Abstract
Voksen sebrafisk har en utrolig evne til å regenerere sin sentrale nervesystemet etter skade. For å undersøke cellulær respons og de molekylære mekanismene som er involvert i sebrafisk voksne sentralnervesystemet (CNS) regenerering og reparasjon, utviklet vi en sebrafisk-modellen av voksen telencephalic skade.
I denne tilnærmingen, vi generere en skade manuelt ved å skyve en insulinsprøyte nål inn i sebrafisk voksen telencephalon. På forskjellige innlegg skade dager, er fisken avlivet, hjernen dissekeres ut og farget ved immunhistokjemi og / eller in situ hybridisering (ISH) med hensiktsmessige markører for å observere celleproliferasjon, gliogenesis og neurogenesis. Kontralaterale unlesioned halvkule fungerer som en intern kontroll. Denne metoden kombinert for eksempel med RNA dyp sekvensering kan bidra til skjermen for nye gener med en rolle i sebrafisk voksen telencephalon neurogenesis, gjenfødelse, og reparasjon.
Introduction
Pattedyr har en svært begrenset kapasitet til å generere nye nerveceller i voksen alder, og voksen neurogenesis i hjernen er stort sett begrenset til to telencephalic regioner som ligger på subventricular sone (SVZ) av den laterale ventriklene, og den subgranular sone (SGZ) av dentate gyrus i hippocampus en. Pattedyr kan heller ikke reparere skader i hjernen forårsaket av neurodegenerative sykdommer, slag, eller skade, effektivt. Mistet nevroner blir ikke erstattet, og i stedet spredning av ulike typer av gliaceller, inkludert astrocytter, microglia og oligodendrocytes, er observert. Som en konsekvens av denne proliferative prosess kalt reaktive gliosis blir skadet hjernevev tettet ved dannelse av en glial arr, som hemmer nevronal og aksonal regenerering 2-4.
I motsetning til pattedyr, beinfisk som sebrafisk danne nye nerveceller i overflod hos voksne stadier og har en høy regenererende og proliferative potensial for å reparere lesjoner i sentralnervesystemet 2,5-7. Sebrafisk voksne hjernen inneholder 16 forskjellige nevrale stamceller nisjer som genererer et stort antall nye nevroner i løpet av hele livet 8-11. Nevroner født i disse spesifikke spredningssonene av den voksne sebrafisk hjernen migrere til sine satsingsområder, hvor de vil modnes og integreres i de eksisterende nevrale nettverk 8,10,12-15.
Blant de progenitor soner identifisert i voksne sebrafisk, er telencephalic ventrikulær sone en av de mest studerte nevrale stamceller nisjer. Celler i denne stamfar nisje kan klassifiseres i tre forskjellige typer om deres morfologi, divisjon rate og uttrykk av forskjellige glial eller nevronale markører. Type I-og type II cellene er radial glial lignende celler som har lange prosesser. De uttrykker stamceller markører inkludert GFAP, nestin, og S100β. Type I celler ikke sprer mens type II celler proliferate sakte, som vist ved deres ekspresjon av sprednings markører som prolifererende celleatom antigen (PCNA), og inkorporering av desoxythymidine analoger. Den type III cellene er raskt dele celler som er forpliktet til å bli nevrale stamceller og uttrykke nevrale markørgener, slik som PSA-NCAM 5,16.
Selv om de regenerative kapasiteter teleost fish er godt dokumentert, er det bare noen få publikasjoner som er beskrevet og undersøkt i detalj de cellulære og molekylære mekanismer som er involvert i neuronal regenerering i den voksne telencephalon i respons til skade 15,17-22. Å dechiffrere mekanismene innblandet i sebrafisk voksne sentralnervesystemet regenerering og reparasjon og å forstå likheter og forskjeller mellom konstituerende og regenerativ neurogenesis, utviklet vi en sebrafisk-modellen av voksen telencephalic skade. Her vil vi beskrive hvordan visuelt å generere en skade på en av de telencephalic hemispheres ved hjelp av en sprøyte nål, mens du holder den kontralaterale unlesioned side som en intern kontroll. Vi vil også vise hvordan å overvåke endringer ved skade i celleproliferasjon og genuttrykk ved immunhistokjemi og in situ hybridisering analyser.
Protocol
Sebrafisk ble opprettholdt i fiskeanlegg ved Institutt for toksikologi og genetikk (ITG) ved Karlsruhe Institute of Technology (KIT). Eksperimenter på dyr ble utført i samsvar med de tyske dyrevern standarder og ble godkjent av regjeringen i Baden-Württemberg, Regierungspräsidium Karlsruhe, Tyskland (Aktenzeichen 35-9185.81/G-272/12 'Adulte Neurogenese').
En. Generere en knivskade i Telencephalon
- Anestesi
- For å fremstille en stamoppløsning av Tricaine (3-amino-benzosyre-etylester, også kalt etyl-3-aminobenzoat) bruke 400 mg av Tricaine pulver og oppløse den i 97,9 ml vann og 2,1 ml 1 M Tris / HCl-buffer (pH 9). Juster pH til 7. Lag 5 ml porsjoner og lagre dem ved -20 ° C inntil bruk.
- Overfør et passende antall 0,5-1 år gamle sebrafisk fra sine tanker inn i plast mus bur. Merk: Skallen av en voksen sebrafisk på ca 12måneder fremdeles er relativt mykt og kan lett perforert med en nål (se avsnitt 1.2.3 og figur 1A).
- For å bedøve den voksne sebrafisk, kombiner 5 ml Tricaine (stamløsning) i en plastkrysnings bur med ~ 100 ml med rent fisketanken vann (sluttkonsentrasjonen av Tricaine 0,02% (w / v) Tricaine).
- Inkuber fisken i anestetika inntil de ikke kan bevege seg lenger (45-60 sek.)
- Telencephalon Injury
- Place individ bedøvet sebrafisk i en spalte i en blokk med Tricaine-gjennomvåt skum.
- Under et disseksjonsmikroskop med lys ovenfra hold forsiktig fisken med den ene hånden og orientere det på en måte som tillater adgang til hodet fra toppen.
- Med den andre hånden presse en 30 G sprøyte (insulinsprøyte med integrert nål) vertikalt gjennom skallen inn i det midtområde av en telencephalic halvkule (figurene 1A-1B). De halvkuler av telencephalon enre synlig gjennom skallen. Sørg for at den innførte lesjon er ikke dypere enn 2 mm (figur 1C). Merk: Det er sterkt anbefalt å introdusere lesjonen alltid inn i samme halvkule for å lette identifiseringen av området av lesjon når dissekere hjernen ut av skallen.
- Etter innføring av telencephalic skade, legg fisken i fersk fisk vann. Hold deg til 10 fisk i en 2 L mus bur fylt med fisk vann for utvinning og koble musen buret til en vannføring system. Merk: Overlevelsesraten er vanligvis ~ 97% hvis fisk er sunt, og ingen andre eksperimenter ble utført med fisken før. Tilsetning av antibiotika til fisken vann er ikke nødvendig. Etter utvinning, fisk oppfører seg normalt: de svømmer, fôr, og kompis.
2. Analysere Effekt av Telencephalic Injury
- Brain Dissection og fiksering
- Re-anaesthetize den gjen fisk ved ulike tidspunkt etter lesjon (typically, 1, 3, 5 og 14 dager etter lesjonen (DPL)) med 0,02% (w / v) Tricaine som ovenfor og avlive dem ved å sette dem inn i isvann i 5 min.
- Legg fisken på en papir-tissue fuktet i fosfat-bufret saltvann (PBS) og skille hodet fra kroppen ved å skjære bak gjellene med en skarp saks.
- Hold hodene i 1x PBS i 5 min for å tillate blødning. Merk: Dette tapper blod fra vevet, som kan forstyrre ytterligere trinnene i protokollen.
- Fix hodene over natten ved 4 ° C i 4% paraformaldehyde (PFA) i PBS eller 4 timer ved romtemperatur (RT).
- Vask faste hoder to ganger med 1x PBS i en petriskål.
- Dissekere hjerner nøye i 1x PBS under et dissekere mikroskop 23. Lesjonen er vanligvis synlige under disseksjonsmikroskop. Hjerner uten en synlig lesjon bør kastes.
- Overfør hjerner inn 2 ml reaksjons rør fylt med 1,5 ml 100% metanol (MeOH) og invertere rørene 5x før inkubasjondem ved -20 ° C i minst 16 timer. Merk: Hjernene kan oppbevares i flere måneder i MeOH ved -20 ° C inntil det er behov for immunohistokjemi og in situ hybridisering.
- Vevpreparerina for Immunhistokjemi
- Rehydrere hjernen gjennom en synkende metanol serie i 2 ml plastrørene (sekvensielt 75% MeOH (1 x PBS, 0,1% Tween-20 = AT),. 50% MeOH, 25% MeOH Inkuber hjerner (15 hjerner / 2 ml reaksjonsrør ) i 5 minutter i hver løsning.
- Vask hjernen i PTW for 5 min. Gjenta 4x med frisk PTW.
- Innstøping av de Brains for Seksjonering
- For innebygging, overføre hjernen fra 2 ml reaksjonsrøret i PTW inn i hulrom i en polyetylen molding cup skuffen med en overføring pipette (5 mm diameter).
- Forbered 2% agarose (DNA-kvalitet) i 1 x PBS i en Erlenmeyer kolbe. Varme den i mikrobølgeovnen på 600 W til agarose er oppløst helt. Forbered 50 ml for 10 hjerner. La the agarose avkjøles i 3 minutter ved romtemperatur før bruk. Hold agarose på et forvarmet varmeblokk (60 ° C), mens innstøping hjernene for å hindre størkning.
- Fjern PBS 1x fra formen inneholdende en hjerne ved hjelp av en Pasteur-pipette (mm diameter 1). Vær forsiktig så du ikke skader hjernen.
- Hell agarose i formen og fylle den helt. Deretter bruker du en disseksjon nål å virvle hjernen i agarose å vaske bort PTW som gjør det enklere å bygge inn i hjernen.
- Orient hjernen i formen ventral side ned, ryggsiden opp og plassere den rett.
- La agarose kjøle seg ned. For raskere avkjøling, plasser formen på is. Gjenta trinn.
- Gjenta 2.3.3-2.3.6 for alle hjerner.
- Trimming av agarosen Block
- Ved hjelp av en disseksjon nål, sprette ut agarose blokken.
- Med et skarpt barberblad, kuttet agarose ved den bakre enden av hjernen. Sørg for at dette flyet er parallelt med telencephalon.
- Skjær agarose ved fremre ende av hjernen. Deretter snu blokken slik at det står på bakre flyet.
- Fjern overskudd av agarose ved å kutte i parallell til hjernens dorsale og ventrale sider. Deretter snu hjernen tilbake slik at den ligger på sin ventral side.
- Skjær blokken til en avkortet trekant hvor telencephalon er plassert på den mindre plan (figur 2).
- Klar vibratome for Seksjonering
- Forbered vibratome i henhold til produsentens instruksjoner. Bruk et nytt barberblad og erstatte den etter 10 hjerner.
- Fyll opp buffer bad med 1 x PBS til et nivå som akkurat når frem til bunnen av bladet.
- Plasser en liten prikk av superglue på toppen av prøveplaten av vibratome.
- Plasser forsiktig flyet som ligger posterior til hjernen på superlim. Limet vil herde så snart den er i kontakt med 1x PBS ivibratome buffer bad.
- Sett prøveplaten med prøven inn i bufferbrettet bruker manipulator av mikrotomen.
- Bruk manipulator å rotere prøveplaten til ønsket posisjon. Orienter blokk i buffer-bad på en måte som lokaliserer telencephalon like under overflaten, og den dorsale del av hjernen som vender mot sagbladet. Stram deretter scrw med en 3 mm sekskantnøkkel og fjern manipulator. Merk: klemskrue eller en av kleminnretninger må ikke ligge over gapet i prøveplaten; i disse stillinger fastklemming av prøveplaten er ikke mulig.
- Seksjonering the Brain
- Forbered en 24-brønns plate for å samle delene. Per hjernen som skal seksjoneres, fylle en brønn med en ml blokkeringsbuffer (0,1% (v / v) 10% Tween-20, 0,2% (w / v) bovint serum albumin (BSA), 1% (v / v) dimetylsulfoksyd (DMSO) i PBS).
- Begynn seksjonering på 50 mikrometer tykkelse, 1 mm / sek hastighet, og 70 Hz frekvensved hjelp av en vibrerende mikrotomen.
- Bruk en syntetisk pensel (1 mm) for å plukke opp de tynne skiver av agarose som de kommer ut bladet og samle dem i 24-brønns plate.
- Immunhistokjemi på vibratome Seksjoner
- Blokk uspesifikke bindingssteder i 1 time ved RT i blokkering buffer (0,1% (v / v) 10% Tween 20, 0,2% (w / v) BSA, 1% (v / v) DMSO i PBS).
- Fjern supernatanten og tilsett 250 pl av antistoff fortynnet i blokkeringsbuffer over natten ved 4 ° C. Alternativt kan det primære antistoffet inkubere i 2 timer ved RT. Deretter vaskes 3x for 10 min i PTW. Merk: For PCNA farging bruke en 1:400 fortynning (mus anti-PCNA For detaljer se tabell av materialer.). Flere primære antistoffer kan bli inkubert samtidig.
- Inkuber seksjoner i sekundært antistoff i 2 timer ved RT og deretter vaskes 3x i 10 min i PTW. Merk: 1:1.000 fortynning i PTW, for detaljer se tabell av materialer. Flere sekundære antistoffer kan bli inkubert samtidig.
- Voksen Brain RNA in situ hybridisering (alternativt til immunhistokjemi)
- Brain Dissection og fiksering (samme prosedyre som for immunhistokjemi):
- Hybridisering av proben.
- Rehydrere hjerner i 2 ml reaksjonsrør som beskrevet for immunohistokjemi.
- Inkuber hjerner proteinase K (ProtK,. 10 pg / ml sluttkonsentrasjon) i PTW i 30 min. Etter inkubasjonstid fjerne ProtK / PTW og fikse hjernen igjen for 20 min i BT-Fix (4% PFA, 4% sukrose, 0,12 mM CaCl 2, 77 mM Na 2 HPO 4, 23 mM NaH 2 PO 4).
- Vask hjerner 5 x 5 min i PTW (0,1% (v / v) Tween-20 i PBS).
- Fjern PTW og skyll hjernene i 500 mLHYB-buffer (50% (v / v) deionisert formamid, 5x SSC, 500 pg / ml gjær tRNA og 50 pg / ml heparin, 0,1% Tween-20, 9 mM citricacid). Vent til hjernen synke til bunnen av røret og deretter kaste supernatanten og tilsett 500 ul av rent HYB-buffer og inkuberes ved 65-70 ° C i 3-4 timer.
- Fortynn RNA-probe til 1:200 eller 1:400 (avhengig av probe) i 400 pl sluttvolum på HYB-buffer. Varm opp fortynnet RNA sonde ved 70 ° C i 5 min.
- Fjern supernatant fra hjernen og tilsett RNA probe, Inkuber ved 65 til 70 ° C (O / N). Alle vaskebufferløsninger bør varmet og holdt ved 70 ° C.
- Merking
- Vask hjernen ved 65 til 70 ° C (i løpet av alle fire vasketrinn) med 500 ul av en vaskebuffer (50% formamid, 1 x SSC, 0,05% Tween 20) to ganger i 30 min. Erstatt buffer 1 ved buffer 2 (2x SSC, 0,1% Tween 20), og inkuber i 15 min. Fjern buffer 2 og vask hjerner i buffer 3 (0,2 x SSC, 0,1% Tween 20) for 30 min, gjenta dette trinnet to ganger. Erstatt buffer 3 ved buffer 4 (0,1 x SSC, 0,05% Tween 20 in AT), inkuber i 5 min.
- Fjern supernatanten og vask i 5 minutter i 500 mL av PTW ved RT.
- Embed hjerner i 2% agarose (i 1x PBS) og kutte vibratome seksjoner (50-100 mikrometer) som beskrevet for immunhistokjemi.
- Vask 1x i 5 min i 500 pl blokkeringsbuffer (1 x PBS, 0,1% Tween-20, 0,2% (w / v) BSA, 1% (v / v) DMSO).
- Fjern supernatant og tilsett 500 ul blokkeringsbuffer i 2 timer ved RT.
- Fjern supernatanten og tilsett 300 mL anti-Dig AP-kombinert antistoff fortynnes 1:4,000 i blokkering buffer.
- Inkuber o / n ved 4 ° C.
- NBT / BCIP Farging
- Vask 5 x i 15 min med PTW buffer ved RT.
- Skyll 1x i farging buffer. Vask to ganger i 5 min i fargings buffer (100 mM Tris / HCl pH 9,5, 50 mM MgCl 2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20).
- Fjern supernatanten og beis med 500 μl fargingsoppløsning (3,5 mL av 4-nitro-blå tetrazolium-klorid (NBT) og 5-brom-4-klor-3-indolyl-fosfat (BCIP) per 1 ml fargings buffer).
- Stopp flekker ved å skylle 3x til 5x med PTW.
- Brain Dissection og fiksering (samme prosedyre som for immunhistokjemi):
- Montering av § §
- Monter seksjoner på slides ved hjelp av en vann-oppløselig, ikke-fluorescerende monteringsmedium (se Materialer tabell).
- Hold lysbilder i kjøleskapet ved 4 ° C. Merk: farging er stabilt i flere uker eller måneder.
- Analyser lysbildene i henhold til en forbindelse eller konfokal mikroskop.
Representative Results
Ved hjelp av arbeidsflyten beskrevet i denne artikkelen, er en lesjon innført i den høyre halvdelen av en voksen sebrafisk telencephalon (figurene 1A-1B). En riktig såret fører til en lesjon kanal som strekker seg fra rygg til ventral gjennom hele pallium av telencephalon (figur 3C). Lesjonen bør begrenses til en av halvkuler, og skal ikke krysse den mediale ventrikkel. Lesjonen kanalen er synlig med lyse felt mikroskopi (Figur 3C) og vil bli helbredet etter ca 35 dager 15.
Det ble tidligere vist at etter at såret en opp-regulering av prolifererende celleatom antigen (PCNA, figur 3A), og S100β (fig. 3B) ved 3-7 DPL er påvisbar ved immunhistokjemi 15.. Farging av PCNA og S100β er overlappende, noe som indikerer spredning av radiale gliaceller.
Furthermore, for å visualisere oligodendrocyte forløper celler (OPCs), ble knivskade analysen utført på Tg (olig2: EGFP) fisk 24. Ved farging med et anti-GFP antistoff, er akkumulering av OPCS i umiddelbar nærhet til lesjonen kanalen påvisbar (figur 3D). Denne opphopning er forbigående, og OPC klynger er ikke observert lenger ved 35 DPL 15.
Hvis lesjonen ikke ble innført på riktig måte, vil lesjonen kanalen ikke være synlig, og oppregulering av PCNA og S100β eller opphopning av OPCS vil ikke være synlig. PCNA er den mest sensitive markør for hjerneskade. For å verifisere effektiviteten av stikk sår og for å utelukke at begge halvkuler er såret, er det sterkt anbefalt å alltid flekken seksjoner med en anti-PCNA antistoff. I en fullstendig innført lesjon, PCNA bør være betydelig oppregulert (opptil fire ganger 15) i bare en av de halvkuler. Selv om det i de fleste tilfeller er dettilstrekkelig å bare bruke den kontralaterale unlesioned side som en intern kontroll for å overvåke endringer i genuttrykk, er det sterkt anbefalt å sammenligne genuttrykk i kontroll halvkule med uttrykket i telencephalic halvkuler av villtype hjerner. På denne måte kan noen systemiske virkninger av lesjonen på genekspresjon som vil påvirke begge halvkuler påvises.
Den stikk viklet assay i kombinasjon med en systematisk ekspresjon skjermen av transkripsjons regulatorer (TRS) (25 og Schmidt et al. Upublisert) kan også brukes til å identifisere gener TR med en mulig rolle i neurogenesis og regenerering (figurene 4A-4C).
Denne tilnærmingen har identifisert en rekke faktorer som kommer til uttrykk i telencephalon og som uttrykk er spesifikt oppregulert i respons til skade (Figur 4A-C).
Figur 2. Schematic representasjon av en voksen sebrafisk hjernen i en trimmet agarose blokk like før vibratome seksjonering. Anterior er opp. Luktelappen (ob), telencephalon (tel), optisk Tectum (ot), lillehjernen (cb) og marg (m). Målestokk: 500 mikrometer.
Figur 3. Regenerative svar å dolke såret skade. AD) Voksen sebrafisk hjernen på fem dager etter lesjon (DPL). AB) Den proliferativ markør PCNA (A) og radial glial markør S100β (B) er oppregulert ved ventrikulære sone (piler) på dolke såret. (C) Den lesjon kanal er synlig under lyse felt belysning (piler). Den ventrikulære sonen angis med den grønne linjen. (D) oligodendrocyte forløper celler (olig2: EGFP +) akkumuleres på stedet av lesjon (piler). Målestokk: 200 mikrometer. I alle paneler, er den høyre hjernehalvdelen den lesioned halvkule. Dorsal er opp. Den stiplede linjen i A til D er grensen mellom pallium og subpallium.
Figur 4. Et eksempel på gener oppregulert i respons til å stikke skade.. Merk den sterke oppregulering (piler) av eomesa (A, B) og sox4a (C) mRNA uttrykk i riktig telencephalic halvkule (knivstukket halvkule) som overvåkes ved in situ-hybridisering ved 5 DPL. Den venstre hjernehalvdelen er uskadd og fungerer som kontroll. (B) viser en høyere forstørrelse av dorsal telencephalic regionen A. Dorsal er opp. Målestokk: 200 mikrometer for A og C og 55 mikrometer for B.stiplet linje i A og C indikerer avstanden mellom pallium og subpallium. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| FORKORTELSER | |
| AP | Alkalisk fosfatase |
| BCIP | 5-brom-4-klor-3'-indolyphosphate |
| BSA | Bovint serum albumin |
| CNS | Sentralnervesystemet |
| Dig | Digoxygenin |
| DMSO | Dimethylsulfoxyd |
| DPL | Dager etter lesjon |
| eomesa | Eomesodermin homolog en |
| GFAP | Glial fibrillary sure protein |
| hr | Time |
| HYBbuffer | Hybridisering buffer |
| ISH | in situ hybridisering |
| MeOH | Metanol |
| NBT | Nitro-blå tetrazolium |
| OPCS | Oligodendrocyte forløper celler |
| PBS | Fosfat saltvann |
| PCNA | Voksende celle kjernefysiske antigen |
| PFA | Paraformaldehyde |
| ProtK | Proteinase K |
| PSA-NCAM | Polysialylated neuronal cell adhesion molecule |
| PTW | PBS, 0,1% Tween-20 |
| RNA | Ribonukleinsyre |
| RT | Romtemperatur |
| SGZ | Subgranular sone |
| sox4a | SRY-boks som inneholder genet 4a |
| SSC | Saline-natriumsitrat |
| SVZ | Subventricular sone |
| TRs | Transkripsjons regulatorer |
Discussion
Vi beskriver her en metode for å indusere en telencephalic skade ved å dytte en nål gjennom hodeskallen av den voksne sebrafisk, og å analysere cellulært og molekylært reaksjon på denne skaden ved immunhistokjemi og in situ hybridisering. Den største fordelen med denne teknikken i forhold til andre eksisterende tilnærminger er dens enkelhet, hastighet og kostnadseffektivitet. Derfor kan denne teknikk, som gjør det mulig for produksjon av mange skadede hoder i en kort tid, lett kan kombineres med en stor skala in situ hybridisering skjermen for å identifisere gener med en rolle for regenerering og neurogenesis.
Alderen på den voksne sebrafisk som skaden er utført er avgjørende. Hvis fisken er eldre enn 1,5 år, er skallen for hardt, og det er mulig at skallen skyves ned eller brukket i stedet for ren perforert. I kontrast, i yngre fisk (yngre enn 4 måneder), er det fortsatt mye neurogenesis skjer, som kan lead til falske positive resultater om reaktiv neurogenesis.
Et annet kritisk punkt i denne tilnærmingen er å verifisere effektiviteten av stikk sår og for å utelukke at begge halvkuler er såret. Dette kan overvåkes ved farging seksjonene med anti-PCNA-antistoff. I en korrekt innført lesjon, bør PCNA være vesentlig oppregulert i bare ett av de halvkuler.
Det er viktig å huske på at den induserte mekanisk skade vil ha flere bivirkninger som uspesifikke celle ablasjon, økt celledød på grunn av sekundær degenerasjon, betennelse og ødeleggelse av blod-hjerne barrieren, og skader av ventrikkel-sonen og som en mulig konsekvens strømning av spinalvæsken inn i hjernen parenchyma. Men de skadede fisk synes å lide svært lite fra skaden. Innen to minutter er de gratis svømming igjen og normal fôring atferd er gjenopprettet innen ca 4 timer. Etter tre uker på injury er morfologisk ikke synlig lenger. I våre hender, fra flere hundre operasjoner vi ikke miste en eneste fisk til tross for at vi hadde en 100% skadefrekvens som vurderes av histologi på fem dager etter lesjon.
I de siste årene andre teknikker slik som transgene metoder er blitt utviklet i sebrafisk for å produsere vev-eller celletype spesifikk ablasjon 2. Selv om disse teknikkene er svært elegant og minimalt invasiv de er basert på generering av kompliserte DNA-konstruksjoner og etablering av flere stabile sebrafisk transgene linjer som kan være veldig kjedelig og tidkrevende. Derfor enkle mekaniske tilnærminger som analysen beskrevet i denne protokollen er fortsatt et viktig verktøy for å studere voksne hjernen neurogenesis og regenerering.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine | Sigma | 335.2 | |
| 10x DPBS (-/-) | Life technologies | 14200-083 | |
| 30 G syringe (Omnican 40) | B.Braun Melsungen | 916162 | |
| Polyethylene molding cup tray | Polysciences, Inc | 17177C-3 | |
| PeqGOLD Universal Agarose | Peqlab | 35-1020 | |
| Bovine serum albumin | Biochrom | W 2835919108 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences, Inc | 18606-20 | |
| Tween 20 | Carl Roth | 9127.1 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
| Dissection needle | Carl Roth | KX93.1 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.2 | |
| Loctite 414 | Schöffler und Wörner | 06 1362 0020 | |
| Glass slides | Labonord | 5305103 | |
| Cover slips 24 x 60 mm | Labonord | 5305060 | |
| Petri dishes, 94 mm | Greiner bio-one | 632180 | |
| Falcon tubes, 15 ml | Greiner bio-one | 188261 | |
| 24-well plate | Greiner bio-one | 662160 | |
| Anti-S100 (1:500) | Dako | Z031101-2 | |
| Anti-PCNA (1:400) | Dako | M087901 | |
| Anti-GFP (1:1,000) | Aves Labs | GFP-1020 | |
| anti-Dig AP-coupled antibody | Roche Diagnostics | 11093274910 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Roche Diagnostics | 1383221 | |
| 4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Roche Diagnostics | 1383213 | |
| Proteinase K | Roche Diagnostics | 1092766 | |
| Polyethylene molding cup tray | Polysciences | 17177C-3 | |
| Vibratome VT1000S | Leica | ||
| Confocal microscope Sp5 DM6000 | Leica | ||
| Dissecting microscope Nikon SMZ 645 | Nikon | ||
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon catalog | 353226 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Danio rerio Tg(olig2:EGFP) | Shin et al.24 | ||
| Danio rerio WT strains (e.g., AB2O2) |
References
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72, 429-461 (2012).
- Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis. Nat Rev Neurosci. 12, 88-104 (2011).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32, 638-647 (2009).
- Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Dev. 8, 3 (2013).
- Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the central nervous system of teleost fish. Eur J Neurosci. 34, 917-929 (2011).
- Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. Teleost fish as a model system to study successful regeneration of the central nervous system. Curr Top Microbiol Immunol. 367, 193-233 (2013).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295, 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Dev Biol. 295, 263-277 (2006).
- Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain. J Comp Neurol. 488, 290-319 (2005).
- Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29, 745-757 (2007).
- Hinsch, K., Zupanc, G. K. Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis. Neuroscience. 146, 679-696 (2007).
- Lindsey, B. W., Darabie, A., Tropepe, V. The cellular composition of neurogenic periventricular zones in the adult zebrafish forebrain. J Comp Neurol. 520, 2275-2316 (2012).
- Marz, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58, 870-888 (2010).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240, 2221-2231 (2011).
- Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223, 131-147 (2013).
- Ayari, B., El Hachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon. J Neurotrauma. 27, 959-972 (2010).
- Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis. Glia. 60, 343-357 (2011).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Dis Model Mech. 5, 200-209 (2012).
- Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Dev Cell. 23, 1230-1237 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138, 4831-4841 (2011).
- Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338, 1353-1356 (2012).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Shin, J., Park, H. C., Topczewska, J. M., Mawdsley, D. J., Appel, B. Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics. Methods Cell Sci. 25, 7-14 (2003).
- Armant, O., et al. Genome-wide, whole mount in situ analysis of transcriptional regulators in zebrafish embryos. Dev Biol. 380, 351-362 (2013).
