Abstract
성인 제브라 피쉬는 부상 후 자신의 중추 신경계를 재생하는 놀라운 능력이있다. 세포 반응 및 제브라 피쉬 성인 중추 신경계 (CNS) 재생 및 수리에 관련된 분자 메커니즘을 조사하기 위해, 우리는 성인 telencephalic 부상의 제브라 피쉬 모델을 개발.
이 방법에서는, 우리는 수동으로 제브라 피쉬 성인 telencephalon로 인슐린 주사기 바늘을 밀어 상해를 생성합니다. 다른 포스트 부상 일에, 물고기는 그들의 두뇌가 밖으로 해부 및 세포 증식, gliogenesis, 그리고 신경을 관찰 할 수있는 적절한 마커를 면역 조직 화학 염색 및 / 또는 현장 하이브리드 (ISH)에 의해 더러워, 희생. 반대측 unlesioned 반구 내부 통제 역할을합니다. RNA 깊은 시퀀싱 예를 들어 조합이 방법은 제브라 피쉬 성인 telencephalon의 신경 발생, 재생 및 수리의 역할과 새로운 유전자에 대한 화면으로 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
포유 동물은 성인 생활 동안 새로운 신경 세포를 생성하는 매우 제한된 용량을 가지고 있고, 뇌의 성인 신경은 주로 측면 심실의 subventricular 영역 (SVZ)에 위치한 두 telencephalic 지역으로 제한되고, 치아의 subgranular 영역 (SGZ) 해마 1 이랑. 포유 동물은 효율적으로, 신경 퇴행성 질환, 뇌졸중, 또는 부상으로 인한 뇌의 손상을 복구 할 수 없습니다. 분실 된 신경 세포는 교체되지 않고 성상 세포, 미세 아교 세포 및 희소 돌기 아교 세포 등의 glial 세포의 다른 유형의 대신 증식, 관찰된다. 반응성 신경교 증이라는 증식 과정의 결과로서 부상 뇌 조직은 신경 세포의 축삭 재생을 억제 2-4 교세포 반흔의 형성에 의해 봉쇄된다.
포유 동물, 경골 어류는 대조적으로 제브라 피쉬와 같은 성인 단계에 풍부하게 새로운 뉴런을 형성하고 높은 재생 및 proliferat이중추 신경계 2,5-7의 병변을 복구 할 가능성을 필자. 제브라 피쉬 성인의 뇌는 전체 수명 8-11 동안 새로운 뉴런의 큰 숫자를 생성하는 16 별개의 신경 줄기 세포 틈새가 포함되어 있습니다. 성인 제브라 피쉬의 뇌의 이러한 특정 확산 영역에서 태어난 뉴런들은 성숙하고 기존 네트워크의 연결 8,10,12-15에 통합됩니다 타겟 지역으로 이주.
성인 제브라 피쉬에서 식별 원종 영역 중에서도 telencephalic 심실 영역은 대부분 연구 신경 줄기 세포 틈새 중 하나이다. 이 시조 틈새에있는 세포들은 형태, 분할 비율 및 다른 신경 교세포 또는 마커의 발현에 관한 세 가지 유형으로 분류 될 수있다. I 형과 II 형 세포는 긴 과정이 세포처럼 방사형 폐해입니다. 그들은 GFAP, 네 스틴 및 S100β 등의 줄기 세포 마커를 표현한다. 유형 II 세포가 proliferat 동안 세포가 증식하지 않는 입력전자 천천히, 휴대 핵 항원 (PCNA)과 desoxythymidine 유사체의 설립을 증식으로 확산 마커의 발현에 의해 입증. 유형 III 세포는 빠른 신경 전구 세포가 이러한 PSA-NCAM 5,16와 같은 신경 마커 유전자를 표현하기 위해 최선을 다하고 있습니다 세포를 분할됩니다.
경골 어류의 재생 능력이 잘 설명되어 있지만, 단 몇 출판물 부상 15,17-22에 대한 응답으로 성인 telencephalon에있는 신경 세포의 재생에 관련된 세포 및 분자 메커니즘을 상세히 설명하고 조사 하였다. 제브라 피쉬의 성인 중추 신경계 재생 및 수리에 관여하는 메커니즘을 해독하고 제정 및 재생 신경 사이의 유사점과 차이점을 이해하기 위해, 우리는 성인 telencephalic 부상의 제브라 피쉬 모델을 개발. 여기에서, 우리는 telencephalic hemisph 중 하나에 부상을 생성하는 시각적 방법에 대해 설명합니다주사기 바늘의 도움으로 ERES, 내부 통제 등의 반대측 unlesioned 측면을 유지하면서. 우리는 또한 세포 증식과 면역 조직 화학 염색에 의한 유전자 발현 및 현장 하이브리드 화 분석의 부상에 따라 변경 사항을 모니터링하는 방법을 보여줍니다.
Protocol
제브라 피쉬는 기술 (KIT)의 카를 스루에 연구소에서 독성 및 유전 (ITG)의 학회의 물고기 시설에서 유지되었다. 동물 실험은 독일의 동물 보호 기준에 따라 수행하고, 바덴 뷔 르템 베르크 주 정부, Regierungspräsidium 카를 스루에, 독일 (Aktenzeichen 35-9185.81/G-272/12 'Adulte Neurogenese')에 의해 승인되었다.
1. Telencephalon에 찔린 상처를 생성
- 마취
- (또한 에틸 3 - 아미노 벤조 에이트 불리는 3 - 아미노 벤조산 에틸 에스터) tricaine의 스톡 용액을 제조하는 tricaine 분말 400mg을 사용하고 97.9 ml의 물에 녹여 2.1 ㎖의 1 M 트리스 / 염산 완충액 (pH 9). 5 ㎖ 분취 량을 확인합니다. pH를 7로 조정하고 사용 할 때까지 -20 ° C에 저장합니다.
- 플라스틱 마우스 케이지에 자신의 탱크에서 0.5 년 된 제브라 피쉬의 적절한 수를 전송합니다. 참고 : 약 12에서 성인 제브라 피쉬의 두개골을세 달은 여전히 상대적으로 부드럽고 (1.2.3 절과 그림 1A 참조) 바늘로 쉽게 관통 할 수있다.
- 성인 제브라 피쉬를 마취하고 깨끗한 수조의 물 ~ 100 ㎖ (tricaine의 최종 농도 0.02 % (W / V) tricaine)와 플라스틱 횡단 케이지에 5 ㎖의 tricaine (원액)을 결합한다.
- 그들은 더 이상 (45 ~ 60 초) 이동하지 않습니다 때까지 마취에서 물고기를 품어.
- Telencephalon 부상
- 장소 개인 tricaine 적신 거품의 블록에 슬릿에 제브라 피쉬를 마취.
- 위에서 빛을 해부 현미경 완만 한 손으로 물고기를 잡고 위로부터 머리에 대한 액세스를 허용하는 방식으로 배향.
- 다른 손으로 수직 한 telencephalic 반구 (그림 1A-1B)의 중간 영역으로 두개골을 통해 30 G 주사기 (통합 바늘 인슐린 주사기)를 누릅니다. telencephalon의의 반구두개골을 볼 수 재. 도입 된 병변이 2mm (그림 1C)보다 더 깊은하지 있는지 확인하십시오. 참고 :이 매우 두개골의 두뇌를 해부 할 때 병변의 위치의 식별을 용이하게하기 위해 같은 반구에 항상 병변을 소개하는 것이 좋습니다.
- telencephalic 부상을 도입 한 후, 신선한 생선을 물에 물고기를 놓습니다. 복구를위한 물고기 물이 가득 2 L 마우스 케이지 (10) 물고기로 유지하고 물 흐름 시스템에 마우스 케이지를 연결합니다. 참고 : 물고기가 건강하고 다른 실험 전에 물고기를 수행하지 않은 경우, 생존율은 ~ 일반적으로 97 %입니다. 물고기 물에 항생제를 첨가 할 필요가 없습니다. 복구 후, 물고기가 정상적으로 작동 : 그들은, 사료, 그리고 동료 수영.
2. Telencephalic 상해의 효과를 분석
- 뇌 해부 및 고정
- 병변 (typicall 후 다른 시간 지점에서 복구 된 물고기를 다시하면 - 마취시키다Y, 1, 3, 5, 14 일 0.02 %로 병변 (DPL))를 포스트 (위 및 5 분 동안 얼음물에 넣어서 안락사로 w / v)의 tricaine.
- 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에 적신 종이 조직에 물고기를 놓고 날카로운 가위와 아가미 뒤에 절단하여 몸에서 머리를 분리.
- 출혈을 허용하기 위해 5 분 동안 PBS 1X에 헤드를 유지한다. 참고 :이 프로토콜의 추가 단계를 교란 할 수 있습니다 조직에서 혈액을 빼낸.
- PBS 또는 실온 (RT)에서 4 시간에서 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에서 4 ° C에서 밤새 머리를 고정합니다.
- 배양 접시에 1X PBS로 두 번 고정 된 머리를 씻으십시오.
- 해부 현미경 아래 23 1X PBS에서 조심스럽게 뇌를 해부하다. 병변은 해부 현미경 아래에서 일반적으로 볼 수 있습니다. 눈에 보이는 병변이없는 뇌는 폐기해야합니다.
- 1.5 ㎖의 100 % 메탄올로 채워진 2 ㎖의 반응 관 (메탄올)에 머리를 전송하고 배 배양하기 전에 튜브를 반전적어도 16 시간 동안 -20 ° C에서 그들. 주 : 면역 조직 화학 염색 또는 현장 하이브리드 화에 필요한 때까지 두뇌는 -20 ° C에서 메탄올에 몇 달 동안 유지 될 수있다.
- 면역 조직 화학에 대한 조직의 준비
- 2 ㎖ 플라스틱 튜브에 내림차순 메탄올 시리즈 (순차적으로 75 % 할인, 메탄올 (1X PBS, 0.1 % 트윈 20 = PTW)을 통해 두뇌를 재수;. 50 % 메탄올, 25 % 메탄올은 두뇌 (15 두뇌 / 2 ㎖ 반응 튜브를 품어 ) 각각의 용액에서 5 분.
- 5 분 PTW의 머리를 씻으십시오. 신선한 PTW와 배를 반복합니다.
- 단면의 두뇌의 삽입
- 삽입의 경우, 전송 피펫 (5 mm 직경)와 폴리에틸렌 성형 컵 트레이의 구멍에 PTW에 2 ㎖의 반응 관에서 뇌를 전송합니다.
- 삼각 플라스크에 1X PBS의 2 % 아가로 오스 (DNA 등급)을 준비합니다. 아가로 오스가 완전히 용해 될 때까지 600 W의 전자 렌지로 가열한다. 10 두뇌에 50 ㎖를 준비합니다. 하자 일전자 아가 로스 사용하기 전에 실온에서 3 분 동안 냉각. 미리 가열 된 블록 (60 ℃) 응고를 방지하기 위해 두뇌를 포함하는 동안의 아가로 오스를 유지합니다.
- 파스퇴르 피펫 (1 mm 직경)을 사용하여 하나의 뇌를 포함하는 몰드로부터 1X PBS를 제거한다. 뇌가 손상되지 않도록주의하십시오.
- 금형에 아가로 오스 붓고 완전히 채 웁니다. 그런 다음 쉽게 뇌를 포함하는 만드는 PTW를 씻어 아가로 오스의 머리를 소용돌이에 해부 바늘을 사용합니다.
- 동양 다운 형 복부 측면에있는 뇌, 최대 등의 측면과 똑바로 놓습니다.
- 아가로 오스가 식을 보자. 빠른 냉각을 위해, 얼음 형을 배치합니다. 단계를 반복합니다.
- 모든 두뇌를위한 2.3.3-2.3.6를 반복합니다.
- 아가로 오스 블록의 트리밍
- 해부 바늘을 사용하여, 아가로 오스 블록 튀어.
- 날카로운 면도날로, 뇌의 뒤쪽 끝에서 아가로 오스를 잘라. 확인이 비행기는 테에 평행합니다lencephalon.
- 뇌의 앞쪽 끝에서 아가로 오스를 잘라. 는 후방 평면에 서 있도록 다음 블록을 플립.
- 두뇌의 지느러미와 복부 측면에 평행하게 절단하여 아가로 오스의 초과를 제거합니다. 그것의 복부 측면에 위치하도록 다시 머리를 플립.
- telencephalon가 작은면에 위치한 잘린 삼각형 (그림 2)에 블록을 잘라.
- 단면의 Vibratome 준비
- 제조업체의 지침에 따라 vibratome를 준비합니다. 새 면도날을 사용하여 10 두뇌 후 교체하십시오.
- 다만 블레이드의 하단에 도달 수준에 1X PBS와 버퍼 목욕을 입력합니다.
- vibratome의 표본 디스크의 상단에 순간 접착제의 작은 점을 놓습니다.
- 조심스럽게 순간 접착제의 뇌 후방에 위치한 평면을 배치합니다. 그것이 1X PBS에 접촉 상태로 접착제 자마자 굳어 것vibratome 버퍼 목욕.
- 마이크로톰의 조작을 사용하여 버퍼 트레이에 표본과 표본 디스크를 삽입합니다.
- 원하는 위치에 시편 디스크를 회전 매니퓰레이터를 사용한다. 블레이드에 직면 뇌의 등쪽 부분, 표면 바로 아래에 telencephalon의 위치를하는 방식으로 버퍼 목욕 블록의 방향을. 그런 다음 3mm 육각 렌치로 SCRW을 강화하고 조작을 제거합니다. 주 : 클램핑 스크류 또는 클램핑 장치 중 하나는 표본 디스크의 갭 위에 위치 될 안된다; 이 위치에서 시료 디스크를 체결 할 수 없습니다.
- 뇌를 단면
- 섹션을 수집하는 24 웰 플레이트를 준비합니다. 절편하는 뇌 당 차단 완충액 1 ㎖ (0.1 % (잘 하나를 기입 V / v) 10 % 트윈 -20, 0.2 % (w / v) 소 혈청 알부민 (BSA), 1 % (v / v) PBS에서 디메틸 술폭 시드 (DMSO)).
- 50 ㎛ 두께 1mm / 초의 속도 및 70 Hz에서의 주파수 구획에서 시작진동 마이크로톰을 사용하여.
- 그들이 칼날을 벗겨 24 웰 플레이트에서 그들을 수집으로 아가로 오스의 얇은 조각을 데리러 합성 브러쉬 (1 mm)를 사용합니다.
- Vibratome 섹션에 대한 면역 조직 화학
- 버퍼 (0.1 % (V / V) 10 % 트윈 20, 0.2 % (PBS에 W / V) BSA, 1 % (V / V) DMSO를) 차단에 실온에서 1 시간 동안 비 특정 바인딩 사이트를 차단합니다.
- 뜨는을 제거하고 4 ℃에서 하룻밤 버퍼를 차단에 희석 항체의 250 μl를 추가 대안 적으로, RT에서 2 시간 동안 일차 항체를 배양한다. 그런 PTW에서 10 분 동안 3 회 세척한다. 참고 : PCNA 염색은 1:400 희석 사용하십시오 (마우스 항-PCNA 자세한 사항은 물질의 표를 참조하십시오.). 다수의 일차 항체는 동시에 배양 할 수있다.
- 실온에서 2 시간 동안 차 항체의 섹션을 품어 다음 PTW에서 10 분 동안 3 회 세척한다. 참고 : PTW의 1:1,000 희석, 세부 자료의 표를 참조하십시오. 다수의 이차 항체는 동시에 배양 할 수있다.
- (또는 면역 조직 화학 염색에) 현장 하이브리드 화에서 성인 뇌 RNA
- 뇌 해부 및 고정 (면역 조직 화학 염색을 위해 같은 절차) :
- 프로브의 하이브리드.
- 면역 조직 화학 기술 한 바와 같이 2 ㎖ 반응 튜브에서 뇌를 재수.
- 30 분 동안 PTW에, 단백질 분해 효소 K (10 ㎍ / ㎖의 최종 농. ProtK)의 머리를 품어. 배양 시간 후 ProtK / PTW를 제거하고 BT-수정에서 20 분 동안 다시 머리를 고정 (4 % PFA, 4 %의 자당, 0.12 mM의 염화칼슘, 77 mM의 나 2 HPO 4, 23 밀리미터의 NaH 2 PO 4).
- PTW의 5 분 (0.1 % (V / V) 트윈-20 PBS의)에 대한 뇌에게 배를 씻으십시오.
- PTW를 제거하고 500 μL의 머리를 씻어HYB 버퍼 (50 % (V / V) 탈 포름 아미드, 배 SSC, 500 ㎍ / ㎖의 효모의 tRNA, 50 ㎍ / ㎖의 헤파린, 0.1 % 트윈 20, 9 MM은 citricacid). 뇌가 다음 상층 액을 버리고 깨끗한 HYB 버퍼 500 μl를 추가하고 3 ~ 4 시간 동안 65 ~ 70 ℃에서 배양 튜브의 바닥에 가라 앉을 때까지 기다립니다.
- HYB 버퍼 400 ㎕의 최종 부피 (프로브에 따라 다름) 1:200 또는 1:400, RNA 프로브를 희석. 5 분 동안 70 ° C에서 희석 된 RNA 프로브를 가열한다.
- 두뇌에서 뜨는을 제거하고 RNA 프로브를 추가, 65 ~ 70 °의 C (O / N)에 품어. 모든 세척 완충 용액은 70 ℃에서 예비 가온 및 유지되어야한다
- 레이블
- 30 분 동안 두 번 세척 버퍼 1의 500 μL (50 % 포름 아미드, 1X SSC, 0.05 % 트윈 20)과 (4 세척 단계 중) 65 ~ 70 ° C에서 머리를 씻으십시오. 버퍼 2 (2X SSC, 0.1 % 트윈 20)로 버퍼를 교체하고, 15 분 동안 품어. 버퍼 2를 제거하고 fo를 버퍼 3 (0.2 배의 SSC, 0.1 % 트윈 20)의 머리를 씻어30 분 R, 두 번이 2 단계를 반복합니다. 버퍼 4 (0.1X의 SSC, PTW 0.05 % 트윈 20)에 의해 버퍼 교체 3, 5 분 동안 품어.
- 상층 액을 제거하고 실온에서 PTW 500 μL에서 5 분 동안 세척한다.
- (1X PBS에) 2 % 아가로 오스 두뇌를 포함하고 면역 조직 화학 염색에 대한 설명으로 vibratome 섹션 (50 ~ 100 μm의) 절단.
- 버퍼 (1X PBS, 0.1 % 트윈 20, 0.2 % (W / V) BSA, 1 % (V / V) DMSO)를 차단하고 500 μL에서 5 분 동안 세척 1X.
- 상층 액을 제거하고 실온에서 2 시간 동안 차단 버퍼 500 μl를 추가합니다.
- 상층 액을 제거하고 안티 파 AP-결합 항체 버퍼를 차단에 1:4,000 희석 300 μl를 추가합니다.
- 4 ° C에서 O / N을 품어
- NBT / BCIP 염색
- RT에서 PTW 버퍼와 15 분 동안 배를 씻으십시오.
- 염색 버퍼에 1X를 씻어. 염색 버퍼에 두 번 5 분 (100 MM 트리스 / 염산의 pH 9.5, 50 mM의 MgCl2를, 100 ㎜의 NaCl, 0.1 % 트윈 20)을 씻으십시오.
- 500 μ에 뜨는 및 얼룩을 제거L 염색 용액 (7.0 4 Nitroblue-테트라 졸륨 클로라이드 (NBT)의 μL 및 염색 완충액 1 ㎖ 당 5 - 브로 모 -4 - 클로로 -3 - 인돌 일 포스페이트 (BCIP)).
- PTW와 5 배 3 배를 세척하여 염색 중지합니다.
- 뇌 해부 및 고정 (면역 조직 화학 염색을 위해 같은 절차) :
- 섹션의 설치
- (자료 표 참조) 수용성, 비 형광 설치 매체를 사용하여 슬라이드에 섹션을 탑재합니다.
- 4 ℃에서 냉장고에 슬라이드를 유지 참고 : 염색도 몇 주 또는 몇 달 동안 안정되어있다.
- 화합물 또는 공 초점 현미경 슬라이드를 분석합니다.
Representative Results
이 문서에서 설명하는 워크 플로우를 사용하여, 병변은 성인 제브라 피쉬의 telencephalon (그림 1A-1B)의 오른쪽 반구에 소개되었다. 올바른 남긴 상처는 telencephalon (그림 3C)의 전체 제복을 통해 복부에 지느러미에서 확장 병변 운하로 연결됩니다. 병변은 반구 중 하나에 제한되어야하고, 중간 뇌실을 통과하지해야합니다. 병변 운하 밝은 필드 현미경 (그림 3C)와 함께 볼 수 있으며 약 35 일에서 15 후 치유됩니다.
3 ~ 7 DPL에와 S100β (그림 3B) 면역 조직 화학 염색 (15)에 의해 감지이며, 그것은 이전에 세포 핵 항원 (그림 3A PCNA를) 확산의 최대 규제 부상 후 것으로 나타났다. PCNA와 S100β의 염색은 레이디 얼 glial 세포의 증식을 나타내는 중복입니다.
에프물고기 24 urthermore, 희소 돌기 아교 세포 전구 세포 (개 OPC)를 시각화하기 위해, 찔린 상처의 분석은 Tg는 (EGFP olig2)에서 수행 하였다. 안티 GFP 항체로 염색 후, 병변 운하 가까이에있는 OPC를 축적 (그림 3D) 검출입니다. 이 축적은 일시적이며, OPC 클러스터는 35 DPL 15에서 더 이상 관찰되지 않습니다.
병변이 제대로 도입되지 않은 경우, 병변 운하는 볼 수 없습니다, 최대 규제 PCNA와 S100β 또는 OPC를 축적 검출되지 않습니다. PCNA는 뇌 손상의 가장 민감한 마커입니다. 찔린 상처의 효율성을 확인하고 두 반구가 상처를 입은 것을 제외 위해서는 강력 항상 안티 PCNA 항체 부분을 염색하는 것이 좋습니다. 제대로 도입 병변에서 PCNA 크게해야한다 위로 통제 단 하나의 반구의에 (최대 15를 4 배). 대부분의 경우에 비록단지 유전자 발현의 변화를 모니터링 할 수있는 내부 통제로 반대측 unlesioned면을 사용하기에 충분한, 그것은 매우 야생형 두뇌의 telencephalic 반구의 식으로 제어 반구의 유전자 발현을 비교하는 것이 좋습니다. 이러한 방식으로, 두 반구에 영향을 미치는 유전자 발현에 병변의 전신적 효과를 검출 할 수있다.
찌르기는 체계적인 전사 조절기 (거래 정보 저장소)의 식 스크린과 결합 분석을 권취 (25 및 슈미트 외., 미공개) 또한 신경 및 재생 (도 4A-4C)의 가능한 역할과 TR의 유전자를 확인하는데 사용될 수있다.
이 방법은 telencephalon로 표현하고 그 표현 부상 (그림 4A-C)에 대한 응답으로 상향 조절 구체적이다하는 요인을 확인했습니다.
그림 2. S트리밍 된 아가로 오스 블록의 성인 제브라 피쉬의 뇌의 chematic 표현은 바로 앞에 vibratome 절편. 앞쪽에가있다. 후각 망울 (OB), telencephalon (전화), 광학 tectum (OT), 소뇌 (CB)와 수질 (M). 스케일 바 : 500 μm의.
그림 3. 상처 부상을 찔러 회생 응답. 오일에서 AD) 성인 제브라 피쉬의 뇌는 자상 남긴 상처에 심실 영역 (화살표)에서 상향 조절 (DPL). AB) 증식 마커 PCNA (A)와 반경 아교 세포 마커 S100β (B)가 있습니다 병변을 게시 할 수 있습니다. (C) 병변 채널은 시야 조명 (화살표)에서 볼 수 있습니다. 심실 영역은 녹색 선으로 표시됩니다. (D) 희소 돌기 아교 세포 전구 세포 (olig2 : EGFP +))은 병변 (화살표의 사이트에 축적된다. 스케일 바 : 200 μm의. 모든 패널에서 오른쪽 반구는 병변을 반구입니다. 등의 업입니다. D에있는 점선은 제복과 subpallium 사이의 경계를 나타냅니다.
모니터로 그림 4. 부상을 찔러에 대한 응답으로 상향 조절 유전자의 예. eomesa 오른쪽 telencephalic 반구 (A, B) 및 sox4a (C) mRNA의 발현 (찔렀다 반구)의 강한 상향 조정 (화살표)를 참고 5 DPL에서 현장 하이브리드 화에 의한. 왼쪽 반구는 손상되지 않은 것입니다 및 제어 역할을합니다. (B)는 A. 지느러미의 지느러미 telencephalic 영역의 높은 배율이 다 보여줍니다. 스케일 바 : A와 C 200 μm의 B. 55 μm의A와 C의 점선은 pallium과 subpallium 사이의 거리를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 약어 | |
| AP | 알칼리 포스 파타 아제 |
| BCIP | 5 - 브로 모-4-클로로-3'-indolyphosphate |
| BSA | 소 혈청 알부민 |
| CNS | 중추 신경계 |
| 파 | Digoxygenin |
| DMSO | 디메틸 설폭 사이드 |
| DPL | 일 포스트 병변 |
| eomesa | Eomesodermin 상동의 |
| GFAP | 아교 섬유 성 산성 단백질 |
| 시간 | 시간 |
| HYB완충기 | 하이브리드 버퍼 |
| ISH | 현장 하이브리드에 |
| 메탄올 | 메탄올 |
| NBT | 니트로 블루 테트라 졸리움 |
| OPC를 | 희소 돌기 아교 세포 전구 세포 |
| PBS | 인산염 완충 식염수 |
| PCNA | 세포 핵 항원 증식 |
| PFA | 파라 포름 알데히드 |
| ProtK | 테 K |
| PSA-NCAM | Polysialylated 신경 세포 부착 분자 |
| PTW | PBS, 0.1 % 트윈 -20 |
| RNA | 리보 핵산 |
| RT | 실내 온도 |
| SGZ | Subgranular 영역 |
| sox4a | 유전자 4A를 포함하는 SRY 박스 |
| SSC | 식염수 시트르산 나트륨 |
| SVZ | Subventricular 영역 |
| 거래 정보 저장소 | 전사 조절기 |
Discussion
우리는 여기에서 성인 제브라 피쉬의 두개골을 통해 바늘을 밀어 telencephalic 부상을 유도하고, 면역 조직 화학 염색 및 현장 하이브리드이 부상으로 세포 및 분자 반응을 분석하는 방법을 설명합니다. 다른 기존의 방식을 통해이 기술의 주요 장점은 단순성, 속도 및 비용 효율성이다. 따라서, 단시간에 많은 뇌 손상의 생산을 허용이 기술은 쉽게 재생 및 신경의 역할 유전자를 식별 반응계 혼성화 화면 대규모와 결합 될 수있다.
부상이 수행되는 성인 지브라 피쉬의 나이가 매우 중요하다. 물고기가 1.5 년보다 오래된 경우, 두개골 너무 열심히이며 두개골 아래로 밀거나 깨끗하게 천공보다는 골절되는 것이 가능하다. 어린 물고기 (미만 4 개월)에 대비,에서, 계속 신경을 많이 레아 있지 않을까합니다신경 반응에 대한 거짓 긍정적 인 결과에 D.
이 방법의 또 다른 중요한 단계는 찔린 상처의 효율성을 확인하고 두 반구가 부상하는 것을 제외하는 것입니다. 이는 항-PCNA 항체 부분을 염색하여 모니터링 할 수있다. 제대로 도입 병변에서, PCNA는 반구의 한 규제까지 - 크게해야한다.
그것은 유도 기계적인 손상 등이 아닌 특정 세포 제거, 때문에 차 변성, 염증과 혈액 - 뇌 장벽의 파괴의 증가 세포 죽음, 심실 영역의 손상 등과 같은 여러 가지 부작용이있을 것이라는 점을 명심하는 것이 중요하다 뇌 실질에 뇌척수액의 가능한 결과의 흐름. 그러나, 부상당한 물고기는 부상에서 약간의 고통을 나타납니다. 2 분 이내에 그들은 다시 자유 수영 및 일반 공급 동작은 약 4 시간 내에 복원됩니다. 후 3 주 전njury 더 이상 형태 학적으로 볼 수 없습니다. 우리 손에서 수백 수술에서 우리는 포스트 병변 오일에서 조직 학적으로 평가로 우리는 100 %의 재해율을했다 사실에도 불구하고 하나의 물고기를 잃지 않았다.
최근 몇 년 동안 이러한 형질 전환 방법과 같은 다른 기술이 조직 또는 세포 유형이 특정 절제를 생성 지브라 피쉬 개발되었다. 이러한 기술은 매우 우아하고 최소 침습하지만 그들은 복잡한 DNA 구조의 생성 및 소비 매우 지루하고 시간이 될 수있는 몇 가지 안정 제브라 피쉬의 유전자 변형 라인의 설립을 기반으로합니다. 따라서,이 프로토콜에 설명 된 분석과 같은 간단한 기계적인 접근은 성인 뇌의 신경 및 재생을 연구하는 중요한 도구가 남아있다.
Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine | Sigma | 335.2 | |
| 10x DPBS (-/-) | Life technologies | 14200-083 | |
| 30 G syringe (Omnican 40) | B.Braun Melsungen | 916162 | |
| Polyethylene molding cup tray | Polysciences, Inc | 17177C-3 | |
| PeqGOLD Universal Agarose | Peqlab | 35-1020 | |
| Bovine serum albumin | Biochrom | W 2835919108 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences, Inc | 18606-20 | |
| Tween 20 | Carl Roth | 9127.1 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
| Dissection needle | Carl Roth | KX93.1 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.2 | |
| Loctite 414 | Schöffler und Wörner | 06 1362 0020 | |
| Glass slides | Labonord | 5305103 | |
| Cover slips 24 x 60 mm | Labonord | 5305060 | |
| Petri dishes, 94 mm | Greiner bio-one | 632180 | |
| Falcon tubes, 15 ml | Greiner bio-one | 188261 | |
| 24-well plate | Greiner bio-one | 662160 | |
| Anti-S100 (1:500) | Dako | Z031101-2 | |
| Anti-PCNA (1:400) | Dako | M087901 | |
| Anti-GFP (1:1,000) | Aves Labs | GFP-1020 | |
| anti-Dig AP-coupled antibody | Roche Diagnostics | 11093274910 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Roche Diagnostics | 1383221 | |
| 4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Roche Diagnostics | 1383213 | |
| Proteinase K | Roche Diagnostics | 1092766 | |
| Polyethylene molding cup tray | Polysciences | 17177C-3 | |
| Vibratome VT1000S | Leica | ||
| Confocal microscope Sp5 DM6000 | Leica | ||
| Dissecting microscope Nikon SMZ 645 | Nikon | ||
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon catalog | 353226 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Danio rerio Tg(olig2:EGFP) | Shin et al.24 | ||
| Danio rerio WT strains (e.g., AB2O2) |
References
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72, 429-461 (2012).
- Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis. Nat Rev Neurosci. 12, 88-104 (2011).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32, 638-647 (2009).
- Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Dev. 8, 3 (2013).
- Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the central nervous system of teleost fish. Eur J Neurosci. 34, 917-929 (2011).
- Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. Teleost fish as a model system to study successful regeneration of the central nervous system. Curr Top Microbiol Immunol. 367, 193-233 (2013).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295, 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Dev Biol. 295, 263-277 (2006).
- Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain. J Comp Neurol. 488, 290-319 (2005).
- Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29, 745-757 (2007).
- Hinsch, K., Zupanc, G. K. Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis. Neuroscience. 146, 679-696 (2007).
- Lindsey, B. W., Darabie, A., Tropepe, V. The cellular composition of neurogenic periventricular zones in the adult zebrafish forebrain. J Comp Neurol. 520, 2275-2316 (2012).
- Marz, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58, 870-888 (2010).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240, 2221-2231 (2011).
- Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223, 131-147 (2013).
- Ayari, B., El Hachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon. J Neurotrauma. 27, 959-972 (2010).
- Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis. Glia. 60, 343-357 (2011).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Dis Model Mech. 5, 200-209 (2012).
- Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Dev Cell. 23, 1230-1237 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138, 4831-4841 (2011).
- Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338, 1353-1356 (2012).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Shin, J., Park, H. C., Topczewska, J. M., Mawdsley, D. J., Appel, B. Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics. Methods Cell Sci. 25, 7-14 (2003).
- Armant, O., et al. Genome-wide, whole mount in situ analysis of transcriptional regulators in zebrafish embryos. Dev Biol. 380, 351-362 (2013).
