Abstract
Poisson zèbre adulte a une étonnante capacité à régénérer leur système nerveux central après une blessure. Pour étudier la réponse cellulaire et les mécanismes moléculaires impliqués dans le poisson zèbre adulte système nerveux central (SNC) de régénération et de réparation, nous avons développé un modèle de poisson zèbre de blessure de télencéphalique adulte.
Dans cette approche, nous générons manuellement une blessure en poussant une aiguille de seringue de l'insuline dans le télencéphale adulte poisson zèbre. À différents jours après des blessures, les poissons sont sacrifiés, leurs cerveaux sont disséqués et colorées par immunohistochimie et / ou hybridation in situ (ISH) avec des marqueurs appropriés pour observer la prolifération cellulaire, gliogénèse, et la neurogenèse. L'hémisphère non lésé controlatéral sert de contrôle interne. Cette méthode combinée par exemple avec de l'ARN séquençage profond peut aider à l'écran de nouveaux gènes jouant un rôle dans le poisson-zèbre neurogenèse télencéphale adulte, la régénération et la réparation.
Introduction
Les mammifères ont une capacité très limitée de générer de nouveaux neurones à l'âge adulte, et la neurogenèse adulte dans le cerveau est le plus souvent limitée à deux régions télencéphaliques situés à la zone sous-ventriculaire (SVZ) des ventricules latéraux, et la zone sous-granulaire (SGZ) du denté gyrus dans l'hippocampe 1. Les mammifères peuvent également pas réparer les dommages du cerveau causée par les maladies neurodégénératives, accident vasculaire cérébral ou de blessures, de manière efficace. Neurones perdus ne sont pas remplacés, et à la place de la prolifération de différents types de cellules gliales, les astrocytes, notamment, la microglie et les oligodendrocytes, est observée. En conséquence de ce processus de prolifération appelé gliose réactionnelle, le tissu du cerveau lésé est rendu étanche par la formation d'une cicatrice gliale, qui inhibe la régénération axonale neuronale et 4.2.
Contrairement aux mammifères, les poissons téléostéens comme le poisson zèbre former de nouveaux neurones en abondance dans les stades adultes et ont une haute régénération et PROLIFÉRATive potentiel de réparer les lésions du système nerveux central 2,5-7. Le cerveau adulte de poisson zèbre contient 16 niches de cellules souches neurales distinctes qui génèrent un grand nombre de nouveaux neurones pendant toute la durée 8-11. Neurones nés dans ces zones de prolifération spécifiques du cerveau adulte de poisson zèbre migrent vers les zones cibles, où ils seront matures et s'intégrer dans les réseaux de neurones existants 8,10,12-15.
Parmi les zones progénitrices identifiés chez le poisson zèbre adulte, la zone ventriculaire télencéphalique est l'une des niches de cellules souches les plus étudiées neuronales. Les cellules de cette ancêtre niche peuvent être classés en trois types distincts quant à leur morphologie, le taux de division et d'expression de cellules gliales différent ou marqueurs neuronaux. Type I et de type II sont des cellules gliales radiales comme les cellules qui ont un long processus. Ils expriment des marqueurs de cellules souches, y compris GFAP, la nestine, et S100β. Type I cellules ne prolifèrent pas tandis que les cellules de type II PROLIFÉRATe lentement, comme en témoigne leur expression de marqueurs de prolifération tels que la prolifération cellulaire antigène nucléaire (PCNA) et l'incorporation d'analogues de désoxythymidine. Les cellules de type III sont en train de la division des cellules qui se sont engagés à devenir progéniteurs neuronaux et exprimer des gènes marqueurs neuronaux, comme PSA-NCAM 5,16.
Bien que les capacités de régénération de poissons téléostéens sont bien documentés, seules quelques publications ont décrit et étudié en détail les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la régénération neuronale dans le télencéphale adulte à la suite d'une blessure 15,17-22. Pour décrypter les mécanismes impliqués dans le poisson zèbre adulte central régénération du système nerveux et de la réparation et de comprendre les similitudes et les différences entre la neurogenèse constitutive et de régénération, nous avons développé un modèle de poisson zèbre de blessure de télencéphalique adulte. Ici, nous allons décrire visuellement comment générer une blessure dans l'un des hemisph télencéphaliqueeres avec l'aide d'une aiguille de seringue, tout en maintenant le côté non lésé controlatéral comme témoin interne. Nous allons également montrer comment surveiller les changements sur blessure à la prolifération cellulaire et l'expression des gènes par immunohistochimie et dans des tests d'hybridation in situ.
Protocol
Poisson zèbre ont été maintenues dans l'installation de poisson de l'Institut de Toxicologie et génétique (ITG) à Karlsruhe Institute of Technology (KIT). Les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les normes de protection des animaux et allemands ont été approuvés par le gouvernement du Bade-Wurtemberg, Regierungspräsidium de Karlsruhe, Allemagne (Aktenzeichen 35-9185.81/G-272/12 'Adulte neurogenèse »).
1. Génération d'un coup de couteau dans le Télencéphale
- Anesthésie
- Pour préparer une solution de réserve de tricaïne (ester éthylique de l'acide benzoïque 3-amino, également appelé le 3-aminobenzoate) utilise 400 mg de poudre de tricaïne et le dissoudre dans 97,9 ml d'eau et 2,1 ml du tampon 1 M de Tris / HCl (pH 9). Ajuster le pH à 7. Faire aliquotes de 5 ml et de les stocker à -20 ° C jusqu'à utilisation.
- Transférer un nombre approprié de vieux 0,5-1 an poisson zèbre de leurs chars dans des cages de souris en plastique. Remarque: Le crâne d'un poisson zèbre adulte à environ 12mois est encore relativement doux et peuvent être perforées facilement avec une aiguille (voir la section 1.2.3 et la figure 1A).
- Pour anesthésier le poisson zèbre adulte, mélanger 5 ml tricaïne (solution mère) dans une cage de passage en plastique avec environ 100 ml d'eau du réservoir de poissons propre (concentration finale de tricaine 0,02% (p / v) tricaine).
- Incuber les poissons dans les anesthésiques jusqu'à ce qu'ils ne se déplacent plus (45-60 sec).
- Télencéphale blessures
- Lieu individu anesthésié poisson zèbre dans une fente dans un bloc de mousse de tricaine trempé.
- Sous un microscope de dissection avec la lumière du haut tenir délicatement le poisson avec une main et l'orienter d'une manière qui permet d'accéder à la tête du haut.
- Avec l'autre main pousser une seringue G 30 (insuline seringue avec une aiguille intégrée) verticalement à travers le crâne dans la région médiane d'un hémisphère télencéphalique (Figures 1A-1B). Les hémisphères du télencéphale unere visible à travers le crâne. Assurez-vous que la lésion introduit n'est pas plus profond de 2 mm (figure 1C). Remarque: Il est fortement recommandé d'introduire la lésion toujours dans le même hémisphère à faciliter l'identification du site de la lésion en disséquant le cerveau de crâne.
- Après l'introduction de la blessure télencéphalique, placer le poisson dans l'eau du poisson frais. Tenez-vous au 10 poissons dans une cage 2 L de la souris rempli avec de l'eau du poisson pour la récupération et connecter la cage de la souris à un système d'écoulement de l'eau. Note: Le taux de survie est généralement ~ 97% si les poissons sont en bonne santé et pas d'autres expériences ont été réalisées avec le poisson avant. L'addition d'antibiotiques à l'eau des poissons n'est pas nécessaire. Après la récupération, les poissons se comportent normalement: ils nagent, nourrir et s'accoupler.
2. Analyse de l'effet de télencéphaliques blessures
- Dissection du cerveau et de fixation
- Re-anesthésier le poisson récupérée en différents points de temps après la lésion (typically, 1, 3, 5 et 14 jours après la lésion (DPL)) avec 0,02% (p / v) de tricaïne comme ci-dessus et leur euthanasie en les plaçant dans de l'eau glacée pendant 5 minutes.
- Placer le poisson sur un mouchoir en papier imbibé de tampon phosphate salin (PBS) et séparer la tête du corps en coupant derrière les branchies avec un ciseau pointu.
- Gardez les têtes en 1x PBS pendant 5 min afin de permettre le saignement. Remarque: Cette draine le sang du tissu, ce qui peut perturber les prochaines étapes du protocole.
- Fixer les têtes pendant une nuit à 4 ° C dans du paraformaldéhyde 4% (PFA) dans du PBS ou 4 heures à la température ambiante (RT).
- Laver têtes fixes deux fois avec PBS 1x dans une boîte de Pétri.
- Disséquer le cerveau soigneusement 1x PBS sous un microscope de dissection 23. La lésion est généralement visible sous le microscope à dissection. Cerveaux sans lésion visible doivent être jetés.
- Transférer les cerveaux en deux tubes de réaction de 1,5 ml remplis de 100 ml% Methanol (MeOH) et inverser les tubes avant l'incubation 5xelles à -20 ° C pendant au moins 16 heures. Remarque: Les cerveaux peuvent être conservés pendant plusieurs mois dans MeOH à -20 ° C jusqu'à son utilisation pour l'immunohistochimie ou l'hybridation in situ.
- Préparation des tissus pour immunohistochimie
- Réhydrater le cerveau à travers une série de methanol descendante dans deux tubes ml en plastique (de manière séquentielle de 75% du MeOH (1 x PBS, 0,1% Tween-20 = PTW);. À 50% de MeOH, 25% de MeOH Incuber les cerveaux (15 cerveaux / 2 ml tubes de réaction ) pendant 5 min dans chacune des solutions.
- Laver les cerveaux dans PTW pendant 5 min. Répétez 4x avec frais PTW.
- Incorporation des cerveaux pour la coupe
- Pour l'enrobage, transférer le cerveau à partir du tube de réaction de 2 ml dans PTW dans les cavités de moulage d'un plateau en polyéthylène de tasse avec une pipette de transfert (5 mm de diamètre).
- Préparer 2% d'agarose (qualité de l'ADN) dans 1x PBS dans un erlenmeyer. Chauffer au micro-ondes à 600 W jusqu'à ce que l'agarose est complètement dissous. Préparer 50 ml pour 10 cerveaux. Soit ee refroidir agarose vers le bas pendant 3 min à température ambiante avant utilisation. Maintenir le agarose sur un bloc de chauffage pré-chauffé (60 ° C) tout en intégrant le cerveau afin d'empêcher la solidification.
- Retirer le PBS 1x du moule contenant une cerveau à l'aide d'une pipette Pasteur (1 mm de diamètre). Veillez à ne pas endommager le cerveau.
- Verser agarose dans le moule et le remplir entièrement. Ensuite, utilisez une aiguille de dissection à agiter le cerveau dans l'agarose à laver le PTW rend plus facile à intégrer le cerveau.
- Orientez le cerveau dans la partie ventrale du moule vers le bas, côté dorsal et placez-le directement.
- Laissez le agarose refroidir. Pour un refroidissement plus rapide, placez le moule sur la glace. Répétez les étapes.
- Répétez 2.3.3-2.3.6 pour tous les cerveaux.
- Recadrage de l'édifice Agarose
- En utilisant une aiguille de dissection, sortir le bloc d'agarose.
- Avec une lame de rasoir bien aiguisé, couper la gélose à l'extrémité postérieure du cerveau. Assurez-vous que ce plan est parallèle à la telencephalon.
- Couper l'agarose à l'extrémité antérieure du cerveau. Puis retournez le bloc de sorte qu'il se trouve sur le plan postérieur.
- Éliminer l'excès d'agarose par découpe parallèlement à la dorsale du cerveau et les côtés ventraux. Puis retournez le cerveau de retour de sorte qu'il se trouve sur le côté ventral.
- Couper le bloc à un triangle tronqué dont le télencéphale est situé au niveau du plan inférieur (Figure 2).
- Préparation de la Vibratome pour la coupe
- Préparer le vibratome selon les instructions du fabricant. Utilisez une nouvelle lame de rasoir et de le remplacer après 10 cerveaux.
- Remplir le bain de tampon de PBS 1x à un niveau qui atteint juste au bas de la lame.
- Placez un petit point de colle sur le dessus de la platine de la vibratome.
- Placez délicatement le plan qui se trouve en arrière du cerveau sur la superglue. La colle durcit dès qu'il est en contact avec le PBS 1x enle bain de tampon de vibratome.
- Insérer le disque d'échantillon avec l'échantillon dans le bac tampon à l'aide du manipulateur de la microtome.
- Utiliser le manipulateur pour faire tourner le disque de spécimen à la position souhaitée. Orienter le bloc dans le bain de tampon de manière à localiser le télencéphale juste sous la surface, avec la partie dorsale de la lame tournée vers le cerveau. Puis serrer la SCRW avec une clé Allen de 3 mm et retirez le manipulateur. Remarque: La vis de serrage ou l'un des dispositifs de serrage ne doivent pas être situées au-dessus de la fente dans le disque de spécimen; dans ces positions de serrage du disque de spécimen n'est pas possible.
- Sectionner le cerveau
- Préparer une plaque à 24 puits pour recueillir les sections. Par cerveau de sectionner, remplir un puits avec 1 ml de tampon de blocage (0,1% (v / v) 10% de Tween-20, 0,2% (p / v) de sérum-albumine bovine (BSA), 1% (v / v) le diméthylsulfoxyde (DMSO) dans du PBS).
- Commencez la coupe à l'épaisseur de 50 um, la vitesse de 1 mm / s, et 70 Hz de fréquencel'aide d'un microtome vibrant.
- Utilisez une brosse synthétique (1 mm) pour ramasser les fines tranches de agarose à mesure qu'elles sortent de la lame et à leur rassemblement dans la plaque de 24 puits.
- Immunohistochimie sur Vibratome articles
- Bloquer les sites de liaison non spécifiques pour une heure à température ambiante dans du tampon de blocage (0,1% (v / v) 10% de Tween 20, 0,2% (p / v) de BSA, 1% (v / v) de DMSO dans du PBS).
- Eliminer le surnageant et ajouter 250 ul d'anticorps dilué dans du tampon de blocage pendant une nuit à 4 ° C. Sinon, incuber l'anticorps primaire pendant 2 heures à température ambiante. Puis laver 3x pendant 10 min dans PTW. Note: Pour utiliser une coloration PCNA dilution 1:400 (anticorps de souris anti-PCNA Pour plus de détails, voir le tableau des matériaux.). Anticorps primaires multiples peuvent être mises en incubation en même temps.
- Incuber les sections anticorps secondaire pendant 2 heures à température ambiante puis laver 3x pendant 10 min dans PTW. Remarque: 1:1000 dilution dans PTW, pour plus de détails voir tableau des matériaux. Anticorps secondaires multiples peuvent être mises en incubation en même temps.
- Adulte ARN du cerveau hybridation in situ (alternativement à immunohistochimie)
- Dissection du cerveau et de fixation (même procédure que pour l'immunohistochimie):
- L'hybridation de la sonde.
- Réhydrater cerveaux dans 2 tubes de réaction ml comme décrit pour l'immunohistochimie.
- Incuber des cerveaux dans la protéinase K (ProtK;. 10 pg / ml concentration finale) dans PTW pendant 30 min. Après un temps d'incubation retirer ProtK / PTW et fixer les cerveaux de nouveau pendant 20 min dans BT-Fix (PFA 4%, 4% de saccharose, 0,12 mM de CaCl2, 77 mM Na 2 HPO 4, 23 mM NaH 2 PO 4).
- Laver les cerveaux 5x pendant 5 min dans PTW (0,1% (v / v) de Tween-20 dans du PBS).
- Retirer PTW et rincer le cerveau dans 500 piHYB tampon (50% (v / v) de formamide désionisé, 5x SSC, 500 pg / ml d'ARNt de levure, 50 pg / ml d'héparine, 0,1% de Tween-20, 9 mM acide citrique). Attendez jusqu'à ce que le cerveau se déposent au fond du tube, puis jeter le surnageant et ajouter 500 ul de tampon HYB propre et incuber à 65-70 ° C pendant 3-4 heures.
- Diluer la sonde d'ARN à 1:200 ou 1:400 (en fonction de la sonde) dans un volume final de 400 ul de tampon HYB. Chauffer la sonde d'ARN dilué à 70 ° C pendant 5 min.
- Retirer le surnageant des cerveaux et ajouter la sonde ARN, incuber à 65-70 ° C (O / N). Toutes les solutions tampons de lavage doivent être préchauffés et maintenus à 70 ° C.
- Étiquetage
- Laver les cerveaux à 65-70 ° C (pendant les 4 étapes de lavage) avec 500 ul de tampon de lavage 1 (50% de formamide, 1 x SSC, 0,05% de Tween 20) à deux reprises pendant 30 min. Remplacer le tampon 1 par tampon 2 (2x SSC, 0,1% de Tween 20), et incuber pendant 15 min. Retirez le tampon 2 et laver le cerveau dans un tampon 3 (0,2 x SSC, 0,1% de Tween 20) for 30 min, répéter deux fois cette étape 2. Remplacer tampon 3 par tampon 4 (0,1 x SSC, 0,05% de Tween 20 dans PTW), incuber pendant 5 min.
- Retirer le surnageant et laver pendant 5 min dans 500 pi de PTW à la température ambiante.
- Incluez dans le cerveau agarose à 2% (en 1x PBS) et couper vibratome sections (50-100 um) comme décrit pour l'immunohistochimie.
- 1x Wash pendant 5 min dans 500 pi de tampon de blocage (PBS 1x, 0,1% de Tween-20, 0,2% (p / v) de BSA, 1% (v / v) de DMSO).
- Retirer le surnageant et ajouter 500 ul de tampon de blocage pendant 2 heures à température ambiante.
- Retirer le surnageant et ajouter 300 ul anticorps anti-DIG couplé AP-dilué 1:4000 dans le tampon de blocage.
- Incuber o / n à 4 ° C.
- NBT / BCIP coloration
- Laver 5x pendant 15 min avec un tampon PTW à température ambiante.
- Rincer 1x dans un tampon de coloration. Laver deux fois 5 min dans du tampon de coloration (100 mM Tris / HCl pH 9,5, 50 mM de MgCl2, 100 mM de NaCl, 0,1% Tween-20).
- Retirer le surnageant et tache avec 500 μl solution de coloration (3,5 ul de 4-Nitroblue chlorure de tétrazolium (NBT) et 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) pour 1 ml de tampon de coloration).
- Arrêtez coloration par rinçage 3x 5x avec PTW.
- Dissection du cerveau et de fixation (même procédure que pour l'immunohistochimie):
- Montage des sections
- Montez les sections sur des lames à l'aide, un support de montage non-fluorescent soluble dans l'eau (voir le tableau des matériaux).
- Gardez les diapositives dans le réfrigérateur à 4 ° C. Note: La coloration est stable pendant plusieurs semaines, voire des mois.
- Analyser les glisse sous un composé ou d'un microscope confocal.
Representative Results
Utilisation du flux de travail décrit dans cet article, une lésion a été introduit dans l'hémisphère droit d'un télencéphale poisson zèbre adulte (figures 1A-1B). Une bonne blessure conduit à un canal de la lésion qui s'étend de dorsale à ventrale à travers tout le pallium du télencéphale (figure 3C). La lésion doit être limité à l'un des hémisphères et ne doit pas traverser le ventricule médian. Le canal de la lésion est visible en microscopie en champ clair (figure 3C) et sera guéri après environ 35 jours 15.
Il a été précédemment montré que après la blessure une régulation de la prolifération des cellules de l'antigène nucléaire (PCNA; Figure 3A) et S100β (figure 3B), à 3 à 7 dpl est détectable par immunohistochimie 15. La coloration de PCNA et S100β se recoupent, indiquant la prolifération des cellules gliales radiales.
Fan outre, afin de visualiser les cellules précurseurs d'oligodendrocytes (OPC), un essai coup de poignard de la plaie a été réalisée sur la Tg (Olig2: EGFP) poissons 24. Lors de la coloration avec un anticorps anti-GFP, l'accumulation des OPC à proximité immédiate du canal de la lésion est détectable (Figure 3D). Cette accumulation est transitoire, et les pôles de l'OPC ne sont plus observée à 35 dpl 15.
Si la lésion n'a pas été introduit correctement, le canal de la lésion ne sera pas visible, et la régulation de PCNA et S100β ou l'accumulation de OPC ne sera pas détectable. PCNA est le marqueur le plus sensible pour les lésions cérébrales. Afin de vérifier l'efficacité du coup de couteau et d'exclure que les deux hémisphères sont blessés, il est fortement recommandé de toujours colorer les sections avec un anticorps anti-PCNA. Dans une lésion correctement introduit, PCNA doit être régulée à la hausse de manière significative (jusqu'à 4 fois 15) seulement dans l'un des hémisphères. Bien que dans la plupart des cas, il estsuffisante pour utiliser uniquement le côté non lésé controlatéral comme un contrôle interne pour surveiller les changements dans l'expression des gènes, il est fortement recommandé de comparer l'expression des gènes dans l'hémisphère de contrôle de l'expression dans les hémisphères télencéphaliques de cerveaux de type sauvage. De cette manière, les effets systémiques de la lésion sur l'expression des gènes qui affecterait les deux hémisphères peuvent être détectés.
Le coup de couteau essai en combinaison avec un écran systématique de l'expression de régulateurs de transcription (TR) (25 et Schmidt et al., Non publié) peut également être utilisé pour identifier les gènes de TR avec un rôle possible dans la neurogenèse et la régénération (figures 4A-4C).
Cette approche a identifié un certain nombre de facteurs qui sont exprimés dans le télencéphale et dont l'expression est spécifiquement régulée à la hausse en réponse à une lésion (figure 4A-C).
Figure 2. Sreprésentation Chematic d'un cerveau de poisson zèbre adulte dans un bloc d'agarose équilibré, juste avant de sectionnement vibratome. antérieur est en place. Bulbe olfactif (OB), télencéphale (tel), toit optique (OT), le cervelet (cb) et de la moelle (m). Barre d'échelle: 500 um.
Figure 3. Réponses régénératifs à poignarder blessures de la plaie. AD) Adulte cerveau du poisson zèbre à 5 jours après la lésion (DPL). AB) Le PCNA prolifération marqueur (A) et le marqueur glial radiale S100β (B) sont régulés à la hausse dans la zone ventriculaire (flèches) lors d'une lésion stab. (C) Le canal de la lésion est visible sous un éclairage intense sur le terrain (flèches). La zone ventriculaire est indiqué par la ligne verte. (D) des cellules précurseurs d'oligodendrocytes (de Olig2: EG+ FP) s'accumule au niveau du site de lésion (flèches). Barre d'échelle: 200 um. Dans tous les panneaux, l'hémisphère droit est l'hémisphère lésé. Dorsale est en hausse. La ligne en pointillés A à D indique la frontière entre le pallium et le pallium.
Figure 4. Un exemple de gènes régulés à la hausse en réponse à poignarder blessures. Noter la forte régulation à la hausse (flèches) de eomesa (A, B) et sox4a (C) l'expression d'ARNm dans l'hémisphère télencéphalique droit (hémisphère poignardé), selon un contrôle par hybridation in situ à 5 dans dpl. L'hémisphère gauche est indemne et sert de contrôle. (B) montre un plus fort grossissement de la région de télencéphalique dorsale de A. dorsale est en place. Barre d'échelle: 200 um pour A et C et 55 um pour B.pointillés en A et C indique la séparation entre le pallium et le pallium. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| ABRÉVIATIONS | |
| AP | Phosphatase alcaline |
| BCIP | 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate |
| BSA | Albumine de sérum bovin |
| CNS | Système nerveux central |
| Dig | Digoxygenine |
| DMSO | Le sulfoxyde de diméthyle |
| dpl | Jours après la lésion |
| eomesa | Eomesodermin homologue un |
| GFAP | Protéine acide fibrillaire gliale |
| heure | Heure |
| HYBtampon | tampon d'hybridation |
| ISH | l'hybridation in situ |
| MeOH | Méthanol |
| NBT | Tétrazolium nitro-bleu |
| OPC | cellules précurseurs d'oligodendrocytes |
| PBS | Tampon phosphate salin |
| PCNA | Antigène nucléaire de prolifération cellulaire |
| PFA | Paraformaldéhyde |
| ProtK | Protéinase K |
| PSA-NCAM | Molécule d'adhérence cellulaire neuronale polysialylés |
| PTW | PBS, 0,1% Tween-20 |
| ARN | Acide ribonucléique |
| RT | La température ambiante |
| SGZ | Zone sous-granulaire |
| sox4a | SRY boîte contenant le gène 4a |
| SSC | Citrate Saline-sodium |
| SVZ | Zone sous-ventriculaire |
| TR | régulateurs de transcription |
Discussion
Nous décrivons ici un procédé pour induire une blessure télencéphalique en poussant une aiguille à travers le crâne du poisson zèbre adulte, et pour analyser la réaction cellulaire et moléculaire de cette blessure par immunohistochimie et hybridation in situ. Le principal avantage de cette technique par rapport aux autres approches existantes est sa simplicité, la rapidité et l'efficacité des coûts. Par conséquent, cette technique qui permet la production de nombreux cerveaux blessés dans un court laps de temps, peut être facilement combiné avec un écran de grande échelle hybridation in situ pour identifier des gènes ayant un rôle dans la régénération et la neurogenèse.
L'âge de poisson zèbre adulte sur lequel le dommage est effectuée est crucial. Si les poissons sont plus de 1,5 ans, le crâne est trop dur et il est possible que le crâne est poussé vers le bas ou fracturé plutôt que proprement perforé. En revanche, chez les jeunes poissons (moins de 4 mois), il reste encore beaucoup de neurogenèse se passe, ce qui pourrait lead des résultats faussement positifs en ce qui concerne la neurogenèse réactive.
Une autre étape cruciale de cette approche est de vérifier l'efficacité du coup de couteau et d'exclure que les deux hémisphères sont blessés. Ceci peut être contrôlé par coloration des sections avec l'anticorps anti-PCNA. Dans une lésion correctement mis en place, PCNA devrait être nettement régulée à la hausse dans un seul des hémisphères.
Il est important de garder à l'esprit que la blessure mécanique induite aura plusieurs effets secondaires tels que l'ablation non-spécifique cellulaire, la mort cellulaire accrue en raison de la dégénérescence secondaire, l'inflammation et la destruction de la barrière hémato-encéphalique, et les dégâts de zone ventriculaire et que un écoulement de conséquence possible du liquide céphalo-rachidien dans le parenchyme cérébral. Cependant, les poissons blessés semblent souffrir très peu de la blessure. Dans 2 minutes ils sont nage libre à nouveau et le comportement alimentaire normal est rétabli dans environ 4 heures. Après 3 semaines, l'ie préjudice est morphologiquement plus visible. Dans nos mains, de plusieurs centaines de chirurgies que nous n'avons pas perdu un seul poisson, malgré le fait que nous avions un taux de blessures à 100% tel qu'évalué par l'histologie à 5 jours après la lésion.
Dans les dernières années, d'autres techniques telles que les approches transgéniques ont été développés chez le poisson zèbre pour produire un tissu ou type de cellule ablation spécifique 2. Bien que ces techniques sont très élégant et peu invasive, ils sont basés sur la génération de constructions d'ADN complexes et la mise en place de plusieurs lignes de poisson zèbre transgénique stable qui peut être très long et fastidieux. Par conséquent, les approches mécaniques simples tels que l'analyse décrite dans ce protocole restent un outil important pour étudier la neurogenèse adulte cerveau et de la régénération.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine | Sigma | 335.2 | |
| 10x DPBS (-/-) | Life technologies | 14200-083 | |
| 30 G syringe (Omnican 40) | B.Braun Melsungen | 916162 | |
| Polyethylene molding cup tray | Polysciences, Inc | 17177C-3 | |
| PeqGOLD Universal Agarose | Peqlab | 35-1020 | |
| Bovine serum albumin | Biochrom | W 2835919108 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences, Inc | 18606-20 | |
| Tween 20 | Carl Roth | 9127.1 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
| Dissection needle | Carl Roth | KX93.1 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.2 | |
| Loctite 414 | Schöffler und Wörner | 06 1362 0020 | |
| Glass slides | Labonord | 5305103 | |
| Cover slips 24 x 60 mm | Labonord | 5305060 | |
| Petri dishes, 94 mm | Greiner bio-one | 632180 | |
| Falcon tubes, 15 ml | Greiner bio-one | 188261 | |
| 24-well plate | Greiner bio-one | 662160 | |
| Anti-S100 (1:500) | Dako | Z031101-2 | |
| Anti-PCNA (1:400) | Dako | M087901 | |
| Anti-GFP (1:1,000) | Aves Labs | GFP-1020 | |
| anti-Dig AP-coupled antibody | Roche Diagnostics | 11093274910 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Roche Diagnostics | 1383221 | |
| 4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Roche Diagnostics | 1383213 | |
| Proteinase K | Roche Diagnostics | 1092766 | |
| Polyethylene molding cup tray | Polysciences | 17177C-3 | |
| Vibratome VT1000S | Leica | ||
| Confocal microscope Sp5 DM6000 | Leica | ||
| Dissecting microscope Nikon SMZ 645 | Nikon | ||
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon catalog | 353226 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Danio rerio Tg(olig2:EGFP) | Shin et al.24 | ||
| Danio rerio WT strains (e.g., AB2O2) |
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