione che si estende da dorsale a ventrale attraverso tutta pallio del telencefalo (Figura 3C). La lesione dovrebbe essere limitato a uno degli emisferi e non deve attraversare il ventricolo mediale. Il canale lesione è visibile con il microscopio in campo chiaro (Figura 3C) e verrà guarito dopo circa 35 giorni a 15.
È stato precedentemente dimostrato che dopo aver ferito un up-regolazione di proliferazione delle cellule antigene nucleare (PCNA, figura 3A) e S100β (Figura 3B) a 3-7 DPL è rilevabile mediante immunoistochimica 15. La colorazione di PCNA e S100β è sovrapposizione, indicando proliferazione delle cellule gliali radiali.
Fnoltre, al fine di visualizzare le cellule precursori degli oligodendrociti (OPC), un saggio pugnalata ferita è stata eseguita sul Tg (Olig2: EGFP) Pesci 24. Su colorazione con un anticorpo anti-GFP, accumulo di OPC in prossimità del canale lesione è rilevabile (Figura 3D). Questo accumulo è transitorio, e cluster OPC non si osservano più a 35 dpl 15.
Se la lesione non è stato introdotto correttamente, il canale lesione non sarà visibile, e up-regulation di PCNA e S100β o accumulo di OPC non sarà rilevabile. PCNA è il marcatore più sensibile per le lesioni cerebrali. Al fine di verificare l'efficienza del coltellata ed escludere che entrambi gli emisferi sono feriti, si raccomanda di macchiare sempre le sezioni con un anticorpo anti-PCNA. In una lesione introdotto correttamente, PCNA dovrebbe essere significativamente up-regolata (fino a 4 volte 15) in uno solo degli emisferi. Sebbene nella maggior parte dei casi èsufficiente utilizzare solo il lato unlesioned controlaterale come controllo interno per monitorare i cambiamenti nell'espressione genica, si consiglia vivamente di confrontare l'espressione genica nell'emisfero controllo con l'espressione in emisferi telencefalici di tipo cervelli selvatici. In questo modo, tutti gli effetti sistemici della lesione sull'espressione genica che interesserebbe entrambi gli emisferi possono essere rilevati.
La pugnalata ferita dosaggio in combinazione con uno schermo sistematica espressione di regolatori della trascrizione (TRS) (25 e Schmidt et al., Inedito) può anche essere utilizzato per identificare i geni TR con un possibile ruolo nella neurogenesi e rigenerazione (Figure 4A-4C).
Questo approccio ha individuato una serie di fattori che sono espressi in telencefalo e la cui espressione è specificamente up-regolata in risposta a lesioni (Figura 4A-C).
Figura 2. SRappresentazione chematic di un cervello zebrafish adulto in un blocco di agarosio tagliata poco prima vibratomo sezionamento. anteriore è alto. Bulbo olfattivo (ob), telencefalo (tel), tetto ottico (ot), cervelletto (cb) e midollo (m). Scala bar: 500 micron.
Figura 3. Risposte rigenerative per pugnalare lesioni ferita. DC) Adulto cervello zebrafish a 5 giorni dopo il lesione (dpl). AB) Il PCNA proliferativa marcatore (A) e il marcatore gliali radiali S100β (B) sono up-regolati nella zona ventricolare (frecce) sul ferimento stab. (C) Il canale lesione è visibile sotto illuminazione in campo chiaro (frecce). La zona ventricolare è indicato dalla linea verde. (D) le cellule Oligodendrocyte precursori (Olig2: EGFP +) si accumulano nel sito della lesione (frecce). Scala bar: 200 micron. In tutti i pannelli, l'emisfero destro è l'emisfero leso. Dorsale è alto. La linea tratteggiata in A a D indica il confine tra il pallio e la subpallium.
Figura 4. Un esempio di geni up-regolati in risposta a pugnalare lesioni. Notare il forte up-regulation (frecce) di eomesa (A, B) e sox4a (C) espressione di mRNA nell'emisfero destro telencefalica (emisfero accoltellato) monitorata mediante ibridazione in situ a 5 dpl. L'emisfero sinistro è illeso e serve come controllo. (B) mostra un ingrandimento maggiore della regione telencefalica dorsale di A. dorsale è alto. Barra della scala: 200 micron per A e C e 55 micron per B. Illinea tratteggiata in A e C indica la separazione tra il pallio e la subpallium. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| ABBREVIAZIONI | |
| AP | Fosfatasi alcalina |
| BCIP | 5-bromo-4-cloro-3'-indolyphosphate |
| BSA | Albumina di siero bovino |
| CNS | Sistema nervoso centrale |
| Dig | Digossigenina |
| DMSO | Dimetilsolfossido |
| dpl | Giorni dopo lesione |
| eomesa | Eomesodermin omologo di un |
| GFAP | Proteina acidica fibrillare gliale |
| hr | Ora |
| HYBbuffer | Tampone di ibridazione |
| ISH | ibridazione in situ |
| MeOH | Metanolo |
| NBT | Nitro-blu tetrazolio |
| OPC | Cellule precursori degli oligodendrociti |
| PBS | Tampone fosfato |
| PCNA | Antigene nucleare della proliferazione cellulare |
| PFA | Paraformaldeide |
| ProtK | Proteinasi K |
| PSA-NCAM | Polysialylated neuronale molecola di adesione delle cellule |
| PTW | PBS, 0.1% Tween-20 |
| RNA | Acido ribonucleico |
| RT | Temperatura ambiente |
| SGZ | Zona subgranular |
| sox4a | SRY-box contenente gene 4a |
| SSC | Citrato di Saline di sodio |
| SVZ | Zona subventricolare |
| TR | Regolatori della trascrizione |
Discussion
Descriviamo qui un metodo per indurre una lesione telencefalico premendo un ago attraverso il cranio del zebrafish adulti, e per analizzare la reazione cellulare e molecolare di questa lesione mediante immunoistochimica e ibridazione in situ. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri approcci esistenti è la sua semplicità, velocità ed economicità. Pertanto, questa tecnica, che permette la produzione di molti cervelli feriti in breve tempo, può essere facilmente combinato con una grande scala in schermo ibridazione in situ per identificare geni con un ruolo nella rigenerazione e neurogenesi.
L'età del zebrafish adulti su cui viene eseguita la lesione è cruciale. Se i pesci sono più vecchi di 1,5 anni, il cranio è troppo duro ed è possibile che il cranio viene spinto verso il basso o fratturato anziché pulito forata. Al contrario, in esemplari più giovani (di età inferiore ai 4 mesi), c'è ancora un sacco di neurogenesi in corso, che potrebbe lead di risultati falsi positivi per quanto riguarda la neurogenesi reattiva.
Un altro passo fondamentale in questo approccio è quello di verificare l'efficienza del coltellata e di escludere che entrambi gli emisferi sono feriti. Questo può essere monitorato mediante colorazione delle sezioni con l'anticorpo anti-PCNA. In una lesione introdotto correttamente, PCNA dovrebbe essere significativamente up-regolata in uno solo degli emisferi.
È importante tenere presente che il danno meccanico indotto una serie di effetti collaterali come l'ablazione non specifica delle cellule, aumento della morte cellulare a causa della degenerazione secondaria, infiammazione e distruzione della barriera emato-encefalica, e danni di zona ventricolare e come una possibile conseguenza flusso del fluido cerebrospinale nel parenchima cerebrale. Tuttavia, i pesci feriti sembrano soffrire molto poco dall'infortunio. Entro 2 minuti sono di nuovo nuoto libero e normale comportamento alimentare viene ripristinato nel giro di circa 4 ore. Dopo 3 settimane l'injury non è morfologicamente più visibili. Nelle nostre mani, da diverse centinaia di interventi chirurgici non abbiamo perso un solo pesce, nonostante il fatto che abbiamo avuto un tasso di infortuni al 100% come valutato dal istologia a 5 giorni dopo la lesione.
Negli ultimi anni sono state sviluppate altre tecniche come approcci transgenici in zebrafish per produrre tessuti o tipo cellulare ablazione specifico 2. Sebbene queste tecniche sono molto eleganti e minimamente invasiva si basano sulla generazione di complessi costrutti di DNA e la creazione di diverse linee transgeniche zebrafish stabili che possono essere molto noioso e che richiede tempo. Pertanto, semplici approcci meccanici quali il test descritto in questo protocollo restano uno strumento importante studiare adulto neurogenesi cervello e rigenerazione.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine | Sigma | 335.2 | |
| 10x DPBS (-/-) | Life technologies | 14200-083 | |
| 30 G syringe (Omnican 40) | B.Braun Melsungen | 916162 | |
| Polyethylene molding cup tray | Polysciences, Inc | 17177C-3 | |
| PeqGOLD Universal Agarose | Peqlab | 35-1020 | |
| Bovine serum albumin | Biochrom | W 2835919108 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences, Inc | 18606-20 | |
| Tween 20 | Carl Roth | 9127.1 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
| Dissection needle | Carl Roth | KX93.1 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.2 | |
| Loctite 414 | Schöffler und Wörner | 06 1362 0020 | |
| Glass slides | Labonord | 5305103 | |
| Cover slips 24 x 60 mm | Labonord | 5305060 | |
| Petri dishes, 94 mm | Greiner bio-one | 632180 | |
| Falcon tubes, 15 ml | Greiner bio-one | 188261 | |
| 24-well plate | Greiner bio-one | 662160 | |
| Anti-S100 (1:500) | Dako | Z031101-2 | |
| Anti-PCNA (1:400) | Dako | M087901 | |
| Anti-GFP (1:1,000) | Aves Labs | GFP-1020 | |
| anti-Dig AP-coupled antibody | Roche Diagnostics | 11093274910 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Roche Diagnostics | 1383221 | |
| 4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Roche Diagnostics | 1383213 | |
| Proteinase K | Roche Diagnostics | 1092766 | |
| Polyethylene molding cup tray | Polysciences | 17177C-3 | |
| Vibratome VT1000S | Leica | ||
| Confocal microscope Sp5 DM6000 | Leica | ||
| Dissecting microscope Nikon SMZ 645 | Nikon | ||
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon catalog | 353226 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Danio rerio Tg(olig2:EGFP) | Shin et al.24 | ||
| Danio rerio WT strains (e.g., AB2O2) |
References
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