ゼブラフィッシュ成体終脳の刺し傷傷害：脊椎動物の脳神経発生·再生を調査する方法

Abstract

大人のゼブラフィッシュは、損傷後に中枢神経系を再生させる驚くべき能力を持っている。細胞性応答およびゼブラフィッシュ成体の中枢神経系（CNS）の再生および修復に関与する分子メカニズムを調べるために、我々は成体終脳損傷のゼブラフィッシュモデルを開発した。

このアプローチでは、手動でゼブラフィッシュ成体の終脳にインスリン注射針を押すことで傷害を発生させる。異なる損傷後の日に、魚は自分の脳を摘出し、細胞増殖、グリア発生し、神経発生を観察するための適切なマーカーと免疫組織化学および/ ​​またはin situハイブリダイゼーション （ISH） 内で染色され、犠牲にされています。対側非損傷半球は内部コントロールとして機能します。 RNA深いシーケンシングと例えば結合されるこの方法は、ゼブラフィッシュの大人の終脳の神経発生、再生、および修復における役割と新たな遺伝子をスクリーニングするのに役立ちます。

Introduction

哺乳類は成人期中に新しい神経細胞を生成するために、非常に限られた能力を持っており、脳内の成人の神経発生は、主に側脳室の脳室下帯（SVZ）に位置する2終脳の領域に制限され、歯の下帯（SGZ）海馬¹回。哺乳類には、効率的に、神経変性疾患、脳卒中、外傷に起因する脳の損傷を修復することはできません。失われたニューロンを交換せず、星状細胞、小膠細胞、およびオリゴデンドロサイトを含むグリア細胞の異なるタイプの代わりに増殖が観察される。反応性神経膠症と呼ばれるこの増殖プロセスの結果として、損傷した脳組織は、ニューロンおよび軸索再生^を阻害^2-4グリア性瘢痕の形成によって封止される。

哺乳類とは対照的に、ゼブラフィッシュのような硬骨魚は豊富に、成人の段階で新しいニューロンを形成し、高再生やproliferatを持っている中枢神経系^2,5-7の病変を修復するために、IVEの可能性。ゼブラフィッシュ成体の脳は、全生涯^8月11日の間、新しいニューロンを多数発生させる16の異なる神経幹細胞ニッチが含まれています。大人のゼブラフィッシュの脳のこれらの特定の増殖帯に生まれたニューロンは、彼らが成熟すると、既存の神経回路網^8,10,12-15に統合する彼らのターゲット領域に移行します。

大人のゼブラフィッシュで同定された前駆細胞のゾーンの中では、終脳脳室帯は、最も研究され、神経幹細胞のニッチの一つです。この前駆細胞ニッチ内の細胞は、その形態、分裂速度および異なる膠細胞または神経細胞マーカーの発現に関して、三つの異なるタイプに分類することができる。 I型とII型細胞は、長いプロセスを有する細胞のような放射状グリアである。彼らは、GFAP、ネスチン、およびS100βなど、幹細胞マーカーを発現する。 II型細胞はproliferatながら、細胞が増殖しないタイプ電子徐々に、そのような細胞核抗原（PCNA）およびdesoxythymidine類似体の取り込みを増殖するなどの増殖マーカーの発現によって証明される。 III型細胞は速い神経前駆細胞になり、このようなPSA-NCAM ^5,16のような神経マーカー遺伝子を発現することを約束された細胞を分裂している。

硬骨魚の再生能力が十分に文書化されていますが、ほんの数の刊行物は、損傷^15,17-22に応じて大人の終脳における神経再生に関与する細胞および分子メカニズムを説明し、詳細に検討した。ゼブラフィッシュ成体の中枢神経系の再生および修復に関与するメカニズムを解読すると、構成および再生神経発生の類似点と相違点を理解するために、我々は大人の終脳損傷のゼブラフィッシュモデルを開発した。ここでは、終脳hemisphの1に傷害を発生させる視覚的方法を説明します注射針の助けを借りて、ERES、内部対照として反対非損傷側を保持したまま。また、免疫組織化学およびin situハイブリダイゼーションアッセイにおいて細胞増殖および遺伝子発現の損傷の際に変化を監視する方法を示します。

Protocol

ゼブラフィッシュは、カールスルーエ工科大学（KIT）での毒性や遺伝学研究所（ITG）の魚の施設で維持した。動物実験は、ドイツの動物保護基準に準拠して実施し、バーデン=ヴュルテンベルク州、Regierungspräsidiumカールスルーエ、ドイツ（Aktenzeichen 35-9185.81/G-272/12 'Adulte Neurogenese'）の政府によって承認された。

1。終脳に刺し傷の生成

1. 麻酔
   1. （また、3 - アミノ安息香酸エチルと呼ばれる3 - アミノ安息香酸エチルエステル）トリカインのストック溶液を調製するには、トリカイン粉末400mgの使用97.9 mlの水および2.1 mlの1 Mトリス/ HCl緩衝液（pH 9）に溶かし。 5ミリリットルのアリコートを作成します。pHを7に調整し、使用法まで-20℃で保管してください。
   2. プラスチックマウスのケージに、そのタンクから0.5〜1歳のゼブラフィッシュの適切な数を転送します。注：約12の大人のゼブラフィッシュの頭蓋骨月齢（セクション1.2.3および図1Aを参照）まだ比較的柔らかく、針で簡単に穿孔することができる。
   3. 大人のゼブラフィッシュを麻酔するためには、きれいな魚の水槽の水の約100mL（トリカインの最終濃度0.02％（w / v）のトリカイン）とプラスチック製のクロスケージに5ミリリットルのトリカイン（原液）を配合。
   4. 彼らはもはや（45〜60秒）を移動しなくなるまで麻酔薬で魚をインキュベートする。
2. 終脳損傷
   1. 場所の個人がトリカインに浸した発泡体のブロックのスリットにゼブラフィッシュを麻酔し。
   2. トップからの光で解剖顕微鏡下でそっと片手で魚を保持し、上から頭へのアクセスを可能にする方法でそれを向けます。
   3. もう一方の手で1終脳半球（ 図1A-1B）の中間領域に垂直に頭蓋骨を通して30gの注射器（一体型針でインスリン注射器）を押してください。終脳aの半球頭蓋骨を通して見える再。導入された病変が2ミリメートル（ 図1C）よりも深くないことを確認してください。注意：これは非常に頭蓋骨から脳を解剖時に病変の部位の同定を容易にするために、同じ半球に常に病変を導入することをお勧めします。
   4. 終脳の損傷を導入した後、新鮮な魚の水の中に魚を置く。回復のための魚の水で満たされた2Lのマウスケージに10匹の魚についていくと、水の流れシステムにマウスケージを接続します。注：魚が健康であり、他の実験の前に魚を実施しなかった場合の生存率は、約97％で、通常です。魚の水への抗生物質の添加は不要である。回復後、魚が正常に動作：彼らは、飼料、そして相手を泳ぐ。

2。終脳損傷の影響の分析

1. 脳解剖と固定
   1. 病変後の異なる時点で回収魚を再麻酔し（typicallyは、1,3,5、および14日後の病変（DPL））0.02％の上記のような（w / v）のトリカイン、5分間氷水中にそれらを置くことによって、それらを安楽死させる。
   2. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に浸したティッシュペーパー上に魚を置き、鋭利な鋏で切断することによりえら背後体から頭部を分離する。
   3. 出血を可能にするために、5分間1X PBS中に頭を維持する。注意：これは、プロトコルのさらなるステップを乱すことがあり組織から血液が排出されます。
   4. PBSまたは室温（RT）で4時間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）中で4℃で一晩頭を固定する。
   5. ペトリ皿に1×PBSで2回の固定ヘッドを洗ってください。
   6. 解剖顕微鏡下で^23×PBS中で慎重に脳を解剖。病変は解剖顕微鏡下で、通常は表示されている。目に見える傷のない脳を破棄する必要があります。
   7. 1.5ミリリットル、100％メタノール（MeOH）で満たされた2ミリリットルの反応チューブに脳を移し、チューブを反転5Xインキュベートする前に少なくとも16時間、-20℃でそれら。注：免疫組織化学またはin situハイブリダイゼーションに必要とされるまで脳を-20℃でMeOH中で数ヶ月間維持することができる。
2. 免疫組織化学のための組織標本
   1. 2ミリリットルのプラスチックチューブ中下降メタノール系列（順次75％のMeOH（1×PBS、0.1％のTween-20 = PTW）を介して脳を再水和、50％メタノール、25％MeOHを脳（15脳/ 2 mlの反応チューブをインキュベートする）を各溶液中で5分間。
   2. 5分間PTWで脳を洗う。新鮮PTWで4回繰り返します。
3. 切片化のための脳の埋め込み
   1. 埋め込むため、転送ピペット（直径5mm）を有するポリエチレン成形カップトレイの空洞内にPTWでの2ミリリットルの反応管から脳を転送します。
   2. 三角フラスコ中の1×PBS中の2％アガロース（DNAグレード）を調製する。アガロースが完全に溶解するまで、600Wのマイクロ波で加熱する。 10頭脳のために50ミリリットルを用意します。しましょう​​番目Eは、アガロースの使用前に室温で3分間クールダウン。凝固を防止するために、脳を埋め込みつつ、予熱した加熱ブロック（60°C）上でのアガロースを保つ。
   3. パスツールピペット（直径1mm）を使用して、1頭を含む金型から1X PBSを削除します。脳に損傷を与えないように注意してください。
   4. 金型にアガロース注ぎ、それを完全に埋める。そして、それが簡単に脳を埋め込むことPTWを洗い流すために、アガロースで脳を旋回さ解剖針を使用しています。
   5. オリエントダウン金型腹側中脳、背側を上にしてまっすぐに配置します。
   6. アガロースがクールダウンしましょう​​。より高速な冷却のために、氷の上に金型を配置します。の手順を繰り返します。
   7. すべての脳のため2.3.3-2.3.6を繰り返します。
4. アガロースブ​​ロックのトリミング
   1. 解剖針を用いて、アガロースブ​​ロックを飛び出す。
   2. 鋭利なかみそりの刃で、脳の後端にアガロースを切った。この飛行機は、TEに平行であることを確認してくださいlencephalon。
   3. 脳の前端にアガロースを切った。それは後部面上に立っているように、ブロックを反転。
   4. 脳の背側と腹側に平行に切断し、アガロースの過剰を削除します。それは、その腹側にあるように、当時の脳を反転させます。
   5. 終脳が小さい面（ 図2）に配置されて切り捨てられた三角形のブロックをカットします。
5. 区画するビブラトームの準備
   1. メーカーの指示に従ってビブラトームを準備します。新しいカミソリの刃を使用し、10の脳の後に交換してください。
   2. ただ、ブレードの底部に到達レベルに1X PBSでバッファー槽を埋める。
   3. ビブラトームの試料ディスクの上に瞬間接着剤の小さなドットを配置します。
   4. 慎重に瞬間接着剤で脳の後方に位置してプレーンを配置。それは1×PBS中で接触しているように、接着剤は硬化するとすぐにビブラバッファ槽。
   5. ミクロトームのマニピュレータを使用してバッファトレイに検体と試料ディスクを挿入します。
   6. 所望の位置に試料ディスクを回転させるマニピュレータを使用してください。オリエント、ブレード対向脳の背側部分に、表面のすぐ下に終脳の位置を特定の方法でバッファ槽内のブロック。その後、3ミリメートル六角レンチSCRWを締めマニピュレータを削除します。注意：クランプネジやクランプ装置の一つが試料ディスクの隙間の上に位置してはいけません。これらの位置で試料ディスクをクランプすることはできません。
6. 脳切片
   1. のセクションを収集するために24ウェルプレートを準備します。切片化されるべき脳当たり、緩衝液（0.1％（v / v）の10％のTween-20、0.2％（w / v）ウシ血清アルブミン（BSA）、1％（容量/容量）をブロックする1mlの1つのウェルを充填PBS中のジメチルスルホキシド（DMSO））。
   2. 50μmの厚さを1mm /秒の速度、および70 Hzの周波数でセクショニング開始振動ミクロトームを用いて。
   3. 彼らは刃を外れ、24ウェルプレートにそれらを収集アガロースの薄いスライスをピックアップして、合成ブラシ（1ミリメートル）を使用します。
7. ビブラトーム切片上の免疫組織化学
   1. ブロッキング緩衝液中、室温で（PBS中0.1％（v / v）の10％トゥイーン20、0.2％（w / v）のBSA、1％（v / v）のDMSO）を1時間、非特異的結合部位をブロックする。
   2. 上清を除去し、4℃で一晩ブロッキング緩衝液で希釈した抗体を250μlを追加あるいは、RTで2時間一次抗体をインキュベートする。その後、PTWで10分間3回洗浄します。注意：PCNA染色のために1:400希釈使用（マウス抗PCNAの詳細については資料の表を参照してください）​​。複数の一次抗体を同時にインキュベートすることができる。
   3. PTWで10分間3回洗浄し、室温で2時間、二次抗体のセクションをインキュベートします。注意：PTWでの1:1,000希釈、細部のための材料の表を参照してください。複数の二次抗体を同時にインキュベートすることができる。
8. インサイチュハイブリダイゼーション（あるいは免疫組織化学）は、 成人の脳のRNA
   1. 脳解剖と固定（免疫組織化学と同じ手順）：
      1. プローブのハイブリダイゼーション。
      2. 免疫組織化学のために説明されているとおりmlの反応チューブ中脳を再水和する。
      3. 30分間PTWで、プロテイナーゼK（10μg/ mlの最終濃度ProtK）内の脳をインキュベートする。インキュベーション時間の後ProtK / PTWを除去し、BT-フィックスで20分間、再び脳を固定し（4％PFA、4％スクロース、0.12のCaCl _2、77のNa ₂ HPO _4、23 mMののNaH ₂ PO _4）。
      4. 脳が（PBS中の0.1％（v / v）のTween-20）でPTW中で5分間5倍洗浄する。
      5. PTWを削除し、500μlの脳をすすぐHYB緩衝液（50％（v / v）の脱イオン化ホルムアミド、5×SSC、500μg/ mlの酵母tRNA、50μg/ mlのヘパリン、0.1％Tween-20を、9mMのはcitricacid）。脳は、上清を捨て、きれいなHYB緩衝液500μlを加え、3〜4時間、65〜70℃でインキュベートし、チューブの底に沈むまで待ってください。
      6. hyb緩衝液400μlの最終容量（プローブにより異なる）1:200または1:400にRNAプローブを希釈する。 5分間70°Cで希釈したRNAプローブを加熱する。
      7. 脳から上清を除去し、RNAプローブを追加し、65〜70℃（O / N）でインキュベートする。すべての洗浄緩衝溶液は70℃に予め温めて保管されるべきである
   2. ラベリング
      1. 30分間、二回洗浄緩衝液1を500μl（50％ホルムアミド、1×SSC、0.05％のTween 20）で（全4回の洗浄工程の間）、65〜70℃で脳を洗う。バッファ2（2×SSC、0.1％のTween 20）でバッファ1を交換して、15分間インキュベートする。バッファー2を削除し、バッファ3に脳を洗う（0.2×SSC、0.1％のTween 20）FO30分R、2回、手順2を繰り返します。バッファ4（0.1×SSC、PTWでの0.05％のTween 20）でバッファ3を交換し、5分間インキュベートする。
      2. 上清を除去し、室温でPTW500μlの中で5分間洗浄します。
      3. （1X PBS中）2％アガロースで脳を埋め込み、免疫組織化学のために説明したようにビブラトーム切片（50〜100μm）をカット。
      4. 緩衝液（1×PBS、0.1％のTween-20、0.2％（w / v）のBSA、1％（v / v）のDMSO）をブロックする500μl中で5分間1×洗浄。
      5. 上清を除去し、室温で2時間ブロッキングバッファー500μLを加える。
      6. 上清を除去し、抗DIG AP結合抗体をブロッキングバッファーで1:4,000に希釈した300μlを加える。
      7. 4℃でO / Nインキュベート
   3. NBT / BCIP染色
      1. RTでPTW緩衝液で15分間洗浄5倍。
      2. 染色緩衝液中で1Xを洗浄します。染色緩衝液中で5分間二回（100mMのトリス/ HCl pH9.5の、50のMgCl _2、100mMのNaCl、0.1％のTween-20）で洗浄する。
      3. 500μで上澄み汚れを取り除くlの染色溶液（1mlあたり3.5 4 - ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（NBT）μlの5 - ブロモ-4 - クロロ-3 - インドリル - リン酸（BCIP）染色緩衝液）。
      4. PTWで5倍3回洗浄することによって染色を停止する。
9. セクションの取付け
   1. （材料の表を参照）、水溶性、非蛍光封入剤を使用してスライド上のセクションをマウントします。
   2. 4℃の冷蔵庫の中にスライドを保つ注意：染色は数週間あるいは数ヶ月のために安定している。
   3. 化合物または共焦点顕微鏡下でスライドを分析します。

Representative Results

この資料に記載されたワークフローを使用して、病変は大人のゼブラフィッシュの終脳（ 図1A-1B）の右半球に導入した。正しい創傷は終脳（ 図3C）の全外套を通して背側から腹側に拡張病変運河につながる。病変は半球の1に制限されるべきであり、中間心室と交差させない。病変運河は明視野顕微鏡（ 図3C）と表示され、約35日後に¹⁵癒されます。

3〜7 DPL時およびS100β（ 図^3B）15免疫組織化学によって検出可能であり、それは、以前は細胞核抗原（PCNA 図3A）の増殖性のアップレギュレーションを創傷後ことが示された。 PCNAおよびS100βの染色は、放射状グリア細胞の増殖を示す、重複である。

F魚^{24：urthermore、}オリゴデンドロサイト前駆細胞（OPCの）を可視化するために、刺し傷アッセイのTg（EGFP OLIG2）で行った。抗GFP抗体で染色すると、病変管に近接したOPCの蓄積は、（ 図3D）検出可能である。この蓄積は一時的であり、かつOPCクラスタは35 DPL ¹⁵においてもはや観察されない。

病変が適切に導入されていなかった場合、病変運河は表示されませんし、アップレギュレーションPCNAおよびS100βやOPCの蓄積の検出可能ではありません。 PCNAは、脳損傷のための最も感度の高いマーカーである。刺し傷の効率を検証し、両半球が負傷していることを除外するためには、強く、常に抗PCNA抗体を用いてのセクションを染色することをお勧めします。正しく導入された病変では、PCNAは1半球の中で有意にアップレギュレート（4倍¹⁵まで）である必要があります。ほとんどの場合、それはあるが唯一の遺伝子発現の変化を監視するための内部コントロールとして、対非損傷側を使用するには十分で、それは非常に野生型の脳の終脳半球内の式と対照半球における遺伝子発現を比較することをお勧めします。このように、両半球に影響を与える遺伝子発現に対する病変のいずれ全身作用を検出することができる。

系統的発現する転写調節因子（TRS）の画面と組み合わせてアッセイ創傷^（25及びSchmidt ら 、未発表）スタブはまた、神経発生および再生（ 図4A〜図4C）における可能な役割を持つTR遺伝子を同定するために使用することができる。

このアプローチは、終脳に発現し、その発現が傷害に応答した（ 図4A-C）で特異的にアップレギュレートされている多数の因子を同定した。

図1。大人のゼブラフィッシュの終脳の刺し創傷の模式図。 A）インスリン注射針は、終脳損傷を生成するために、成体ゼブラフィッシュの頭蓋骨を通って押し出される。白いラインが2終脳半球の間の境界を表し、緑十字は、大人のゼブラフィッシュの脳の刺し傷。B）背ビューの位置を示し、破線。主要な脳領域が示されている。緑十字は誘 ​​発される損傷の位置を示している。C）終脳損傷を誘導する働きをする針の先端は、2mmの測定。嗅球（OB）、終脳（TEL）と視蓋（OT）。

図2。Sトリミングされたアガロースブロックの成人ゼブラフィッシュの脳のchematic表現が直前にビブラトーム切片。前歯がアップしている。嗅球（OB）、終脳（TEL）、視蓋（OT）、小脳（CB）と髄質（M）。スケールバー：500μmである。

図3。傷の傷害を刺す回生応答。 5日目のAD）アダルトゼブラフィッシュの脳病変（DPL）。AB）の増殖マーカーPCNA（A）と放射状グリアマーカーS100β（B）が刺し創傷時に脳室帯（矢印）でアップレギュレートされ投稿してください。 （C）病変チャネルは、明視野照明（矢印）下で可視である。脳室帯は緑の線で示されている。 （D）オリゴデンドロサイト前駆細胞（OLIG2：EGFP ^+）は、病変の部位（矢印）に蓄積する。スケールバー：200μmである。すべてのパネルでは、右半球は、病変半球です。背がアップしています。 〜Dの中の破線は外套とsubpalliumの境界を示している。

監視対象として図4。けがを刺すに応答してアップレギュレートされた遺伝子の例は。eomesa（A、B）と右終脳半球（刺さ半球）でのsox4a（C）mRNA発現の強いアップレギュレーション（矢印）に注意してください5 DPLでのin situハイブリダイゼーションによって。左半球が損傷していないで、対照となる。 （B）は、Aの背の背側終脳領域の高倍率がアップして表示します。スケールバー：AとCのためには200μmとBザ·55ミクロンAとCでの破線は外套とsubpalliumの間の距離を示している。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

略語
AP	アルカリホスファターゼ
BCIP	5 - ブロモ-4 - クロロ-3'-indolyphosphate
BSA	ウシ血清アルブミン
CNS	中枢神経系
掘る	ジゴキシゲニン
DMSO	ジメチルスルホキシド
DPL	病変後の日
eomesa	EomesoderminホモログA
GFAP	グリア細胞繊維性酸性タンパク質
時間	時間
HYBバッファ	ハイブリダイゼーション緩衝液
ISH	in situハイブリダイゼーション
メタノール	メタノール
NBT	ニトロブルーテトラゾ
OPCは	オリゴデンドロサイト前駆細胞
PBS	リン酸緩衝生理食塩水
PCNA	増殖性細胞核抗原
PFA	パラホルムアルデヒド
ProtK	プロテイナーゼK
PSA-NCAM	ポリシアル神経細胞接着分子
PTW	PBS、0.1％Tween-20を
RNA	リボ核酸
RT	室温
SGZ	下帯
sox4a	遺伝子4Aを含むSRY-ボックス
SSC	生理食塩水 - クエン酸ナトリウム
SVZ	脳室下帯
TRは	転写調節因子

Discussion

ここでは大人のゼブラフィッシュの頭蓋骨を通して針を押すことで、終脳の損傷を誘発し、免疫組織化学およびin situハイブリダイゼーションこの傷害に対する細胞および分子の反応を分析するための方法を説明します。他の既存のアプローチよりもこの技術の主な利点は、その単純さ、速度およびコスト効率である。したがって、短時間に多数の負傷脳の製造を可能にするこの技術は、容易に再生および神経発生における役割を有する遺伝子を同定するためのin situハイブリダイゼーション画面における大規模と組み合わせることができる。

損傷が施された成体ゼブラフィッシュの年齢が重要である。魚は1.5年よりも古い場合は、頭蓋骨は硬すぎて、それは頭蓋骨が押し下げられたり破断ではなく、きれいにあきている可能性があります。これとは対照的に、若い魚（4ヶ月未満の）で、LEAかもしれませんが起こって神経発生の多くは、まだある反応性の神経発生に関する偽陽性の結果をD。

このアプローチのもう一つの重要なステップは、刺し傷の効率を検証し、両半球が負傷していることを排除することです。これは、抗PCNA抗体を用いて切片を染色することによりモニターすることができる。正しく導入された病変では、PCNAは1半球の中で有意にアップレギュレートする必要があります。

これは、誘発される機械的損傷は、非特異的な細胞除去、なぜなら二次変性、炎症および血液脳関門の破壊の増加した細胞死、及び心室領域の損傷などとのようないくつかの副作用を有するであろうことに留意することが重要である脳実質への脳脊髄液の可能な結果の流れ。しかし、負傷した魚が怪我からごくわずかに苦しむように見える。 2分以内に彼らは再び自由に泳いでいると、通常の摂食行動は、約4時間以内に復元されます。 3週間後、私njuryはもう、形態学的には表示されません。私たちの手では、数百の手術から、我々は5日後に病変の組織学によって評価されるように我々は100％の負傷率を持っていたという事実にもかかわらず、単一の魚を失うことはありませんでした。

過去数年において、このようなトランスジェニックアプローチのような他の技術は、組織または細胞型特異的アブレーション^2を生成するために、ゼブラフィッシュが開発されている。これらの技術は、非常にエレガントで最小侵襲的であるが、それらは複雑なDNA構築物の生成と、非常に面倒で時間がかかる可能性があり、いくつかの安定したゼブラフィッシュのトランスジェニック系統の確立に基づいています。したがって、このようなこのプロトコルに記載されたアッセイのような単純な機械的なアプローチは、成人の脳の神経発生と再生を研究するための重要なツールのまま。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tricaine	Sigma	335.2
10x DPBS (-/-)	Life technologies	14200-083
30 G syringe (Omnican 40)	B.Braun Melsungen	916162
Polyethylene molding cup tray	Polysciences, Inc	17177C-3
PeqGOLD Universal Agarose	Peqlab	35-1020
Bovine serum albumin	Biochrom	W 2835919108
Aqua Poly/Mount	Polysciences, Inc	18606-20
Tween 20	Carl Roth	9127.1
DMSO	Carl Roth	A994.2
Dissection needle	Carl Roth	KX93.1
Paraformaldehyde	Carl Roth	335.2
Loctite 414	Schöffler und Wörner	06 1362 0020
Glass slides	Labonord	5305103
Cover slips 24 x 60 mm	Labonord	5305060
Petri dishes, 94 mm	Greiner bio-one	632180
Falcon tubes, 15 ml	Greiner bio-one	188261
24-well plate	Greiner bio-one	662160
Anti-S100 (1:500)	Dako	Z031101-2
Anti-PCNA (1:400)	Dako	M087901
Anti-GFP (1:1,000)	Aves Labs	GFP-1020
anti-Dig AP-coupled antibody	Roche Diagnostics	11093274910
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP)	Roche Diagnostics	1383221
4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT)	Roche Diagnostics	1383213
Proteinase K	Roche Diagnostics	1092766
Polyethylene molding cup tray	Polysciences	17177C-3
Vibratome VT1000S	Leica
Confocal microscope Sp5 DM6000	Leica
Dissecting microscope Nikon SMZ 645	Nikon
24-well flat bottomed tissue culture plates	Falcon catalog	353226
Student Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	91150-20
Surgical scissors	Fine Science Tools	91460-11
Danio rerio Tg(olig2:EGFP)	Shin et al.24
Danio rerio WT strains (e.g., AB2O2)