Abstract
Взрослый данио имеют удивительную способность к регенерации их центральную нервную систему после травмы. Для исследования клеточного ответа и молекулярные механизмы, вовлеченные в данио взрослого центральной нервной системы (ЦНС) регенерации и ремонта, мы разработали данио модель взрослого травмы конечного мозга.
При таком подходе мы вручную генерировать травмы, нажав инсулиновый шприц иглу в данио взрослого мозге. В разные дни после травмы, рыба умерщвляли, их мозг вырезали и окрашивали с помощью иммуногистохимии и / или в гибридизация (ISH) с соответствующими маркерами для наблюдения пролиферации клеток, глиогенеза и нейрогенез. Контралатеральной непораженный полушарие служит в качестве внутреннего контроля. Этот метод в сочетании, например, с РНК глубокой последовательности может помочь экране для новых генов с ролью в данио взрослых мозге нейрогенеза, регенерации и ремонта.
Introduction
Млекопитающие имеют очень ограниченные возможности мобилизации новых нейронов во взрослой жизни, и взрослый нейрогенез в мозге, в основном, ограничивается двумя конечного мозга регионов, расположенных на субвентрикулярной зоне (SVZ) боковых желудочков, и под зернистым зона (SGZ) зубчатой извилины в гиппокампе 1. Млекопитающие также не может восстановить повреждения мозга, вызванного нейродегенеративных заболеваний, инсульта или травмы, эффективно. Потерянные нейроны не будут заменены, а вместо этого пролиферации различных типов глиальных клеток, в том числе астроцитов, микроглии и олигодендроцитов, не наблюдается. Как следствие этого пролиферативной процесса, называемого реактивного глиоз, раненых ткани мозга уплотнен образованием глиальных шрам, который ингибирует нейрональные и регенерацию аксонов 2-4.
В отличие от млекопитающих, костистых рыб, как данио сформировать новые нейроны в изобилии в взрослой стадии и имеют высокую регенеративные и proliferatив потенциал для ремонта поражения центральной нервной системы 2,5-7. Данио взрослый мозг содержит 16 различных нейронных ниши стволовых клеток, которые генерируют большое количество новых нейронов в течение всей жизни 8-11. Нейроны, рожденные в этих конкретных распространения зон взрослого данио мозга мигрируют в своих целевых районах, где они будут сроком погашения и интеграции в существующие нейронных сетей 8,10,12-15.
Среди предшественников зон, определенных в взрослых данио, зона конечного мозга желудочка является одним из наиболее изученных нервных стволовых клеток ниши. Клетки в этой нише предшественников могут быть классифицированы на три группы в отношении их морфологию, скорость деления и экспрессию различных глиальных или нейронных маркеров. Тип I и клетки типа II радиальные глии как клетки, которые имеют длинные процессы. Они выражают стволовых клеток маркеры, включая GFAP, нестина и S100β. Тип I клетки не размножаются в то время как клетки типа II proliferatэ медленно, о чем свидетельствует их выражения распространения маркеров, таких как пролиферирующих клеток ядерного антигена (PCNA) и включение desoxythymidine аналогов. Клетки III типа быстро делящихся клеток, которые привержены стать нервные клетки-предшественники и выразить нервные маркерных генов, таких как PSA-NCAM 5,16.
Хотя регенеративные мощности костистых рыб, хорошо документированы, всего в нескольких публикациях описаны и подробно исследовали клеточные и молекулярные механизмы, участвующие в регенерации нейронов во взрослом мозге в ответ на повреждение 15,17-22. Чтобы расшифровать механизмы, причастных к данио взрослого центральной нервной регенерации и восстановления системы и понять сходства и различия между конститутивной и регенеративной нейрогенеза, мы разработали данио модель взрослого травмы конечного мозга. Здесь мы опишем визуально, как генерировать травмы в одном из конечного мозга hemisphERES с помощью иглы шприца, при сохранении контралатеральной непораженный сторону в качестве внутреннего контроля. Мы также покажем, как контролировать изменения при травме в клеточной пролиферации и экспрессии генов с помощью иммуногистохимии и в гибридизация анализов.
Protocol
Данио рерио были сохранены в рыбной объекта Института токсикологии и генетики (ITG) в Технологический институт Карлсруэ (KIT). Эксперименты на животных были проведены в соответствии с немецкими стандартами по защите животных и были одобрены правительством земли Баден-Вюртемберг, Regierungspräsidium Карлсруэ, Германия (Aktenzeichen 35-9185.81/G-272/12 'Взрослый Neurogenese').
1. Генерация ножевое ранение в мозге
- Анестезия
- Для приготовления исходного раствора Tricaine (3-амино-бензойной кислоты этиловый эфир, называемый также этил-3-аминобензойной кислоты), используют 400 мг Tricaine порошка и растворить его в 97,9 мл воды и 2,1 мл 1 М Трис / HCl буфер (рН 9). Доводят рН до 7. Сделать 5 мл аликвоты и хранить их при -20 ° С до использования.
- Трансфер соответствующее количество 0,5-1 летнего рыбок данио от своих танков в пластиковых клетках мыши. Примечание: череп взрослого рыбок данио на около 12месячного возраста все еще относительно мягким и легко может быть перфорирована с помощью иглы (см. раздел 1.2.3 и рис 1А).
- Чтобы обезболить взрослых данио, объединить 5 мл Tricaine (исходный раствор) в пластиковых пересечения клетку с ~ 100 мл чистой рыбы резервуар для воды (конечная концентрация Tricaine 0,02% (вес / объем) Tricaine).
- Выдержите рыбу в анестетиков, пока они не больше не двигаются (45-60 сек).
- Телэнцефалона Травма
- Место индивидуальный наркоз данио в щель в блоке Tricaine пропитанной пены.
- Под микроскопом рассекает со светом сверху мягко держать рыбу с одной стороны, и ориентировать его таким образом, что позволяет получить доступ к голове сверху.
- С другой стороны подтолкнуть 30 г шприц (инсулиновый шприц с интегрированной иглой) вертикально через череп в медиальной области одного конечного мозга полушарии (1А-1В). Полушария конечного мозга авновь видны через череп. Убедитесь, что введен поражение не глубже, чем 2 мм (рис. 1в). Примечание: Настоятельно рекомендуется ввести поражение всегда в том же полушарии, чтобы облегчить идентификацию месте поражения, когда рассекает мозг из черепа.
- После введения конечного мозга травмы, поместите рыбу в свежей рыбы воды. Держите до 10 рыб в клетке 2 л мыши, наполненный рыбой воды для восстановления и подключите клетку мыши к системе подачи воды. Примечание: выживаемость, как правило, ~ 97%, если рыба здоровы и никаких других эксперименты не проводились с рыбой раньше. Добавление антибиотиков для рыбы воды не надо. После выздоровления, рыбы ведут себя нормально: они плавают, кормов и мат.
2. Анализа влияния конечного мозга травмы
- Мозг Вскрытие и Фиксация
- Повторно восстановленный анестезировать рыбы в различные моменты времени после повреждения (Typicallу, 1, 3, 5 и 14 дней после поражения (DPL)) с 0,02% (вес / объем) Tricaine, как указано выше, и их эвтаназии, поместив их в воду со льдом в течение 5 мин.
- Поместите рыбу на бумажной ткани, смоченной в фосфатно-солевом буфере (PBS) и отделить голову от тела за счет сокращения жабры с резким ножницами.
- Держите голову в 1x PBS в течение 5 мин, чтобы позволить кровотечение. Примечание: Эта истощает кровь из ткани, которая может возмутить дальнейшие шаги в протоколе.
- Закрепить головы в течение ночи при 4 ° С в 4% параформальдегида (PFA) в PBS или 4 часа при комнатной температуре (RT).
- Промыть фиксированные головы дважды с 1x PBS в чашке Петри.
- Тщательно Рассеките мозги в 1x PBS при вскрытии микроскопом 23. Поражение, как правило, видны под микроскопом рассекает. Мозги без видимого поражения должен быть уничтожен.
- Передача мозги в 2 мл реакционных трубок, заполненных 1,5 мл 100% метанола (MeOH) и инвертировать трубки 5x перед инкубациейих при -20 ° С в течение по крайней мере 16 часов. Примечание: Мозги может храниться в течение нескольких месяцев в МеОН при -20 ° С до использования для иммуногистохимии или в гибридизация.
- Подготовка ткани для иммуногистохимии
- Увлажняет мозги через метанола серии нисходящей в 2 мл пластиковые пробирки (последовательно 75% метанола (1x PBS, 0,1% Твин-20 = Оптовая цена);. 50% метанол, 25% метанол Выдержите мозги (15 мозги / 2 мл пробирок ) в течение 5 мин в каждом растворе.
- Вымойте голову в ПТВ в течение 5 мин. Повторите 4 раза со свежим PTW.
- Вложение интеллектов для секционирования
- Для встраивания, передача мозги из реакционной трубки 2 мл в PTW в полости полиэтилен формования чашек с передачей пипетки (диаметр 5 мм).
- Подготовьте 2% агарозы (степень ДНК) в 1x PBS в колбе Эрленмейера. Нагрейте ее в микроволновой печи при 600 Вт, пока агарозном не растворится полностью. Подготовка 50 мл в течение 10 мозгов. Пусть йе агарозном остыть в течение 3 мин при комнатной температуре перед использованием. Держите агарозы на предварительно нагретой нагревательный блок (60 ° C), а вложение мозги для того, чтобы предотвратить затвердевание.
- Извлеките 1X PBS из пресс-формы, содержащей один мозг с помощью пипетки Пастера (диаметр 1 мм). Будьте осторожны, чтобы не повредить мозг.
- Налейте агарозы в форму и полностью заполнить его. Затем используйте рассечение иглы циркулировать мозг в агарозы, чтобы смыть PTW облегчая вставлять мозг.
- Ориент мозг в формы брюшной стороне вниз, из стороны спинной и поместить его прямо.
- Пусть агарозы остыть. Для более быстрого охлаждения, поместите форму на льду. Повторите шаги.
- Повторите 2.3.3-2.3.6 для всех мозгов.
- Обрезка агарозы блока
- Использование рассечение иглы, выскочить агарозы блок.
- С острым лезвием бритвы, вырезать агарозы на заднем конце головного мозга. Убедитесь, что это плоскость параллельна ТЕlencephalon.
- Обрежьте агарозы на переднем конце головного мозга. Тогда переверните блок так, чтобы он стоит на заднем плане.
- Удалить избыток агарозы путем разрезания параллельно спинной мозга и брюшной сторон. Тогда переверните мозг назад, чтобы он лежит на брюшной стороне.
- Разрежьте блок усеченного треугольника, в котором конечный мозг находится в меньшей плоскости (рис. 2).
- Подготовка Vibratome для секционирования
- Подготовьте Vibratome в соответствии с инструкциями изготовителя. Используйте новую лезвие и заменить его после 10 мозгов.
- Заполнить буфер ванны с 1х PBS до уровня, который просто достигает дна лезвия.
- Поместите маленькую точку суперклея на верхней части образца диска в Vibratome.
- Осторожно поместите самолет, который находится кзади от мозга на суперклей. Клей затвердеет, как только он находится в контакте с 1x PBS вбуфер ванна Vibratome.
- Вставьте образца диск с образца в буферный лоток с помощью манипулятора микротоме.
- С помощью манипулятора для вращения образца диск в требуемом положении. Расположите блок в буферном ванной таким образом, что находит конечного мозга прямо под поверхностью, с спинной части мозга, обращенной лезвие. Затем затяните ЮКЖД с 3 мм шестигранным ключом и снимите манипулятор. Примечание: зажимной винт или один из зажимных устройств не должен быть расположен над зазором в образце диска; в этих позициях зажима образца диск невозможно.
- Секционирование мозг
- Подготовка 24-луночный планшет для сбора секций. За мозга быть секционного, заполнить один хорошо 1 мл блокирующего буфера (0,1% (объем / объем) 10% Твин-20, 0,2% (вес / объем) бычьим сывороточным альбумином (BSA), 1% (об / об) диметилсульфоксид (ДМСО) в PBS).
- Начните секционирования при 50 толщиной мкм, скорость 1 мм / сек и 70 Частота Гцс помощью вибрационного микротом.
- Используйте синтетическую щетку (1 мм), чтобы забрать тонкие ломтики агарозы как они отрываются лезвие и собрать их в тарелку 24-а.
- Иммуногистохимия на Vibratome разделах
- Блок неспецифические сайты связывания для 1 часа при комнатной температуре в блокирующем буфере (0,1% (объем / объем) 10% Tween 20, 0,2% (вес / объем) BSA, 1% (об / об) ДМСО в ЗФР).
- Удалить супернатант и добавить 250 мкл разведенного антитела в блокирующем буфере в течение ночи при 4 ° С. Кроме того, инкубировать первичного антитела в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем промыть 3 раза в течение 10 мин в ПТВ. Примечание: Для окрашивания PCNA использовать разведение 1:400 (мыши анти-PCNA Более подробную информацию см. в таблице материалов.). Несколько первичные антитела можно инкубировать в то же время.
- Инкубируйте разделы в вторичными антителами в течение 2 ч при комнатной температуре затем промыть 3 раза в течение 10 мин в PTW. Примечание: разведении 1:1000 в ПТВ, для детальных см. таблицу материалов. Несколько вторичные антитела можно инкубировать в то же время.
- Взрослый мозг РНК в гибридизация (в качестве альтернативы иммуногистохимии)
- Мозг Вскрытие и фиксация (та же процедура, для иммуногистохимии):
- Гибридизация зонда.
- Увлажняет мозги в 2 мл пробирки реакции, как описано для иммуногистохимического анализа.
- Инкубировать мозги в протеиназой К (ProtK;. 10 мкг / мл конечная концентрация) в PTW течение 30 мин. После инкубационного периода удалить ProtK / PTW и исправить мозги снова в течение 20 мин в BT-Fix (4% PFA, 4% сахарозы, 0,12 мМ CaCl 2, 77 мМ Na 2 HPO 4, 23 мМ NaH 2 PO 4).
- Промыть мозги 5x течение 5 мин в PTW (0,1% (объем / объем) Твин-20 в PBS).
- Удалить PTW и промыть мозги в 500 мклHYB буфер (50% (объем / объем) деионизированной формамид, 5x SSC, 500 мкг / мл дрожжевой тРНК, 50 мкг / мл гепарина, 0,1% Tween-20, 9 мм citricacid). Подождите пока мозг не оседают на дне пробирки затем отбросить супернатант и добавить 500 мкл буфера чистой HYB и инкубировать при 65-70 ° С в течение 3-4 часов.
- Развести РНК зонд до 1:200 или 1:400 (в зависимости от зонда) в 400 мкл конечного объема HYB буфера. Нагреть разбавленный РНК зонд при 70 ° С в течение 5 мин.
- Удалить супернатант из мозга и добавьте РНК зонд, инкубировать при 65-70 ° C (O / N). Все для мытья буферные растворы должны быть предварительно нагретой и выдерживали при 70 ° C.
- Маркировка
- Промыть мозги при 65-70 ° С (в течение всех стадий промывки 4) с 500 мкл промывочного буфера 1 (50% формамид, 1x SSC, 0,05% Tween 20) дважды в течение 30 мин. Заменить буфер на один буфера 2 (2x SSC, 0,1% Tween 20) и инкубируют в течение 15 мин. Удалить буфер 2 и мыть голову в буфере 3 (0,2 x SSC, 0,1% Твин 20) FOR 30 мин, повторите этот шаг 2 раза. Заменить буфер на 3 буфера 4 (0,1 x SSC, 0,05% Tween 20 в PTW), инкубируют в течение 5 мин.
- Удалить супернатант и мыть в течение 5 мин в 500 мкл PTW при комнатной температуре.
- Вставить мозги в 2% агарозы (в 1х PBS) и сократить Vibratome секций (50-100 мкм), как описано для иммуногистохимического анализа.
- Wash 1x течение 5 мин в 500 мкл блокирующего буфера (1X PBS, 0,1% Твин-20, 0,2% (вес / объем) BSA, 1% (об / об) ДМСО).
- Удалить супернатант и добавить 500 мкл блокирующего буфера в течение 2 часов при комнатной температуре.
- Удалить супернатант и добавить 300 мкл анти-Dig AP связью антитела, разведенного 1:4000 в блокирующем буфере.
- Выдержите O / N при 4 ° С.
- НБТ / BCIP Окрашивание
- Промыть 5x в течение 15 мин с PTW буфере при комнатной температуре.
- Промыть 1x в окрашивания буфера. Промыть два раза 5 мин в окрашивающего буфера (100 мМ Трис / HCl рН 9,5, 50 мМ MgCl 2, 100 мМ NaCl, 0,1% Tween-20).
- Удалить супернатант и пятна с 500 μл окрашивание раствор (3,5 мкл 4-тетразола метилене (NBT) и 5-бром-4-хлор-3-индолил-фосфат (BCIP) в 1 мл окрашивающего буфера).
- Остановить окрашивания путем промывки 3 раза до 5x с ПТВ.
- Мозг Вскрытие и фиксация (та же процедура, для иммуногистохимии):
- Монтаж секций
- Установите разделы на слайдах с использованием водорастворимой, не-флуоресцентный монтажную среду (см. таблицу материалы).
- Держите слайды в холодильнике при температуре 4 ° C. Примечание: окрашивание стабилен в течение нескольких недель или даже месяцев.
- Анализ слайды под соединением или конфокальной микроскопии.
Representative Results
Использование рабочего процесса описанной в этой статье, поражение было введено в правом полушарии взрослого данио мозге (1А-1В). Правильный ранение приводит к поражения канала, который простирается от спины к брюху через весь плащ конечного мозга (рис. 3C). Поражение должно быть ограничено одним из полушарий и не пересекать срединную желудочек. Поражение канал видна с ярким микроскопии (рис. 3C) и будет исцелен после примерно 35 дней 15.
Ранее было показано, что после ранения в повышающей регуляции клеточной пролиферации ядерный антиген (PCNA; фиг.3А) и S100β (фиг.3В) на 3 до 7 DPL можно обнаружить с помощью иммуногистохимии 15. Окрашивание PCNA и S100β перекрываются, указывая распространения радиальных глиальных клеток.
Furthermore, для визуализации клеток олигодендроцитов предшественника (OPCS), колотая рана Анализ проводили на Tg (Olig2: EGFP) рыба 24. После окрашивания с анти-GFP антител, накопление OPCs в непосредственной близости от повреждений канала обнаруживается (рис. 3D). Это накопление является временным, и OPC кластеры не наблюдается больше при 35 DPL 15.
Если поражение не было введено правильно, поражение канал не будет видно, и до-регулирования PCNA и S100β или накопления OPCs не будет обнаружено. PCNA является наиболее чувствительным маркером повреждения головного мозга. Для того чтобы проверить эффективность колотой раны и исключить, что оба полушария ранены, настоятельно рекомендуется всегда окрашивает разделы с антителом анти-PCNA. В правильно введена поражения, PCNA должна быть значительно повышающей регуляции (до 4-кратного 15) только в одном из полушарий. Хотя в большинстве случаев этодостаточно использовать только контралатеральный непораженный сторону в качестве внутреннего контроля для мониторинга изменения в экспрессии генов, то настоятельно рекомендуем сравнить генную экспрессию в контрольной полушарии с выражением в конечного мозга полушарий мозга дикого типа. Таким образом, любые системные эффекты поражения на экспрессию генов, которые могут повлиять обоих полушарий могут быть обнаружены.
Колотой раны анализа в сочетании с систематическим экране экспрессии регуляторов транскрипции (TRS) (25 и Schmidt и соавт., Не опубликовано) также может быть использован, чтобы идентифицировать гены TR с возможной роли в нейрогенеза и регенерации (фиг.4А-4С).
Этот подход был выявлен ряд факторов, которые выражаются в мозге и, экспрессия которых является специально регулировался в ответ на повреждение (рис. 4A-C).
Рисунок 2 S.chematic представление взрослого данио мозга в подстриженной агарозном блока непосредственно перед Vibratome секционирования. Передняя вверх. Обонятельной луковице (OB), конечный мозг (тел), оптический Tectum (OT), мозжечок (ЦБ) и мозговое вещество (м). Шкала бар: 500 мкм.
Рисунок 3. Восстановительные ответы заколоть травмы раны. Н.э.) взрослых данио мозг на 5 дней после поражения (DPL). А.Б.) Пролиферативное маркер PCNA (А) и радиальной глии маркер S100β (В) до регулируемых в вентрикулярной зоне (стрелки) на колотой ранения. (С) Поражение канала видна при ярком освещении поля (стрелки). Желудочка пояса указывается зеленой линии. (D) клетки-предшественники олигодендроцитов (Olig2: EGFP +) накапливать в месте поражения (стрелки). Шкала бар: 200 мкм. Во всех панелей, правое полушарие является поражением, полушарие. Спинной вверх. Пунктирная линия на на D указывает на границу между мантии и subpallium.
Рисунок 4. Пример генов до регулируемых в ответ на удар травмы. Обратите внимание на сильное повышающее регулирование (стрелки) из eomesa (А, В) и sox4a (С) экспрессии мРНК в правильном конечного мозга полушарии (ножом полушарие), как мониторинг на в гибридизация на 5 DPL. Левое полушарие является неповрежденной и служит в качестве контроля. (В) показывает большем увеличении спинной конечного мозга области А. Dorsal вверх. Шкала бар: 200 мкм для А и С и 55 мкм для В.пунктирная линия в А и С указывает расстояние между мантии и subpallium. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| СОКРАЩЕНИЯ | |
| AP | Щелочная фосфатаза |
| BCIP | 5-бром-4-хлор-3'-indolyphosphate |
| BSA | Бычий сывороточный альбумин |
| ЦНС | Центральная нервная система |
| Копать | Дигоксигенином |
| ДМСО | Диметилсульфоксид |
| DPL | Дней после поражения |
| eomesa | Eomesodermin гомолог |
| GFAP | Глиальных фибриллярный кислый белок |
| час | Час |
| HYBбуфер | Гибридизация буфер |
| ISH | в гибридизация |
| MeOH | Метанол |
| НБТ | Нитро-тетразолия |
| OPCs | Клетки-предшественники олигодендроцитов |
| PBS | Забуференный фосфатом физиологический раствор |
| PCNA | Ядерного антигена пролиферирующих клеток |
| PFA | Параформальдегид |
| ProtK | Протеиназы К |
| PSA-NCAM | Полисиалилированный нейронов молекулы клеточной адгезии |
| Оптовая цена | PBS, 0,1% Tween-20 |
| РНК | Рибонуклеиновая кислота |
| RT | Температура в помещении |
| SGZ | Субгранулярной зона |
| sox4a | SRY-коробка, содержащая ген 4а |
| SSC | Цитрат Соленая-натрия |
| СВЗ | Субвентрикулярной зоне |
| ТУ | Регуляторы транскрипции |
Discussion
Мы описываем здесь метод индуцировать конечного мозга травмы, нажав иглу через череп взрослого рыбок данио, и для анализа клеточной и молекулярной реакции на этой травмы по иммуногистохимии и в гибридизация. Основным преимуществом этого метода по сравнению с другими существующих подходов является его простота, скорость и эффективность затрат. Таким образом, эта техника, которая позволяет производство многих пострадавших мозги в течение короткого времени, может легко сочетаться с больших масштабах экране гибридизации месте в идентификации генов, с ролью в регенерации и нейрогенеза.
Возраст взрослых данио, по которому выполняется травма имеет решающее значение. Если рыба старше 1,5 лет, череп слишком сильно и не исключено, что череп толкают вниз или перелом, а не чисто перфорированная. В противоположность этому, в молодой рыбы (моложе 4 месяцев), есть еще много нейрогенеза происходит, что может Леаг к ложным положительным результатам в отношении реактивной нейрогенеза.
Другим важным шагом в этом подходе заключается в проверке эффективности колотой раны и исключить, что оба полушария ранены. Это можно контролировать путем окрашивания секции с антителом анти-PCNA. В правильно введена поражения, PCNA должна быть значительно выше, регулировать только в одном из полушарий.
Важно иметь в виду, что индуцированное механическая травма будет иметь несколько побочных эффектов, таких как неспецифический клеток абляции, повышенной гибели клеток из-за вторичной дегенерации, воспаления и разрушения гематоэнцефалического барьера, и повреждения зоны желудочка и как возможным последствием поток спинномозговой жидкости в паренхиме головного мозга. Тем не менее, поврежденные рыба по-видимому, страдают очень мало от травмы. В 2 мин они свободное плавание снова и нормальное пищевое поведение восстанавливается в течение примерно 4 часов. Через 3 недели яnjury морфологически не видно больше. В наших руках, от нескольких сотен операций мы не потеряли ни одной рыбы, несмотря на то, что мы имели уровень травматизма на 100% по оценке гистологии 5 дней после поражения.
В последние годы другие методы, такие как трансгенных подходов были разработаны в данио производить ткани или типа клетки конкретный абляции 2. Хотя эти методы являются очень элегантным и минимально инвазивной они основаны на генерации сложных конструкций ДНК и создание нескольких стабильных данио трансгенных линий, которые могут быть очень утомительным и трудоемким. Таким образом, простые механические подходы, такие как анализа, описанного в этом протоколе остаются важным инструментом для изучения нейрогенез мозга и регенерацию.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine | Sigma | 335.2 | |
| 10x DPBS (-/-) | Life technologies | 14200-083 | |
| 30 G syringe (Omnican 40) | B.Braun Melsungen | 916162 | |
| Polyethylene molding cup tray | Polysciences, Inc | 17177C-3 | |
| PeqGOLD Universal Agarose | Peqlab | 35-1020 | |
| Bovine serum albumin | Biochrom | W 2835919108 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences, Inc | 18606-20 | |
| Tween 20 | Carl Roth | 9127.1 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
| Dissection needle | Carl Roth | KX93.1 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.2 | |
| Loctite 414 | Schöffler und Wörner | 06 1362 0020 | |
| Glass slides | Labonord | 5305103 | |
| Cover slips 24 x 60 mm | Labonord | 5305060 | |
| Petri dishes, 94 mm | Greiner bio-one | 632180 | |
| Falcon tubes, 15 ml | Greiner bio-one | 188261 | |
| 24-well plate | Greiner bio-one | 662160 | |
| Anti-S100 (1:500) | Dako | Z031101-2 | |
| Anti-PCNA (1:400) | Dako | M087901 | |
| Anti-GFP (1:1,000) | Aves Labs | GFP-1020 | |
| anti-Dig AP-coupled antibody | Roche Diagnostics | 11093274910 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Roche Diagnostics | 1383221 | |
| 4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Roche Diagnostics | 1383213 | |
| Proteinase K | Roche Diagnostics | 1092766 | |
| Polyethylene molding cup tray | Polysciences | 17177C-3 | |
| Vibratome VT1000S | Leica | ||
| Confocal microscope Sp5 DM6000 | Leica | ||
| Dissecting microscope Nikon SMZ 645 | Nikon | ||
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon catalog | 353226 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Danio rerio Tg(olig2:EGFP) | Shin et al.24 | ||
| Danio rerio WT strains (e.g., AB2O2) |
References
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72, 429-461 (2012).
- Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis. Nat Rev Neurosci. 12, 88-104 (2011).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32, 638-647 (2009).
- Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Dev. 8, 3 (2013).
- Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the central nervous system of teleost fish. Eur J Neurosci. 34, 917-929 (2011).
- Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. Teleost fish as a model system to study successful regeneration of the central nervous system. Curr Top Microbiol Immunol. 367, 193-233 (2013).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295, 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Dev Biol. 295, 263-277 (2006).
- Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain. J Comp Neurol. 488, 290-319 (2005).
- Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29, 745-757 (2007).
- Hinsch, K., Zupanc, G. K. Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis. Neuroscience. 146, 679-696 (2007).
- Lindsey, B. W., Darabie, A., Tropepe, V. The cellular composition of neurogenic periventricular zones in the adult zebrafish forebrain. J Comp Neurol. 520, 2275-2316 (2012).
- Marz, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58, 870-888 (2010).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240, 2221-2231 (2011).
- Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223, 131-147 (2013).
- Ayari, B., El Hachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon. J Neurotrauma. 27, 959-972 (2010).
- Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis. Glia. 60, 343-357 (2011).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Dis Model Mech. 5, 200-209 (2012).
- Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Dev Cell. 23, 1230-1237 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138, 4831-4841 (2011).
- Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338, 1353-1356 (2012).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Shin, J., Park, H. C., Topczewska, J. M., Mawdsley, D. J., Appel, B. Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics. Methods Cell Sci. 25, 7-14 (2003).
- Armant, O., et al. Genome-wide, whole mount in situ analysis of transcriptional regulators in zebrafish embryos. Dev Biol. 380, 351-362 (2013).
