Abstract
Erwachsene Zebrafisch haben eine erstaunliche Fähigkeit, ihre zentralen Nervensystems nach Verletzungen zu regenerieren. Um die zelluläre Antwort und die molekularen Mechanismen im Zebrafisch erwachsenen Zentralnervensystem (ZNS), Regeneration und Reparatur zu erforschen, entwickelten wir eine Zebrafisch-Modell der Erwachsenen telencephalic Verletzung.
In diesem Ansatz haben wir eine Verletzung manuell durch Drücken eines Insulin-Spritzennadel in die erwachsenen Zebrafisch Telen generieren. An verschiedenen Tagen nach der Verletzung werden die Fische getötet, ihre Gehirne werden herausgeschnitten und durch Immunhistochemie und / oder in-situ-Hybridisierung (ISH) mit entsprechenden Markierungen, um die Zellproliferation, Gliogenese und Neurogenese zu beobachten gefärbt. Die unverletzten kontralateralen Hemisphäre dient als interne Kontrolle. Diese Methode kombiniert zum Beispiel mit RNA-Sequenzierung kann tief Bildschirm für neue Gene, die mit einer Rolle in Zebrafisch-Neurogenese Telen Erwachsenen, Regeneration und Reparatur zu helfen.
Introduction
Säugetiere haben eine sehr begrenzte Fähigkeit, neue Neuronen im Erwachsenenalter zu erzeugen, und adulte Neurogenese im Gehirn ist vor allem auf zwei Bereiche an der telencephalic Subventrikularzone (SVZ) der lateralen Ventrikel gelegen eingeschränkt, und die Subgranularzone (SGZ) des Gyrus Gyrus im Hippocampus ein. Säugetiere können auch nicht für Schäden des Gehirns durch neurodegenerative Erkrankungen, Schlaganfall oder Verletzungen zu reparieren, effizient. Verloren Neuronen nicht ersetzt und statt Proliferation von verschiedenen Arten von Gliazellen, einschließlich Astrozyten, Mikroglia und Oligodendrozyten, beobachtet. Als Folge dieser proliferativen Prozess namens reaktive Gliose ist die verletzten Gehirngewebe durch die Bildung einer glialen Narbe, die neuronale und axonale Regeneration 2-4 hemmt abgedichtet.
Im Gegensatz zu Säugetieren, Knochenfischen wie dem Zebrafisch reichlich bilden neue Nervenzellen im adulten Stadien und haben eine hohe regenerative und proliferative Potenzial, Läsionen des Zentralnervensystems 2,5-7 reparieren. Der Zebrafisch erwachsene Gehirn enthält 16 verschiedene neuronale Stammzellnischen, die eine große Anzahl von neuen Nervenzellen während der gesamten Lebensdauer 8-11 generieren. Neuronen in diesen spezifischen Proliferationszonen des erwachsenen Zebrafischgehirn geboren migrieren, um ihre Zielgebiete, wo sie reifen und in die bestehenden neuronalen Netzwerken 8,10,12-15 integrieren.
Unter den in erwachsenen Zebrafisch identifiziert Vorläuferzonen ist die telencephalic ventrikulären Zone eine der am besten untersuchten neuronalen Stammzellnischen. Die Zellen in dieser Vorläufer Nische kann in drei verschiedene Arten in Bezug auf ihre Morphologie, Teilungsrate und die Expression von verschiedenen Gliazellen oder neuronalen Marker klassifiziert werden. Typ I und Typ II-Zellen sind radiale Gliazellen, wie Zellen, die lange Prozesse haben. Sie drücken Stammzellen Marker einschließlich GFAP, Nestin und S100β. Typ-I-Zellen nicht vermehren, während Typ II-Zellen proliferate langsam, wie durch die Expression des Proliferationsmarker wie proliferierenden Zellkernantigen (PCNA) und den Einbau von Desoxythymidin Analoga nachgewiesen. Die Typ-III-Zellen sind schnell teilenden Zellen, die sich verpflichtet haben, neuralen Vorläuferzellen zu werden und Express neuronalen Marker-Gene, wie PSA-NCAM 5,16.
Obwohl die Regenerationsfähigkeit von Knochenfischen gut dokumentiert sind, sind nur wenige Veröffentlichungen ausführlich beschrieben und untersucht die zellulären und molekularen Mechanismen der neuronalen Regeneration in der erwachsenen Telen in Reaktion auf eine Verletzung beteiligt 15,17-22. Um die Mechanismen im Zebrafisch erwachsenen Zentralnervensystem die Regeneration und Reparatur gebracht entschlüsseln und die Gemeinsamkeiten und die Unterschiede zwischen konstitutiven und regenerative Neurogenese zu verstehen, entwickelten wir eine Zebrafisch-Modell der Erwachsenen telencephalic Verletzung. Hier werden wir visuell zu beschreiben, wie man eine Verletzung in einem der telencephalic hemisph erzeugeneRest mit Hilfe einer Spritze und Nadel, während die unverletzten kontralateralen Seite als interne Kontrolle. Wir werden auch zeigen, wie Änderungen bei der Verletzung bei der Zellproliferation und die Genexpression durch Immunhistochemie und In-situ-Hybridisierungstests überwachen.
Protocol
Zebrafische wurden in der Fischanlage des Instituts für Toxikologie und Genetik (ITG) am Karlsruher Institut für Technologie (KIT) gehalten. Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den deutschen Tierschutzstandards durchgeführt und wurden von der Regierung von Baden-Württemberg, Regierungspräsidium Karlsruhe, Deutschland (Aktenzeichen 35-9185.81/G-272/12 "Adulte Neurogenese") zugelassen.
1. Generieren eine Stichwunde in der Telen
- Anästhesie
- Um eine Stammlösung von Tricaine (3-Amino benzoesäureethylester, auch als Ethyl-3-Aminobenzoesäure) vorzubereiten verwenden 400 mg Tricaine Pulver und löst ihn in 97,9 ml Wasser und 2,1 ml 1 M Tris / HCl-Puffer (pH 9). PH-Wert auf 7. Machen 5 ml Aliquots und speichern sie bei -20 ° C bis zur Verwendung.
- Bringen Sie eine entsprechende Anzahl von 0,5-1 Jahre alten Zebrafisch aus ihren Panzern in Kunststoffmäusekäfige. Hinweis: Der Schädel eines erwachsenen Zebrafisch bei etwa 12Monate alt ist noch relativ weich und kann leicht mit einer Nadel perforiert werden (siehe Abschnitt 1.2.3 und Abbildung 1A).
- Um die erwachsenen Zebrafisch zu betäuben, zu kombinieren Tricaine 5 ml (Stammlösung) in einem Kunststoffübergang Käfig mit ~ 100 ml Wasser sauber Aquarium (Endkonzentration Tricaine 0,02% (w / v) Tricaine).
- Inkubieren Sie die Fische in den Anästhetika, bis sie sich nicht mehr bewegen (45-60 s).
- Telen Injury
- Platz betäubt einzelnen Zebrafisch in einen Schlitz in einem Block von Tricaine getränkten Schaumstoff.
- Unter einem Binokular mit Licht von oben halten den Fisch vorsichtig mit einer Hand und orientieren sie in einer Weise, die den Zugriff auf den Kopf von oben ermöglicht.
- Mit der anderen Hand drücken eine 30 G-Spritze (Insulinspritze mit integrierter Nadel) senkrecht durch den Schädel in den medialen Bereich einer telencephalic Hemisphäre (Fig. 1A-1B). Die Hemisphären des Telen einwieder durch den Schädel sichtbar. Stellen Sie sicher, dass die eingebrachte Läsion ist nicht tiefer als 2 mm (Abbildung 1C). Hinweis: Es wird dringend empfohlen, um die Läsion immer in die gleiche Hemisphäre einzuführen, um die Identifikation der Ort der Läsion, wenn das Gehirn sezieren aus dem Schädel zu erleichtern.
- Nach dem Einbringen der telencephalic Verletzungen, legen Sie den Fisch in Fischwasser. Halten Sie bis zu 10 Fische in einem 2 L Mäusekäfig mit Fisch Wasser für die Wiederherstellung gefüllt und schließen Sie die Maus Käfig zu einer Wasserflusssystem. Anmerkung: Die Überlebensrate ist in der Regel ~ 97%, wenn Fisch gesund sind und keine weiteren Versuche wurden mit dem Fisch vor geführt. Zugabe von Antibiotika zum Fisch Wasser ist nicht erforderlich. Nach der Wiederherstellung, Fisch normalerweise verhalten: sie schwimmen, Futtermittel und Kumpel.
2. Analyse der Wirkung von telencephalic Injury
- Gehirn-Dissection und Fixation
- Re-betäuben die wiederhergestellte Fisch zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Läsion (typically, 1, 3, 5, und 14 Tage nach Läsion (DPL)) mit 0,02% (w / v) Tricaine wie oben beschrieben und sie einschläfern, indem sie in Eiswasser für 5 min.
- Legen Sie den Fisch auf einem Papiertuch in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) eingeweicht und trennen den Kopf vom Körper, indem hinter die Kiemen mit einer scharfen Schere.
- Halten Sie die Köpfe in 1x PBS für 5 Minuten, um die Blutung zu ermöglichen. Anmerkung: Diese entwässert Blut aus dem Gewebe, das die weiteren Schritte in dem Protokoll stören kann.
- Beheben die Köpfe über Nacht bei 4 ° C in 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS oder 4 Stunden bei Raumtemperatur (RT).
- Zweimal waschen feste Köpfe mit 1x PBS in einer Petrischale.
- Gehirn sezieren vorsichtig in 1x PBS unter einem Binokular 23. Die Läsion ist in der Regel unter dem Binokular sichtbar. Brains ohne sichtbare Läsion muss verworfen werden.
- Übertragen Gehirn in 2 ml Reaktionsgefäße mit 1,5 ml 100% Methanol gefüllt (MeOH) und 5x vor Inkubation invertieren die Rohrebei -20 ° C für mindestens 16 Stunden. Hinweis: Das Gehirn kann mehrere Monate in MeOH bei -20 ° C aufbewahrt, bis sie für die Immunhistochemie und in-situ-Hybridisierung benötigt.
- Gewebepräparation für die Immunhistochemie
- Rehydrate die Gehirne durch einen absteigenden Methanol-Serie in 2-ml-Plastikröhrchen (sequenziell 75% MeOH (1x PBS, 0,1% Tween-20 = PTW);. 50% MeOH, 25% MeOH inkubieren die Gehirne (15 Gehirne / 2 ml Reaktionsgefäße ) für 5 Minuten in jeder Lösung.
- Waschen Sie die Gehirne in PTW für 5 min. Wiederholen 4x mit frischen PTW.
- Die Einbettung der Gehirne für Sectioning
- Zur Einbettung, übertragen Sie die Gehirne von 2 ml Reaktionsgefäß in PTW in die Hohlräume eines Polyethylen-Formtassenablage mit einer Transferpipette (5 mm Durchmesser).
- Bereiten Sie 2% igen (DNA grade) in 1x PBS in einem Erlenmeyerkolben. Wärme in der Mikrowelle bei 600 W bis die Agarose vollständig gelöst ist. Bereiten Sie 50 ml für 10 Gehirne. Lassen thE Agarose abkühlen für 3 min bei Raumtemperatur vor Gebrauch. Halten der Agarose auf einem vorgewärmten Wärmeblock (60 ° C), während die Einbettung der Köpfe, um die Verfestigung zu verhindern.
- Entfernen des 1x PBS aus der Form, die ein Gehirn unter Verwendung einer Pasteur-Pipette (1 mm Durchmesser). Achten Sie darauf, um das Gehirn zu schädigen.
- Gießen Agarose in die Form und füllen Sie es vollständig. Dann mit einem Dissektion Nadel, um das Gehirn in der Agarose wirbeln zu waschen den PTW macht es einfacher, das Gehirn zu verankern.
- Orient das Gehirn in der Form Bauchseite nach unten, Rückenseite und legen Sie sie gerade.
- Lassen Sie die Agarose abkühlen. Für schnellere Abkühlung, legen Sie die Form auf dem Eis. Wiederholen Sie die Schritte.
- Wiederholen 2.3.3-2.3.6 für alle Gehirne.
- Trimmen der Agarose-Block
- Mit einer Dissektion Nadel, Pop aus der Agarose-Block.
- Mit einer scharfen Rasierklinge, schneiden Sie die Agarose am hinteren Ende des Gehirns. Stellen Sie sicher, dass diese Ebene parallel zu der te istlencephalon.
- Schneiden die Agarose am vorderen Ende des Gehirns. Dann drehen Sie den Block, so dass er auf der hinteren Ebene.
- Entfernen Sie den Überschuss der Agarose durch Schneiden parallel zu Rücken des Gehirns und ventralen Seiten. Dann drehen Sie das Gehirn zurück, so dass es auf seiner Bauchseite liegt.
- Schneiden des Blocks an einer abgeschnittenen Dreiecks, in dem das Telencephalon ist am kleineren Ebene (Fig. 2).
- Vorbereiten des Vibratom zum Schneiden
- Vorbereitung der Vibratom nach den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie eine neue Rasierklinge und ersetzen Sie es nach 10 Gehirne.
- Auffüllen des Puffer Bad mit 1x PBS auf ein Niveau, das gerade den Boden der Schaufel erreicht.
- Setzen Sie einen kleinen Punkt Sekundenkleber auf der Oberseite des Probenteller des Vibratom.
- Legen Sie das Flugzeug, das hinter dem Gehirn auf der Sekundenkleber befindet. Der Klebstoff wird so schnell härten, wie es in Kontakt mit dem in 1x PBS istdie Vibratom Puffer-Bad.
- Legen Sie die Objektplatte mit der Probe in die Pufferwanne mit dem Manipulator des Mikrotoms.
- Verwenden des Manipulators um die Objektplatte in die gewünschte Position zu drehen. Richten Sie den Block in der Puffer Bad in einer Weise, die das Telen knapp unter der Oberfläche lokalisiert, mit dem dorsalen Teil des Gehirns, mit Blick auf die Klinge. Ziehen Sie dann die scrw mit einem 3-mm-Inbusschlüssel und entfernen Sie den Manipulator. Hinweis: Die Klemmschraube oder eines der Klemmeinrichtungen nicht über die Lücke in der Probenscheibe befinden; in diesen Positionen die Spannobjektplatte ist nicht möglich.
- Schneiden des Gehirns
- Bereiten Sie eine 24-Well-Platte, um die Abschnitte zu sammeln. Pro Gehirn zu zerschneiden, zu füllen und einen mit 1 ml Blockierungspuffer (0,1% (v / v) 10% Tween-20, 0,2% (w / v) Rinderserumalbumin (BSA), 1% (v / v) Dimethylsulfoxid (DMSO) in PBS).
- Zu Beginn mit 50 &mgr; m Dicke, 1 mm / sec Geschwindigkeit und Frequenz 70 Hzmit einem Schwing Mikrotom.
- Verwenden Sie ein Synthetikpinsel (1 mm), holen die dünnen Scheiben aus Agarose, wie sie kommen aus der Klinge und sammeln sie in der 24-Well-Platte.
- Immunhistochemie auf Vibratom Abschnitte
- Blockieren nicht-spezifischer Bindungsstellen für 1 h bei Raumtemperatur in Blockierungspuffer (0,1% (v / v), 10% Tween 20, 0,2% (w / v) BSA, 1% (v / v) DMSO in PBS).
- Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 250 ul Antikörper in Blocking-Puffer über Nacht bei 4 ° C verdünnt Alternativ den primären Antikörper inkubiert für 2 h bei RT. Dann waschen 3x für 10 min in PTW. Hinweis: Für die PCNA-Färbung verwenden eine 1:400 Verdünnung (Maus-Anti-PCNA Details siehe Tabelle der Werkstoffe.). Mehrere primäre Antikörper gleichzeitig inkubiert werden.
- Inkubieren Sie die Abschnitte in sekundären Antikörpers für 2 h bei RT waschen dann 3x für 10 min in PTW. Hinweis: 1:1000 Verdünnung in PTW, für Details siehe Tabelle der Materialien. Mehrere sekundäre Antikörper gleichzeitig inkubiert werden.
- Erwachsenen Gehirn-RNA in situ Hybridisierung (alternativ Immunhistochemie)
- Gehirn-Dissection und Fixation (gleiche Verfahren wie für die Immunhistochemie):
- Die Hybridisierung der Sonde.
- Rehydrate Gehirne in 2 ml Reaktionsgefäße für die Immunhistochemie beschrieben.
- Gehirne in Proteinase K (. ProtK; 10 ug / ml Endkonzentration) inkubiert in PTW für 30 min. Nach der Inkubationszeit entfernen ProtK / PTW und fixieren die Gehirne wieder für 20 min im BT-Fix (4% PFA, 4% Saccharose, 0,12 mM CaCl 2, 77 mM Na 2 HPO 4, 23 mM NaH 2 PO 4).
- 5x waschen Gehirne für 5 min in PTW (0,1% (v / v) Tween-20 in PBS).
- PTW entfernen und spülen Sie die Gehirne in 500 ulHYB-Puffer (50% (V / V) entionisiertes Formamid, 5 × SSC, 500 ug / ml Hefe-tRNA, 50 ug / ml Heparin, 0,1% Tween-20, 9 mM Citronensäure). Warten Sie, bis Gehirn sinken auf den Boden des Röhrchens dann den Überstand verwerfen und fügen Sie 500 ul von sauberen HYB-Puffer und Inkubation bei 65-70 ° C für 3-4 Stunden.
- Verdünnt das RNA-Sonde bis 1:200 oder 1:400 (je nach Probe) in 400 &mgr; l Endvolumen von HYB-Puffer. Erhitzen Sie das verdünnte RNA-Sonde bei 70 ° C für 5 min.
- Überstand entfernen aus dem Gehirn und fügen Sie die RNA-Sonde, Inkubation bei 65-70 ° C (O / N). Sollten alle Waschpufferlösungen vorgewärmt und bei 70 ° C gehalten werden
- Labeling
- 30 min waschen die Gehirne bei 65-70 ° C (bei allen 4 Waschschritte) mit 500 &mgr; l Waschpuffer 1 (50% Formamid, 1 × SSC, 0,05% Tween 20) zweimal. Puffer 1 ersetzen durch Puffer 2 (2x SSC, 0,1% Tween 20), und die Proben für 15 min. Entfernen Puffer 2 und waschen Gehirne in Puffer 3 (0,2 x SSC, 0,1% Tween 20) for 30 Minuten, zweimal wiederholen Sie diesen Schritt zwei. Puffer 3 ersetzen durch Puffer 4 (0,1 x SSC, 0,05% Tween 20 in PTW), Inkubation für 5 min.
- Überstand entfernen und waschen für 5 min in 500 ul PTW bei RT.
- Embed Gehirn in 2% Agarose (in 1x PBS) und schneiden Vibratom Abschnitte (50-100 um) als für die Immunhistochemie beschrieben.
- Wasch 1x 5 min in 500 &mgr; l Blockierungspuffer (1 × PBS, 0,1% Tween-20, 0,2% (w / v) BSA, 1% (v / v) DMSO).
- Überstand entfernen und fügen 500 ul Blockierungspuffer für 2 h bei RT.
- Überstand entfernen und 300 ul Anti-Dig AP-gekoppelten Antikörper verdünnt 1:4000 in Blockierungspuffer.
- Inkubation o / n bei 4 ° C
- NBT / BCIP Färbung
- Für 15 min mit Puffer bei RT PTW 5x waschen.
- Spülen Sie 1x in Färbepuffer. Zweimal 5 min Färbung Puffer (100 mM Tris / HCl pH 9,5, 50 mM MgCl 2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20) gewaschen.
- Überstand entfernen und Fleck mit 500 μl Färbelösung (3,5 &mgr; l 4-Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT) und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat (BCIP) pro 1 ml Färbepuffer).
- Stoppen Färbung durch Spülen 3x mit PTW 5x.
- Gehirn-Dissection und Fixation (gleiche Verfahren wie für die Immunhistochemie):
- Montage der § §
- Montieren Sie die Abschnitte auf Objektträger mit einem wasserlöslichen, nicht-fluoreszierenden Montagemedium (siehe Materialien Tabelle).
- Folien bleiben im Kühlschrank bei 4 ° C Hinweis: Die Färbung ist für mehrere Wochen oder sogar Monate stabil.
- Analysieren Sie die Folien unter einer Verbindung oder konfokalen Mikroskop.
Representative Results
Unter Verwendung des in diesem Artikel beschriebenen Arbeitsablauf wurde eine Läsion in der rechten Hemisphäre eines erwachsenen Zebrafisch Telencephalon (Fig. 1A-1B) eingeführt. Eine korrekte Verwundung führt zu einer Läsion Kanal von Rücken erstreckt sich durch die ganze Pallium des Telen (3C) ventralen. Die Läsion sollte einer der Halbkugeln beschränkt werden und sollte nicht das mediale Herzkammer zu überqueren. Die Läsion Kanal ist mit Hellfeld-Mikroskopie (Abbildung 3C) sichtbar und wird nach ca. 35 Tage 15 geheilt werden.
Es wurde zuvor gezeigt, dass nach der Verwundung eine Hochregulierung von proliferierenden Zellkernantigen (PCNA, Fig. 3A) und S100β (3B) bei 3 bis 7 DPL 15 ist durch Immunhistochemie nachgewiesen werden. Die Färbung von PCNA und S100β Überschneidungen, was die Proliferation von radialen Gliazellen.
FFisch 24: angemeldete Marke, um Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) sichtbar zu machen, eine Stichwunde Assay wurde auf der Tg (EGFP Olig2) durchgeführt. Nach Färbung mit einem anti-GFP-Antikörper, ist die Anreicherung von OPCs in der Nähe der Läsion Kanal nachweisbar (Fig. 3D). Diese Anreicherung ist vergänglich, und OPC-Cluster werden nicht mehr bei 35 dpl 15 beobachtet.
Wenn die Läsion nicht richtig eingeführt, wird die Läsion Kanal nicht sichtbar sein, und die Hochregulierung von PCNA und S100β oder Ansammlung von OPCs nicht nachweisbar sein. PCNA ist der empfindlichste Marker für Hirnverletzung. Um die Effizienz der Stichwunde Akkreditierung und auszuschließen, dass die beiden Halbkugeln verwundet werden, wird dringend empfohlen, immer färben die Abschnitte mit einem Anti-PCNA-Antikörper. In einem korrekt eingeführt Läsion sollte deutlich sein PCNA hochreguliert (bis zu 4-fach 15) nur in einer der Halbkugeln. Obwohl in den meisten Fällen ist esausreichend, um als interne Kontrolle, um Veränderungen in der Genexpression überwachen verwenden nur die unverletzten kontralateralen Seite, ist es sehr empfehlenswert, die Genexpression in der Steuer Hemisphäre mit dem Ausdruck in telencephalic Hemisphären des Wildtyp-Gehirne zu vergleichen. Auf diese Weise können jegliche systemische Wirkungen der Läsion auf die Genexpression, die beide Hemisphären beeinflussen würde detektiert werden.
Die Stichwunde Assay in Kombination mit einem systematischen Ausdruck Bildschirm Transkriptionsregulatoren (TRS) (25 und Schmidt et al., Unveröffentlicht) kann auch verwendet werden, um Gene TR mit einer möglichen Rolle bei der Neurogenese und Regeneration (Fig. 4A-4C) zu identifizieren.
Dieser Ansatz hat eine Reihe von Faktoren, die in der Telen exprimiert werden und deren Expression spezifisch in Reaktion auf eine Verletzung (4A-C) hochreguliert identifiziert.
2. SChematic Darstellung eines erwachsenen Zebrafischgehirn in einem ausgeschnittenen Agarose-Block kurz vor Vibratoms Schneiden. Anterior ist oben. Riechkolben (ob), Telen (tel), Tectum opticum (ot), Kleinhirn (cb) und Mark (m). Maßstabsbalken: 500 um.
Abbildung 3. Regenerative Reaktionen auf Verletzungen Wunde stechen. AD) Adult Zebrafisch-Gehirns bei 5 Tage nach der Läsion (DPL). AB) Die proliferative Marker PCNA (A) und die radiale Gliazellen Marker S100β (B) sind in der ventrikulären Zone (Pfeile) auf Stich Verwundung hochreguliert. (C) Die Läsion Kanal ist unter Hellfeldbeleuchtung (Pfeile) sichtbar. Die ventrikuläre Zone wird durch die grüne Linie dargestellt. (D) Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (Olig2: EGFP +) sammeln sich an der Stelle der Läsion (Pfeile). Maßstabsbalken: 200 um. In allen Panels, ist die rechte Hemisphäre die lädierten Hemisphäre. Dorsal ist oben. Die gestrichelte Linie in A bis D bezeichnet die Grenze zwischen dem Pallium und der subpallium.
4. Ein Beispiel von Genen als Reaktion hochreguliert, um Verletzungen zu stechen. Beachte die starke Hochregulierung (Pfeile) eomesa (A, B) und sox4a (C)-mRNA-Expression in der rechten Hemisphäre telencephalic (gestochen Hemisphäre) als überwachte durch in situ-Hybridisierung bei 5 DPL. Die linke Hemisphäre ist unverletzt und dient als Kontrolle. (B) zeigt eine stärkere Vergrößerung des dorsalen telencephalic Region A. Rücken oben ist. Maßstabsbalken: 200 um für A und C und 55 um für B. Diegestrichelten Linie in A und C gibt den Abstand zwischen dem Pallium und der subpallium. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| ABKÜRZUNGEN | |
| AP | Alkalische Phosphatase |
| BCIP | 5-Brom-4-Chlor-3'-indolyphosphate |
| BSA | Rinderserumalbumin |
| CNS | Zentrales Nervensystem |
| Dig | Digoxygenin |
| DMSO | Dimethylsulfoxid |
| dpl | Tage nach der Läsion |
| eomesa | Eomesodermin Homolog ein |
| GFAP | Saures Gliafaserprotein |
| hr | Stunde |
| HYBPuffer | Hybridisierungspuffer |
| ISH | in-situ-Hybridisierung |
| MeOH | Methanol |
| NBT | Nitro-Blau-Tetrazolium |
| OPCs | Oligodendrozyten-Vorläuferzellen |
| PBS | Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung |
| PCNA | Proliferierende cell nuclear antigen |
| PFA | Para |
| ProtK | Proteinase K |
| PSA-NCAM | Polysialyliert neuronales Zelladhäsionsmolekül |
| PTW | PBS, 0,1% Tween-20 |
| RNA | Ribonukleinsäure |
| RT | Zimmertemperatur |
| SGZ | Subgranularzone |
| sox4a | SRY-Box mit Gen 4a |
| SSC | Saline-Natriumcitrat |
| SVZ | Subventrikularzone |
| TRs | Transkriptionsregulatoren |
Discussion
Wir beschreiben hier eine Methode, um eine telencephalic Verletzungen, indem eine Nadel durch den Schädel des erwachsenen Zebrafisch zu induzieren, und die zellulären und molekularen Reaktion auf diese Verletzung durch Immunhistochemie und In-situ-Hybridisierung zu analysieren. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens gegenüber anderen existierenden Ansätzen ist seine Einfachheit, Geschwindigkeit und Wirtschaftlichkeit. Daher kann diese Technik, die Produktion von vielen verletzten Gehirn in kurzer Zeit ermöglicht, leicht mit einem großen Maßstab in-situ-Hybridisierung Bildschirm, um Gene, die mit einer Rolle in der Regeneration und Neurogenese zu identifizieren kombiniert werden.
Das Alter des erwachsenen Zebrafisch an dem die Schädigung durchgeführt wird, von entscheidender Bedeutung. Wenn der Fisch älter als 1,5 Jahre, der Schädel zu hart und es ist möglich, daß der Schädel nach unten gedrückt oder gebrochen anstatt sauber perforiert. Im Gegensatz dazu ist bei jüngeren Fisch (jünger als 4 Monate), gibt es noch eine Menge von Neurogenese im Gange, die zu gegebener lead, um falsch-positive Ergebnisse in Bezug auf reaktive Neurogenese.
Ein weiterer entscheidender Schritt in diesem Ansatz ist es, die Effizienz der Stichwunde Akkreditierung und auszuschließen, dass die beiden Halbkugeln verwundet. Dies kann durch Färbung der Schnitte mit Anti-PCNA-Antikörper überwacht werden. In einem korrekt eingeführt Läsion sollte deutlich sein PCNA in nur einer der Halbkugeln hochreguliert.
Es ist wichtig zu beachten, dass die induzierte mechanische Verletzung zahlreiche Nebenwirkungen wie unspezifische Zell Ablation, erhöhten Zelltod aufgrund von sekundärer Degeneration, Entzündung und Zerstörung der Blut-Hirn-Schranke, und Beschädigung der ventrikulären Zone und so haben eine mögliche Folge Strömung der Zerebrospinalflüssigkeit in das Hirnparenchym. Allerdings scheinen die verletzten Fische aus der Verletzung leiden sehr wenig. Innerhalb von 2 min sind sie frei schwimmen und wieder normalen Fressverhalten innerhalb von etwa 4 Stunden wieder hergestellt. Nach 3 Wochen ist der injury ist morphologisch nicht mehr sichtbar. In unseren Händen, aus mehreren hundert Operationen haben wir nicht einen einzigen Fisch zu verlieren, trotz der Tatsache, dass wir eine 100% Verletzungsrate als durch Histologie bei 5 Tage nach der Läsion beurteilt.
In den letzten Jahren andere Techniken wie transgene Ansätze haben im Zebrafisch entwickelt, um Gewebe-oder Zelltyp-spezifische Ablation 2 zu erzeugen. Obwohl diese Techniken sind sehr elegant und minimal invasive sie auf die Erzeugung von komplexen DNA-Konstrukte und die Einrichtung mehrere stabile transgene Zebrafisch-Linien, die sehr mühsam und zeitaufwendig sein kann, basiert. Daher einfache mechanische Ansätze wie die in diesem Protokoll beschriebenen Test vor ein wichtiges Werkzeug, um erwachsenen Gehirn Neurogenese und Regeneration zu studieren.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine | Sigma | 335.2 | |
| 10x DPBS (-/-) | Life technologies | 14200-083 | |
| 30 G syringe (Omnican 40) | B.Braun Melsungen | 916162 | |
| Polyethylene molding cup tray | Polysciences, Inc | 17177C-3 | |
| PeqGOLD Universal Agarose | Peqlab | 35-1020 | |
| Bovine serum albumin | Biochrom | W 2835919108 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences, Inc | 18606-20 | |
| Tween 20 | Carl Roth | 9127.1 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
| Dissection needle | Carl Roth | KX93.1 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.2 | |
| Loctite 414 | Schöffler und Wörner | 06 1362 0020 | |
| Glass slides | Labonord | 5305103 | |
| Cover slips 24 x 60 mm | Labonord | 5305060 | |
| Petri dishes, 94 mm | Greiner bio-one | 632180 | |
| Falcon tubes, 15 ml | Greiner bio-one | 188261 | |
| 24-well plate | Greiner bio-one | 662160 | |
| Anti-S100 (1:500) | Dako | Z031101-2 | |
| Anti-PCNA (1:400) | Dako | M087901 | |
| Anti-GFP (1:1,000) | Aves Labs | GFP-1020 | |
| anti-Dig AP-coupled antibody | Roche Diagnostics | 11093274910 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Roche Diagnostics | 1383221 | |
| 4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Roche Diagnostics | 1383213 | |
| Proteinase K | Roche Diagnostics | 1092766 | |
| Polyethylene molding cup tray | Polysciences | 17177C-3 | |
| Vibratome VT1000S | Leica | ||
| Confocal microscope Sp5 DM6000 | Leica | ||
| Dissecting microscope Nikon SMZ 645 | Nikon | ||
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon catalog | 353226 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Danio rerio Tg(olig2:EGFP) | Shin et al.24 | ||
| Danio rerio WT strains (e.g., AB2O2) |
References
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- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72, 429-461 (2012).
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