Abstract
Yetişkin Zebrafish yaralanmadan sonra kendi merkezi sinir sistemini yenilemek için inanılmaz bir kapasiteye sahiptir. Hücresel yanıtı ve zebra balığı erişkin merkezi sinir sistemi (MSS) rejenerasyon ve onarım dahil moleküler mekanizmalarının araştırılması, biz yetişkin telencephalic yaralanma Zebra balığı model geliştirdi.
Bu yaklaşımda, elle zebrabalıkları yetişkin telencephalon içine bir insülin şırınga iğnesi iterek bir yaralanma oluşturur. Farklı sonrası yaralanma günlerde, balık beyinleri disseke ve hücre çoğalması, gliogenesis, ve nöron gözlemlemek için uygun işaretleri ile immünohistokimyasal ve / veya in situ hibridizasyon (ISH) Yazan lekeli, kurban edilmiştir. Kontralateral lezyonsuz yarıküre bir iç kontrol olarak hizmet vermektedir. RNA derin sıralama ile örneğin birlikte bu yöntem Zebrafish yetişkin telencephalon nöron, yenilenme ve tamir bir rolü olan yeni genlerin taranması için yardımcı olabilir.
Introduction
Memeliler yetişkin hayatı boyunca yeni nöronlar oluşturmak için çok sınırlı bir kapasiteye sahip ve beyinde yetişkin nöron çoğunlukla lateral ventriküllerin subventricular bölgesi (SVZ) yer alan iki telencephalic bölgelere sınırlıdır ve dentatus bir subgranular bölgesi (SGZ) Hipokampta 1 gyrus. Memeliler da verimli, nörodejeneratif hastalıklar, inme, ya da yaralanma nedeniyle beyin hasarı tamir edemez. Kayıp nöronlar değiştirilmemiştir ve astrositler, mikroglia ve oligodendrosit glial hücreler de dahil olmak üzere farklı, yerine çoğalması gözlenir. Reaktif gliyoz denilen bu proliferatif işlemin bir sonucu olarak, zarar gören beyin dokusu nöronal ve aksonal rejenerasyonu 2-4 önleyen bir glial yara izi, oluşumu ile yalıtılmıştır.
Memeliler, teleost balık aksine Zebra balığı gibi yetişkin dönemlerinde bol miktarda yeni nöronlar oluşturmak ve yüksek rejeneratif ve proliferat varmerkezi sinir sistemi 2,5-7 lezyonlarını onarmak için potansiyel ive. Zebra balığı yetişkin beyin tüm yaşam 8-11 boyunca yeni nöronlar çok sayıda oluşturmak 16 farklı nöral kök hücre nişler bulunmaktadır. Yetişkin zebrabalıkları beynin bu özel çoğalması bölgelerde doğan nöronlar olgun ve mevcut nöron ağları 8,10,12-15 entegre olacak onların hedef alanlar, göç.
Yetişkin zebrabalıkları tespit progenitör bölgeleri arasında, telencephalic ventriküler zon en çok çalışılan nöronal kök hücre niş biridir. Bu progenitör niş hücreler kendi morfolojisi, bölünme oranı ve farklı glial veya nöronal markerlerin ekspresyonu ile ilgili olarak, üç ayrı tipte sınıflandırılabilir. Tip I ve tip II hücrelerin uzun süreçleri var hücreleri gibi radyal glial vardır. Onlar GFAP'ye, Nestin ve S100β dahil kök hücreleri işaretleri ifade. Tip II hücrelerin proliferat ederken hücreler çoğalmaya yok yazıne yavaş yavaş, hücre çekirdeği antijeni (PCNA) ile desoxythymidine analoglarının birleşme çoğalan olarak çoğalma markerlerin bunların ifadesi ile kanıtlanmıştır. Tip III hücreleri hızlı sinir atalarıdır olmak ve bu PSA-NCAM 5,16 olarak nöral işaretleyici genleri ifade kararlıyız bölünen hücreler vardır.
Teleost balık rejeneratif kapasitelerinin iyi belgelenmiş olmakla birlikte, sadece az sayıda yayın yaralanma 15,17-22 tepki olarak yetişkin telencephalon nöronal rejenerasyon dahil hücresel ve moleküler mekanizmaları tarif edilen ve detaylı bir şekilde araştırılmıştır. Zebra balığı erişkin merkezi sinir sistemi yenilenme ve tamir karıştığı mekanizmalarını deşifre etmek ve bünye ve rejeneratif nöron arasındaki benzerlikleri ve farklılıkları anlamak için, biz yetişkin telencephalic yaralanma Zebra balığı model geliştirdi. Burada, biz telencephalic hemisph birinde bir yaralanma oluşturmak için görsel nasıl anlatacağızbir şırınga iğnesi yardımıyla eres, bir iç kontrol olarak kontralateral lezyonsuz yan tutarken. Biz de hücre çoğalması ve immünhistokimya gen ifadesinde ve in situ hibridizasyon deneylerinde yaralanması üzerine değişiklikleri izlemek için nasıl göstereceğim.
Protocol
Zebra balığı Technology (KIT) Karlsruhe Enstitüsü Toksikoloji ve Genetik (ITG) Enstitüsü balık tesisi tutuldu. Hayvanlar üzerinde deneyler Alman hayvan koruma standartlarına uygun olarak yapılmış ve Baden-Württemberg Hükümeti, Regierungspräsidium Karlsruhe, Almanya (Aktenzeichen 35-9185.81/G-272/12 'Adulte Neurogenese') tarafından onaylanmıştır.
1.. Telencephalon bir Bıçak Yaralanması oluşturuluyor
- Anestezi
- (Aynı zamanda, etil 3-aminobenzoat olarak adlandırılan 3-amino benzoik asit etil ester,) tricaine bir stok çözelti hazırlamak için tricaine tozun 400 mg kullanımı ve 97.9 ml su içinde çözülür ve 2.1 ml 1 M Tris / HCl tamponu (pH 9). 5 ml'lik numuneler olun. 7'ye pH'ı ayarlamak ve kullanıma kadar -20 ° C'de saklayın.
- Plastik fare kafesler içine onların tankları 0.5-1 yaşındaki zebrabalıkları uygun sayıda aktarın. Not: yaklaşık 12 yetişkin bir zebrabalıkları kafatasınıaylık, hala nispeten yumuşak ve (bölüm 1.2.3 ve Şekil 1A bakınız) bir iğne ile kolayca perfore olabilir.
- Yetişkin zebrafish anestezi için, temiz akvaryum su ~ 100 ml (tricaine nihai konsantrasyonu% 0.02 (ağırlık / hacim) tricaine) ile plastik bir geçiş kafese 5 ml tricaine (stok çözelti) bir araya getirir.
- Onlar artık (45-60 saniye) hareket etmiyor kadar anestezik olarak balık kuluçkaya yatmaktadır.
- Telencephalon Yaralanma
- Yeri bireysel tricaine batırılmış bir köpük blok içinde bir yarık içine zebrafish anestezi.
- Üstten ışık ile bir mikroskop altında hafifçe bir elinizle balık tutmak ve üst baş erişim sağlayan bir şekilde yönlendirmek.
- Öte yandan dikey bir telencephalic yarımkürede (Şekil 1A-1B) medial bölgeye kafatası yoluyla bir 30 G şırınga (iğnenin insülin şırınga) itin. Telencephalon a yarımküresininkafatası yoluyla görünür yeniden. Tanıtılan lezyon 2 mm (Şekil 1C) daha derin olmadığından emin olun. Not: Bu, yüksek kafatası dışarı beyin kesme zaman lezyon bölgesinde tanımlanmasını kolaylaştırmak için, aynı yarımkürede her lezyonun tanıtmak için tavsiye edilir.
- Telencephalic yaralanma tanıttıktan sonra, taze balık suya balık yer. Geri kazanımı için balık su ile dolu bir 2 L fare kafesine 10 balık kadar devam edin ve bir su akış sistemine fare kafesi bağlayın. Not: Balık sağlıklı ve başka deneyler önce balık ile yapıldı ise hayatta kalma oranı ~ genellikle% 97'dir. Balık suya antibiyotik ilave edilmesi gerekli değildir. İyileştikten sonra, balık normal davranacaktır: Onlar, yem, ve dostum yüzmek.
2.. Telencephalic Yaralanma Etkisi Analizi
- Beyin Diseksiyon ve Fiksasyon
- Lezyon (Typicall sonra farklı zaman noktalarında kurtarılan balık re-uyuşturany, 1, 3, 5 ve 14 gün% 0.02 ile lezyon (DPL)) sonrası (yukarıda ve 5 dakika boyunca, buzlu su içine koyarak bunları ötenazi olarak ağ / hac) tricaine.
- Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde ıslatılmış ince kağıt üzerinde balık yerleştirin ve keskin bir makas ile solungaçları arkasında keserek gövdesinden ayrı baş.
- Kanamaya izin vermek için 5 dakika boyunca 1 x PBS içinde kafaları tutun. Not: Bu protokol daha ileri adımlar perturb olabilir doku, kan akıtır.
- PBS ya da oda sıcaklığında (RT), 4 saat içinde% 4 paraformaldehit (PFA) içerisinde 4 ° C'de bir gece boyunca kafaları düzeltildi.
- Bir petri 1x PBS ile iki kez, sabit kafaları yıkayın.
- Diseksiyon mikroskop altında 23 1x PBS dikkatli beyinleri teşrih. Lezyon mikroskop altında genellikle görünür. Bir görünür lezyonu olmayan Brain atılmalıdır.
- 1.5 ml% 100 metanol ile doldurulmuş 2 ml'lik tepkime tüpleri (MeOH) içine aktarılır ve beyinleri 5x saatliğine inkübe edilmeden önce tüpler tersen az 16 saat boyunca -20 ° C 'de onları. Not: immünohistokimya ya da in situ hibridizasyon gerekli olana kadar Beyinler -20 ° C'de MeOH içinde birkaç ay boyunca muhafaza edilebilir.
- İmmünohistokimya için doku hazırlanması
- 2 ml plastik tüpler içinde seri azalan metanol (sekans% 75 MeOH (1 x PBS,% 0.1 Tween-20 = PTW) üzerinden beyinleri rehidrate;.% 50 MeOH,% 25 MeOH beyinleri (15 beyin / 2 ml reaksiyon tüpleri inkübe ), her çözelti içinde 5 dakika için.
- 5 dakika boyunca PTW olarak beyinleri yıkayın. Taze PTW ile 4x tekrarlayın.
- Kesit için Beyinlerin katıştırma
- Gömme için, transfer pipetiyle (5 mm çap) sahip bir polietilen fincan kalıplama tepsinin boşluklarına PTW 'de 2 ml reaksiyon tüpünden beyinleri aktarın.
- Bir Erlenmeyer şişesi içinde 1 x PBS içinde% 2 agaroz (DNA grade) hazırlayın. Agaroz tamamen eriyene kadar 600 W mikrodalga fırında ısıtın. 10 beyinleri için 50 ml hazırlayın. Let inciE agaroz kullanımdan önce oda sıcaklığında 3 dakika boyunca soğumaya. Önceden ısıtılmış bir ısıtma bloğu (60 ° C) katılaşmayı önlemek için beyinleri gömme sırasında üzerinde agaroz tutun.
- Pasteur pipeti (1 mm çaplı) kullanılarak, bir beyin içeren kalıptan 1x PBS çıkarın. Beyin zarar vermemek için dikkatli olun.
- Kalıbın içine agaroz dökün ve tamamen doldurun. O zaman daha kolay beyin gömmek için yapım ITMA'nın yıkayacak agaroz beyin girdap bir diseksiyon iğne kullanın.
- Orient aşağı kalıp ventral tarafta beyin, yukarı sırt yan ve düz yerleştirin.
- Agaroz soğumasını bekleyin. Daha hızlı bir soğutma için, buz üzerinde kalıp yerleştirin. Adımları tekrarlayın.
- Tüm beyinleri için 2.3.3-2.3.6 tekrarlayın.
- Agaroz Blok Kesme
- Diseksiyon iğne kullanarak, agaroz blok pop.
- Keskin bir tıraş bıçağı ile, beynin arka ucundaki agaroz kesilir. Emin olun bu uçağı te paralel olunlencephalon.
- Beynin ön ucundaki agaroz kesin. O arka düzlem üzerinde duruyor, böylece daha sonra blok çevirin.
- Beynin dorsal ve ventral yanlarına paralel olarak keserek agaroz fazlalığını çıkarın. Onun ventral tarafta yatıyor böylece daha sonra geri beyin çevirin.
- Telencephalon küçük düzlemde bulunduğu bir kesik üçgen (Şekil 2) için blok kesin.
- Kesit için Vibratome hazırlanması
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak vibratome hazırlayın. Yeni bir jilet kullanın ve 10 beyinleri sonra değiştirin.
- Sadece kanadın alt seviyeye ulaştığı bir 1x PBS ile tampon banyo doldurun.
- Vibratome bir numune diskin üstüne superglue küçük bir nokta yerleştirin.
- Dikkatlice superglue üzerinde beyne posterior bulunduğu düzlem yerleştirin. Bu 1x PBS ile temas halinde olduğu gibi tutkal kısa sürede donacaktırvibratome tampon banyo.
- Mikrotom manipülatör kullanarak tampon tepsisine numune ile numune diski takın.
- Istenilen pozisyon içine numune diski döndürmek için manipülatör kullanın. Bıçağı bakan beyin dorsal kısmı, yüzeyin hemen altındaki telencephalon bulur bir şekilde tampon banyosunda blok Orient. Sonra 3 mm Allen anahtarı ile Scrw sıkın ve manipülatör çıkarın. Not: sıkma vida veya kıskaç cihazlardan biri numune disk üzerinde bulunan boşluk olmamalıdır; Bu pozisyonlarda numune diski sıkıştırma mümkün değildir.
- Beyin kesit
- Bölümlerini toplamak için bir 24 oyuklu plaka hazırlanması. Kesitli olmak beyin başına, bloke etme tampon maddesi içinde 1 ml (% 0.1 (iyi bir dolgu v / v) 10% Tween-20,% 0.2 (w / v) inek serum albümini (BSA),% 1 (v / v) PBS içinde dimetil sülfoksit (DMSO)).
- 50 mikron kalınlığında, 1 mm / saniye hızda ve 70 Hz frekansta kesit Başlangıçtitreşimli bir mikrotom kullanılarak.
- Onlar bıçağını çekip gelir ve 24 plaka bunları toplamak gibi agaroz ince dilim almak için sentetik bir fırça (1 mm) kullanın.
- Vibratome Bölümler üzerinde İmmünhistokimya
- Tamponu (% 0.1 (v / v) Tween 20,% 10,% 0.2 (PBS içinde ağırlık / hacim) BSA,% 1 (v / v) DMSO) bloke oda sıcaklığında 1 saat boyunca, spesifik olmayan bağlanma yerleri bloke eder.
- Süpernatantı ve 4 ° C'de gece boyunca blokaj tamponu içinde seyreltilmiş 250 ul antikor ekleyin Seçenek olarak ise, oda sıcaklığında 2 saat için primer antikor inkübe edin. Daha sonra PTW 10 dakika boyunca 3 kez yıkayın. Not: PCNA boyanma Bir 1:400 seyreltme kullanın (fare anti-PCNA'yı detayları malzemelerin tabloya bakınız.). Birden fazla primer antikorlar aynı zamanda inkübe edilebilir.
- Oda sıcaklığında 2 saat boyunca ikinci antikor bölümleri inkübe PTW sonra 10 dakika boyunca 3 kez yıkayın. Not: PTW yılında 1:1000 seyreltme, detay malzemeleri tablosunu görmek için. Birden fazla ikincil antikorlar aynı zamanda inkübe edilebilir.
- (Alternatif immünohistokimyaya) situ Hibridizasyon Yetişkin Beyin RNA
- Beyin Diseksiyon ve Fiksasyon (imünohistokimya için aynı prosedür):
- Probun hibridizasyonu.
- İmmünohistokimya için tarif edildiği gibi 2 ml reaksiyon tüplerine beyinleri rehidrate.
- 30 dakika boyunca PTW in, proteinaz K (10 ug / ml 'lik son kons. ProtK) içinde beyin inkübe edin. İnkübasyon süresinden sonra ProtK / ITMA'nın çıkarın ve BT-Fix 20 dakika boyunca tekrar beyinleri düzeltmek (% 4 PFA,% 4 sukroz, 0.12 mM CaCl2, 77 mM Na 2 HPO 4, 23 mM NaH 2 PO 4).
- PTW 5 dakika (% 0.1 (v / v) Tween-20, PBS içinde) için beyinleri 5x yıkayın.
- ITMA'nın çıkarın ve 500 ul beyinleri durulayınHYB tamponu (% 50 (v / v), deiyonize formamid, 5x SSC, 500 ug / ml maya tRNA, 50 ug / ml heparin,% 0.1 Tween-20, 9 mM citricacid). Beyinleri sonra süpernatant atmak ve temiz HYB tampon 500 ul ekleyin ve 3-4 saat için 65-70 ° C'de inkübe tüpün dibine batar kadar bekleyin.
- HYB tampon 400 ul nihai hacim içinde (prob bağlı olarak) 1:200 ya da 1:400 RNA probu seyreltin. 5 dakika boyunca 70 ° C'de seyreltilmiş RNA probu ısıtın.
- Beyinlerinden alınan süpernatantı ve RNA probu eklemek, 65-70 ° C (O / N) de inkübe edilir. Tüm yıkama tampon çözeltileri, 70 ° C'de önceden ısıtılmış ve tutulmalıdır
- Etiketleme
- 30 dakika boyunca iki kez yıkama tamponu 1 ile 500 ul (% 50 formamid, 1 x SSC,% 0.05 Tween 20) ile (4 yıkama işlemi esnasında) 65-70 ° C'de beyinleri yıkayın. Tampon 2 (2 x SSC,% 0.1 Tween 20) ile tampon 1 yerine ve 15 dakika boyunca inkübe edin. Tamponunu çıkarın ve 2 fo tamponu 3 (0,2 X SSC,% 0.1 Tween 20) yıkama beyinleri30 dk r iki kez bu 2 numaralı adımı yineleyin. 4 tamponu (0,1 x SSC, PTW içerisinde% 0.05 Tween 20) ile tampon yerine 3, 5 dakika boyunca inkübe edin.
- Süpernatantı ve oda sıcaklığında PTW 500 ul içinde 5 dakika süre ile yıkayın.
- (1x PBS),% 2 agaroz beyinleri gömmek ve imünohistokimya için tarif edildiği gibi vibratome bölümleri (50-100 um) kesti.
- Tampon maddesi (1x PBS,% 0.1 Tween-20,% 0.2 (ağ / h) BSA,% 1 (v / v) DMSO) bloke 500 ul içinde 5 dakika süre ile 1x yıkayın.
- Süpernatantı ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca 500 ul blokaj tamponu ekleyin.
- Süpernatant kaldırmak ve anti-Dig AP-bağlı antikor tampon engelleme 1:4,000 seyreltilmiş 300 ul ekleyin.
- 4 ° C'de o / n inkübe
- NBT / BCIP boyama
- Oda sıcaklığında PTW tamponu ile 15 dakika boyunca 5x yıkayın.
- Lekeleme tampon maddesi içinde 1x durulayın. Lekeleme tampon maddesi içinde iki kez 5 dak (100 mM Tris / HCl pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl,% 0.1 Tween-20) ile yıkayın.
- 500 μ ile süpernatant ve leke çıkarmakl boyama çözeltisi (3.5, 4-nitro mavi tetrazolyum klorid (NBT) ve 1 ul lekeleme tampon ml başına 5-Bromo-4-kloro-3-indolil-fosfat (BCIP)).
- PTW ile 5x 3x durulama tarafından boyanarak durdurun.
- Beyin Diseksiyon ve Fiksasyon (imünohistokimya için aynı prosedür):
- Bölümler montaj
- (Malzeme tabloya bakınız) bir suda çözünür olmayan, floresan montaj ortamı kullanılarak slaytlara bölümleri monte edin.
- 4 ° C'de buzdolabında slaytlar tutun Not: boyama, hatta birkaç hafta veya ay boyunca stabildir.
- Bir bileşik veya konfokal mikroskop altında analiz slaytlar.
Representative Results
Bu makalede açıklanan iş akışını kullanarak, bir lezyon bir yetişkin zebrabalıkları telencephalon (Şekil 1A-1B) sağ hemisfer girmiştir. Doğru bir yaralama telencephalon (Şekil 3C) ve bütün beyin zarı boyunca ventral dorsal uzanan bir lezyon kanal yol açar. Lezyon hemisfer birine sınırlı olmalı ve medial ventrikül çapraz olmamalıdır. Lezyon kanal aydınlık alan mikroskobu (Şekil 3C) ile görünür ve yaklaşık 35 gün sonra 15 iyileşmiş olacak.
3-7 DPL de ve S100β (Şekil 3B) immünohistokimya 15 ile bulgulanabilir; Daha önce, hücre çekirdeği antijeni (PCNA Şekil 3A) çoğalan bir yukarı-regülasyonu yaralama sonra gösterilmiştir. PCNA ve S100β ait boyama radyal glial hücrelerin çoğalmasını gösteren örtüşmektedir.
FBalık 24: urthermore, oligodendrosit öncü hücreleri (OPC) görselleştirmek için, bir bıçak yarası deney Tg (EGFP olig2) üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bir anti-GFP antikorla boyama üzerine, lezyon kanal yakın OPC birikimi (Şekil 3D) tespit edilebilir. Bu birikim geçicidir ve OPC kümeler 35 DPL 15 de artık gözlenmez.
Lezyon düzgün tanıtıldı değilse, lezyon kanal görünür olmayacak ve yukarı-regülasyonu PCNA'ya ve S100β veya OPC birikimi tespit olmayacaktır. PCNA beyin hasarı için en hassas belirtecidir. Bıçak yarası verimliliğini doğrulamak için ve her iki hemisferde yaralı olduğunu hariç tutmak için, kuvvetli bir zaman bir anti-PCNA antikoru ile bölümleri leke önerilir. Bir doğru tanıttı lezyonda, PCNA anlamlı olmalıdır up-regüle tek yarıkürelerinin (kadar 15 4-kat). Çoğu durumda olmasına rağmenSadece gen ekspresyonu değişiklikleri izlemek için bir iç kontrol olarak kontralateral lezyonsuz yan kullanmak yeterlidir, bu son derece vahşi tip beyinlerinin telencephalic yarıküre içindeki ifadesi ile, kontrol yarımkürede gen ifadesini karşılaştırmak için tavsiye edilir. Bu şekilde, her iki yarımkürede etkileyecek gen ifadesi üzerindeki lezyon herhangi bir sistemik etkileri tespit edilebilir.
Levha sistematik bir transkripsiyon düzenleyici (TR'ler) ifade ekran ile bir arada deneyi yara (25 ve Schmidt et al., Yayınlanmamış) da nöron ve rejenerasyon (Şekil 4A-4C) olası bir rol ile TR genleri tanımlamak için kullanılabilir.
Bu yaklaşım, telencephalon olarak ifade edilmiştir ve ekspresyonu yaralanması (Şekil 4A-C) 'ye tepki olarak düzenlenir kadar spesifik olan faktörlerin bir dizi belirlemiştir.
Şekil 2. SBir kesilmiş agaroz bloğunda bir yetişkin zebrabalıkları beyin chematic gösterimi hemen önce vibratome kesit. Anterior kadardır. Koku alma ampul (ob), telencephalon (tel), optik TECTUM (ot), beyincik (cb) ve medulla (m). Ölçek çubuğu: 500 mikron.
Şekil 3.. Yara bıçaklanma Rejeneratif tepkiler. 5 günde AD) Yetişkin Zebra balığı beyin bıçakla yaralanması sonucunda ventriküler zon (oklar) up-regüle (DPL). AB) proliferatif işaretleyici PCNA (A) ve radyal glial işaretleyici S100β (B) lezyon gönderebilirsiniz. (C) lezyon kanal parlak alan aydınlatma (oklar) altında görülebilir. Ventriküler bölge yeşil bir çizgi ile gösterilir. (D) Oligodendrosit öncü hücreler (olig2: EGFP +)) lezyon (okların yerinde biriken. Ölçek çubuğu: 200 mikron. Tüm panellerde, sağ hemisfer lezyonlu yarıküre. Dorsal kadardır. A ila D içindeki kesikli çizgi beyin zarı ile subpallium arasındaki sınırı belirtmektedir.
Gözlenmiş Şekil 4. Bıçaklanma yanıt olarak up-regüle genlerin örneği. Eomesa doğru telencephalic hemisferde (A, B) ve sox4a (C) mRNA ifadesi (bıçakladı yarıküre) arasında güçlü bir yukarı-regülasyonu (oklar) Not 5 DPL de in situ hibridizasyon ile. Sol hemisfer yaralanmamış ve kontrol olarak hizmet vermektedir. (B) A. dorsal dorsal telencephalic bölgenin daha yüksek bir büyütme kadar olduğunu gösterir. Ölçek çubuğu: A ve C için 200 mikron ve B. The için 55 mikronA kesikli çizgi ve C beyin zarı ve subpallium arasındaki mesafeyi gösterir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
| KISALTMALAR | |
| AP | Alkalin Fosfataz |
| BCIP | 5-bromo-4-kloro-3'-indolyphosphate |
| BSA | Sığır serum albümin |
| CNS | Merkezi sinir sistemi |
| Kazmak | Dioksijenin |
| DMSO | Dimetil sülfoksit |
| DPL | Gün lezyonu gönderebilir |
| eomesa | Eomesodermin homolog bir |
| GFAP | Glial fibriller asidik protein |
| hr | Saat |
| HYBtampon | Hibridizasyon tamponu |
| ISH | in situ hibridizasyon |
| MeOH | Metanol |
| NBT | Nitro-mavi tetrazoliumu |
| OPC | Oligodendrosit ön-madde hücreleri, |
| PBS | Fosfat tamponlu tuzlu su |
| PCNA | Çoğalan hücre çekirdek antijeni |
| PFA | Paraformaldehyde |
| ProtK | Proteinaz K |
| PSA-NCAM | Polisialilatlanmış nöronal hücre yapışma molekülü |
| PTW | PBS,% 0.1 Tween-20 |
| RNA | Ribonükleik asidin |
| RT | Oda sıcaklığı |
| SGZ | Subgranular bölge |
| sox4a | Gen 4a içeren SRY-box |
| SSC | Tuzlu-sodyum sitrat |
| SVZ'una | Bölge subventricular |
| TRs | Transkripsiyon düzenleyiciler |
Discussion
Biz burada yetişkin zebrafish kafatası yoluyla bir iğne iterek bir telencephalic hasara yol için, ve immünhistokimya ve in situ hibridizasyon bu yaralanma hücresel ve moleküler tepki analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Mevcut diğer yaklaşımlar üzerinde bu tekniğin ana avantajı basitlik, hız ve maliyet verimliliği. Bu yüzden, kısa bir süre içinde bir çok yaralı beyinlerin üretimine olanak sağlar, bu teknik, kolayca rejenerasyon ve nöron bir rol ile genleri tanımlamak için in situ hibridizasyon ekranında bir büyük ölçekli kombine edilebilir.
Yaralanma gerçekleştirildiği yetişkin zebrabalıkları yaşı önemlidir. Balık 1,5 yıl daha yaşlı iseniz, kafatası çok zor olduğunu ve kafatası aşağı itti doğrusu temiz delikli daha kırık olma ihtimali vardır. Buna karşılık, küçük balıklar (küçük 4 ay) devam nöron bir sürü hala var olduğu olabilir leareaktif nöron ilgili yanlış pozitif sonuçlar d.
Bu yaklaşımın bir diğer kritik adım bıçak yarasının etkinliğini doğrulamak için ve iki yarım küresi yaralı olduğunu dışlamak için. Bu, anti-PCNA antikoru ile bölümleri boyama ile izlenebilir. Bir doğru tanıttı lezyonda, PCNA yarıkürelerinin sadece bir up-regüle anlamlı olmalıdır.
Bu kaynaklı mekanik yaralanma gibi non-spesifik hücre ablasyon, çünkü ikincil dejenerasyon, inflamasyon ve kan-beyin bariyerinin yıkılması artan hücre ölümü, ve ventriküler bölgesi hasar gibi ve gibi çeşitli yan etkileri olacağı akılda önemlidir beyin parankimi içine beyin omurilik sıvısının olası bir sonucudur akışı. Ancak, yaralı balık yaralanma çok az muzdarip görünüyor. 2 dakika içinde tekrar ücretsiz yüzme ve normal beslenme davranışı yaklaşık 4 saat içinde geri yüklenir. 3 hafta sonra, injury artık morfolojik görünür değil. Bizim ellerde, birkaç yüz ameliyatları biz 5 gün sonrası lezyon de histoloji tarafından değerlendirilen biz% 100 yaralanma oranına sahip olmasına rağmen, tek bir balık kaybetmedim.
Son yıllarda, bu tür transjenik yaklaşımlar gibi başka teknikler de doku veya hücre tipi özel ablasyon 2 üretmek üzere zebrabalıkları geliştirilmiştir. Bu teknikler çok zarif ve minimal invaziv olmalarına rağmen karmaşık DNA yapıları ve çok sıkıcı ve zaman alıcı olabilir birkaç istikrarlı Zebrafish transgenik hatların kurulması nesil dayanmaktadır. Dolayısıyla, bu protokol açıklanan deneyi gibi basit mekanik yaklaşımlar yetişkin beyin nöron ve rejenerasyon çalışması için önemli bir araç olmaya devam etmektedir.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine | Sigma | 335.2 | |
| 10x DPBS (-/-) | Life technologies | 14200-083 | |
| 30 G syringe (Omnican 40) | B.Braun Melsungen | 916162 | |
| Polyethylene molding cup tray | Polysciences, Inc | 17177C-3 | |
| PeqGOLD Universal Agarose | Peqlab | 35-1020 | |
| Bovine serum albumin | Biochrom | W 2835919108 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences, Inc | 18606-20 | |
| Tween 20 | Carl Roth | 9127.1 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
| Dissection needle | Carl Roth | KX93.1 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.2 | |
| Loctite 414 | Schöffler und Wörner | 06 1362 0020 | |
| Glass slides | Labonord | 5305103 | |
| Cover slips 24 x 60 mm | Labonord | 5305060 | |
| Petri dishes, 94 mm | Greiner bio-one | 632180 | |
| Falcon tubes, 15 ml | Greiner bio-one | 188261 | |
| 24-well plate | Greiner bio-one | 662160 | |
| Anti-S100 (1:500) | Dako | Z031101-2 | |
| Anti-PCNA (1:400) | Dako | M087901 | |
| Anti-GFP (1:1,000) | Aves Labs | GFP-1020 | |
| anti-Dig AP-coupled antibody | Roche Diagnostics | 11093274910 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Roche Diagnostics | 1383221 | |
| 4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Roche Diagnostics | 1383213 | |
| Proteinase K | Roche Diagnostics | 1092766 | |
| Polyethylene molding cup tray | Polysciences | 17177C-3 | |
| Vibratome VT1000S | Leica | ||
| Confocal microscope Sp5 DM6000 | Leica | ||
| Dissecting microscope Nikon SMZ 645 | Nikon | ||
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon catalog | 353226 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Danio rerio Tg(olig2:EGFP) | Shin et al.24 | ||
| Danio rerio WT strains (e.g., AB2O2) |
References
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72, 429-461 (2012).
- Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis. Nat Rev Neurosci. 12, 88-104 (2011).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32, 638-647 (2009).
- Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Dev. 8, 3 (2013).
- Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the central nervous system of teleost fish. Eur J Neurosci. 34, 917-929 (2011).
- Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. Teleost fish as a model system to study successful regeneration of the central nervous system. Curr Top Microbiol Immunol. 367, 193-233 (2013).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295, 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Dev Biol. 295, 263-277 (2006).
- Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain. J Comp Neurol. 488, 290-319 (2005).
- Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29, 745-757 (2007).
- Hinsch, K., Zupanc, G. K. Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis. Neuroscience. 146, 679-696 (2007).
- Lindsey, B. W., Darabie, A., Tropepe, V. The cellular composition of neurogenic periventricular zones in the adult zebrafish forebrain. J Comp Neurol. 520, 2275-2316 (2012).
- Marz, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58, 870-888 (2010).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240, 2221-2231 (2011).
- Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223, 131-147 (2013).
- Ayari, B., El Hachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon. J Neurotrauma. 27, 959-972 (2010).
- Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis. Glia. 60, 343-357 (2011).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Dis Model Mech. 5, 200-209 (2012).
- Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Dev Cell. 23, 1230-1237 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138, 4831-4841 (2011).
- Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338, 1353-1356 (2012).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Shin, J., Park, H. C., Topczewska, J. M., Mawdsley, D. J., Appel, B. Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics. Methods Cell Sci. 25, 7-14 (2003).
- Armant, O., et al. Genome-wide, whole mount in situ analysis of transcriptional regulators in zebrafish embryos. Dev Biol. 380, 351-362 (2013).
