Abstract
Adoptiv overføring av patogen-spesifikke T-celler kan brukes til å forebygge og behandle opportunistiske infeksjoner slik som cytomegalovirus (CMV) infeksjoner som forekommer etter allogen hematopoietisk stamcelletransplantasjon. Virusspesifikke T-celler fra allogene donorer, inkludert tredjeparts givere, kan formeres ex vivo i samsvar med gjeldende Good Manufacturing Practice (cGMP), syssels gjentatte runder med antigen-drevet stimulering til selektivt forplante ønskede T-celler. Identifisering og isolering av antigen-spesifikke T-celler kan også bli foretatt basert på den cytokin capture system av T-celler som er blitt aktivert for å utskille gamma-interferon (IFN-γ). Imidlertid har utbredt human anvendelse av cytokinet fangstsystem (CCS) for å gjenopprette immunitet vært begrenset som produksjonsprosessen er tidkrevende og krever en erfaren operatør. Utviklingen av en andre generasjons mobil berikelse enhet som CliniMACS Prodigy någjør det mulig for forskere å generere viral-spesifikke T-celler ved anvendelse av et automatisert, mindre arbeidskrevende system. Denne enheten skiller magnetisk merket celler fra umerkede celler ved hjelp av magnetisk aktivert celle sortering teknologi for å generere klinisk grad av produkter, er konstruert som et lukket system, og kan nås og drives på benkeplate. Vi viser driften av den nye automatiske celle anrikning anordning for å produsere CMV pp65-spesifikke T-celler oppnådd fra en steady-state-aferese produkt oppnådd fra en CMV-seropositiv giver. Disse isolerte T-celler kan så direkte infundert i en pasient under institusjonell og føderale tilsynet. Alle bio-prosesstrinn, inkludert fjerning av røde blodceller, er stimulering av T-celler, separasjon av antigen-spesifikke T-celler, rensing og vasking helautomatisk. Enheter som dette øke muligheten for at T-celler for mennesker søknad kan produseres utenfor dedikert Good Manufacturing Practice (GMP) Fasiliteter og i stedet bli produsert i blodbankfasiliteter hvor personalet kan føre tilsyn automatiserte protokoller for å produsere flere produkter.
Introduction
Hematopoietisk stamcelletransplantasjon (HSCT) 1 kan kombineres med adoptive T-celle-terapi for å forbedre graft-versus-tumor effekt og for å tilveiebringe immunitet til opportunistiske infeksjoner 2. Generering av antigen-spesifikke donor-avledet T-celler til infusjon har historisk kreves dyktig personell og bruk av spesialiserte anlegg som er GMP-kompatibel. Leveringen av slike T-celler har resultert i oppløsning for opportunistiske infeksjoner 3, så vel som behandling av den underliggende malignitet 4. Nylig har forskere vist at adoptiv overføring av bare noen få tusen virus-spesifikke T-celler (1 x 10 ~ 4 - 2,5 x 10 5 celler / kg mottakerkroppsvekt) kan med hell å behandle opportunistiske CMV-infeksjoner etter allogen HSCT 5-9. Et begrenset antall GMP anlegg med tilhørende dyktige produksjonskrav og høye kostnader forbundet med celleproduksjon har imidlertid restricted pasienten tilgang til lovende T-cellen terapi 10. En fremgangsmåte for å isolere antigen-spesifikke T-celler er basert på CCS ved hjelp av en bi-spesifikt reagens for å gjenkjenne CD45 og IFN-γ. Som vist, kan denne metode benyttes til å generere klinisk grad av CMV-spesifikke T-celler ved anvendelse av en automatisk celle anrikning CCS-enheten (figur 1B).
CMV-spesifikke T-celler er generert ved inkubering av overlappende peptider fra CMV pp65 antigen med leukaferese totale atom celler (TNC) fra CMV-seropositive givere. Disse peptidene, som vises i sammenheng med human leukocytt antigen (HLA), aktivere CMV pp65-spesifikke T-celler i TNC til å utskille IFN-γ. Disse T-cellene kan deretter bli "fanget" og magnetisk separert. Driften av den første generasjon celle anrikning anordning (figur 1 A) som er nødvendig personell faglærte i cellekultur under GMP forhold, og koordinering av ansatte til å foreta flere sTeps nødvendig for å generere en "fanget" produkt.
Prosedyren vanligvis kreves 10 til 12 timer med kontinuerlig drift, og derfor personell sannsynlig trenger å jobbe i løpet av to skift i GMP anlegget. Disse begrensningene er nå unngås ved gjennomføring av et andre-generasjons anordning (vist i figur 1 B). Denne anordning foretar magnetisk anrikning, lik den første genereringsinnretningen, men automatiserer andre aspekter ved CCS i en unbreached tilnærming. Dette reduserer belastningen på GMP lag som de fleste av trinnene kan oppnås uten tilsyn av ansatte betydelig. Videre, siden anordningen virker som et lukket system, antigen-spesifikke T-celler kan fanges opp og behandlet på Borstemmaskin unntatt trinnene involvert i leukaferese isolering og fremstilling av materialer før instrumentet. Detaljer om komplett instrumentering og funksjonaliteten til denne andre generasjons mobil berikelse enheten har blitt pubblert 11.
Her beskriver vi fremgangsmåten for å berike CMV pp65 spesifikke T-celler fra en steady-state aferese produkt ved hjelp av automatiserte celle berikelse CCS systemet. Når isolert, kan disse CMV-spesifikke T-celler umiddelbart bli infusert inn i en pasient.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av materialer under sterile forhold (Se Materialer og utstyr Table)
- Forbered 3 liter PBS / EDTA-buffer supplert med humant serumalbumin (HSA) til en sluttkonsentrasjon på 0,5% (w / v).
- Tilbered en L pose av klinisk kvalitet 0,9% natriumklorid (NaCl) løsning og to L GMP klasse cellekulturmedium.
- Forbered 60 nmol av CMV-spesifikke peptidantigen cocktail ved rekonstituering ett hetteglass med CMV pp65 med 8 ml sterilt vann.
- Overfør CMV pp65 peptid cocktail i et 50 ml volum frysepose ved hjelp av en Luer / Spike forbindelse og klemmen med låse tang for å unngå etterfølgende fordeling av cocktail inn i røret settet. Åpne celler anrikning rør set (TS 500) under sterile betingelser.
- Bruk steril tubing sveiser, koble peptid cocktail frysepose inn i røret tilkobling for ventil 2 av rør sett TS 500. Ikke åpne peptid cocktail posen klemmen på dette tidspunktet.
- Fjern 1 x 10 9 TNC starter porøse produkt og suspendere i PBS / EDTA-buffer inneholdende 2,5% HSA til et totalt volum på 50 ml. Injiser porøse produkt inn i en 150 ml overføringspose.
2. Utarbeidelse og bruk av automatiserte Cell Enrichment System (Se Materialer og utstyr Table)
- Slå på cellen berikelse system (figur 1B) og velg programmet "CCS_IFN-γ berikelse". Observere et brukergrensesnitt som viser skjermer med instruksjoner og bilder guiding operatøren gjennom prosedyren.
- Skriv inn parameter "Operator" og "Tubing Set P / N Nei". Deretter installerer du Tubing Set 500 til automatisert celle berikelse enhet i henhold til instruksjonene som vises på den interaktive skjermen.
- Følg den trinnvise instruksjoner som vises på skjermen for å koble medium og buffere til enheten. Record katalognummer og lot-nummer av reagenser før connecting til instrumentet.
- Etter den siste sjekken av slangen sett, åpne klemmen av peptidet cocktail bag. Åpne medium posen og igangsette automatisk fylling av slangen settet.
- Etter grunningstrinn er avsluttet, utfyller HSA (2,5%) i NaCl-buffer i en pose (200 ml) ved hjelp av den sterile rør sveiser. Overfør starter cellular produktet inn i "Application bag" med sterile rør sveiser.
- Koble CCS (IFNy) reagenser til respektive rør via adaptere. Skriv inn ønsket tid til å samle en brøkdel av cellemateriale før berikelse prosessen. Gjennomgang og bekrefte riktigheten av alle data / parametere angitt. Starte prosessen.
- Før starten av automatiserte celle berikelse prosessen, fjerne Quality Control Bag (QCB, inneholder originale fraksjonen (ori) ca 1,3 ml av 100 ml kammer innhold fortynnet med PBS / EDTA buffer). Tett QCB, veie, og oppbevares ved 4 ° C.
- Start enrichment prosessen. Ved slutten av prosessen, vil målceller elueres med et omtrentlig volum av elueringsbuffer fra reservoaret posen.
- Tett Non Target Cell Bag (NTCB, negativ brøkdel = neg) og Target Cell Bag (TCB, positiv brøkdel = pos) og veie hver pose. Vektene vil bli benyttet senere for beregning av celletall.
- Umiddelbart etter anrikningsfremgangsmåten samle to porsjoner pr fraksjon for strømningscytometri-analyse, og lagre resten av prøvene ved 4 ° C. Bruke en prøvealiquot for celletall bestemmelse og den andre prøvealiquot for anriking ytelsesanalyse (tabell 1).
- Fjern slangen satt fra cellen berikelse instrument. Overfør loggfilen til en USB-stasjon for fremtidig bruk.
MERK: Alle reagenser skal utarbeides under sterile forhold. Bruken av en biosikkerhet type II panseret er sterkt anbefalt. Bruk steady-state-aferese porøse produkt (non-mobilisert) isolert fra en friskCMV-seropositive donor å berike CMV antigen spesifikke T-celler. Eneste FDA godkjent HSA bør brukes. Bufferen for cellepreparat bør holdes på 19 ° C til 25 ° C, da lavere eller høyere temperaturer vil resultere i redusert renhet og et redusert utbytte av målcellene.
3. Cell Count Bestemmelse
- Ta alikvoter av QCB, NTCB og TCB for celletall, som vist i tabell 1. Tilsett CD45-VoBlue til hver aliquot (titer 1:11) og inkuberes i mørke i 10 min ved 4 ° C.
- Tilsett 1,5 ml nyfremstilt røde blodcellelyse løsning (1x) til den opprinnelige fraksjon og negativ fraksjon, 450 pl nyfremstilt røde blodcellelyseløsning til den positive fraksjon, og inkuber alle fraksjoner i 15 minutter ved RT.
- Like før analyse, legge propidiumjodid til en sluttkonsentrasjon på 1 ug / ml (1: 100 fortynning av 100 ug / ml). Bruk automatisk celleteller å bestemme celletall og vievne. Bruk celleteller enhet anbefalte programvare for flowcytometri analyse. Bestem de absolutte tellinger av leukocytter for originale, negative og positive fraksjoner.
MERK: legemer levedyktige leukocytter per ml av prøvene som er tatt for legemer analyse bestemmes ved hjelp av celle analysator anbefalte programvare. - Angi region som vist i figur 2 (region 5, levedyktige leukocytter). Bruk følgende gating strategi for å bestemme celletall. En levedyktig leukocytt i original fraksjon er vist i figur 2.
- De angitte områder (figur 2, 1-6) er hierarkisk som følger:
1: Tid gate → 2: Enkeltceller → 3: CD45 + celler → 4: leukocytter (rusk ekskludert) → 5: Levedyktige leukocytter → 6: Levedyktige lymfocytter - Gjenta samme fremgangsmåte for å bestemme celletall for negative og positive fraksjoner. Beregn celletall av hele fraksjonenved å vurdere fortynningsmidlet faktor på prøven og totale volum av fraksjon (tabell 2).
4. Undersøkelse av Separation Ytelse
- Vask porsjoner av QCB, NTCB og TCB fraksjons celler med pre-kjølt PBS / EDTA buffer / 0,5% AB serum. Sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C og supernatanten aspireres.
- Resuspender celler i 100 mL antistoff-fluorokrom farging blanding som inneholder: CD3-FITC, CD4-APC, CD8-APC-Vio770, CD14-PerCP, CD20-PerCP, CD45-VioBlue og anti-IFNy-PE (titer 1:11) og inkuberes i mørket i 10 minutter ved 4 ° C.
- Tilsett 1 ml nyfremstilt røde blodcellelyse løsning (1x) og inkuberes i 15 min ved RT. Sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C og supernatanten aspireres. Resuspender cellene i et tilstrekkelig volum av PBS / EDTA buffer / 0,5% AB serum.
- Legg propidiumjodid til en sluttkonsentrasjon på 1 ug / ml umiddelbart før analyse (1: 100 fortynningenepå fra 100 ug / ml). Utføre strømningscytometri-analyse for å vurdere renheten av prøven.
- Brukes følgende gating strategi for å beregne CD3 + T-celler i levedyktig leukocytt gating strategi for bestemmelse av CD3 + T-celler er vist i positiv fraksjon etter CCS anrikningsprosessen. De angitte områder (figur 3A og 3B, 1-6) er forbundet hierarkisk som følger:
1: Tid gate → 2: Enkeltceller → 3: CD45 + celler → 4: Celler (rusk ekskludert) → 5: Levedyktige leukocytter → 6: Levedyktige CD3 + celler befolknings - Bestemme frekvensene av CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN γ-+ og CD8 + IFN γ-+ T-celler etter CCS anrikningsprosessen (tabell 2).
- Bruk gating strategi for å bestemme frekvensen av CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN γ-+ og CD8 + IFN γ-+ T-celler er vist nedenfor feller en original og beriket (fanget) positive brøkdel etter CCS prosessen. De angitte områdene er hierarkisk knyttet og navngitt som følger:
1: Tid gate → 2: Enkeltceller → 3: CD45 + celler → 4: Celler (rusk ekskludert) → 5: Levedyktige Leukocytter → 6: Levedyktige CD3 + celler → 7: CD4 + celler → 7a: CD4 + IFN- γ + celler (boks) → 8: CD8 + celler → 8a: CD8 + IFN-y + celler (boks)
MERK: De første 6 angitte områder i hierarkiet koblinger er det samme som figur 3, (1-6) og sist 2 regioner er vist i figur 4 (6-8a).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne studien ble en automatisert celle anrikning CCS System som brukes for automatisert produksjon av pp65 CMV-spesifikke T-celler. CMV-spesifikke T-celler ble anriket fra tre-aferese celleprodukter. Steady-state aferese produktet ble høstet i løpet av 2 timer fra en CMV-seropositive donor og genererte 10 10 totale atomceller (TNC). 10 9 TNC ble deretter aktivert med pp65 CMV-avledede peptider (60 nmol) i 4 timer og IFN-γ sekreterende T-celler ble isolert ved hjelp av CCS på automatisert celle berikelse enhet. En operatør som var nødvendig ved begynnelsen av forsøket for å laste alle reagensene og slangesett. Oppsett av systemet fra den første utpakking å starte enheten tok cirka 60 til 120 min. Merk at maskinen kan da programmeres til å starte etter at reagenser og slangesett er lastet og dermed muliggjør at maskinen skal fungere uten tilsyn (for eksempel over natten). Operatøren var nødvendig igjen etter 15 timer til å utføre karakterisering avsluttprodukter celle renhet og levedyktighet. Etter anrikning cellesupernatanten ble screenet for mycoplasma og endotoksin tilstedeværelse. Etter validering, kan de behandlede cellene skal infunderes direkte til pasienter eller kryopreserveres for senere søknader.
Celletall ble bestemt etter celletelle standard praksis ved hjelp av de formler som er gitt i Tabell 2. Hver type celletall ble gjentatt tre ganger, og resultatene ble uttrykt som gjennomsnittlig total celletelling med standardavvik (SD). Rapportene ble deretter analysert ved hjelp av celle analysator anbefalte programvare. Gating å bestemme levedyktige leukocytter og lymfocytter er vist i figur 2. Dataene for de celleantallet er vist i tabell 3. Den gating strategien anvendt for å bestemme IFN-y + T-celler er vist i Figur 3 og Figur 4. Før berikelse, den levedyktigheten for cellene ble rutinemessig> 95%. Etter enrichment, levedyktigheten av celler var <50%. Den absolutte telling av IFN-γ + T-celler ble målt før og etter berikelse prosessen. Det totale antall av IFN-y + T-celler før anrikning var 1,14 x 10 6 ± 0,35 x 10 6 som er avledet fra 10 9 starter TNC, og etter berikelse var 3,09 x 10 5 ± 1,70 x 10 5 IFN-y + T-celler. Det var 0,16 ± 0,18% IFN-γ + CD4 + -T-celler til stede før behandling, og dette økte til 47,5 ± 34,7% etter anrikning. Renheten prosentandel av CD8 + IFN-γ + T-celler før fangst var 0,47 ± 0,1% og økte til 90,3 ± 1,7% etter anrikning (tabell 3 og 4). Prøvegjenvinning i det innfangede (positiv) fraksjon var 32,9 ± 15,7% for CD4 + T-celler og 31,8 ± 13,2% for CD8 + T-celler basert på måling av IFN-y + T-celler i sta rting befolkningen (tabell 4). Disse dataene tyder på at både CD4 + og CD8 + CMV pp65-spesifikke T-celler kan høstes automatisk på en måte som er egnet for deres human anvendelse.
Figur 1. Anriking av CMV-spesifikke T-celler ved hjelp av CCS-systemet. (A) Flere behandlingstrinn involvert i den første generasjonen celle berikelse enhet blir håndtert av dyktige fagfolk. (B) De fleste av de behandlingstrinn, med unntak av første tubing oppsett, er automatisert i andre generasjon cellen anrikning anordning som lagrer 10 - 12 timer for operatøren behandlingstiden i sammenligning med den første genereringsinnretningen. De anrikede CMV-virus-spesifikke T-celler er karakterisert ved strømningscytometri cellen analysator. > Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. gating strategi som brukes til å bestemme levedyktige T-celler. Tallene 1 til 6 viser tilsvarende gating hierarkiet domene i figuren. (1) Sette opp tid gate, (2) Fjerning doublet celler ved å plotte FSC-høyde mot FSC-området (3) Identifisere CD45 + celler, (4) Fjerne celleavfall (5) Valg av levedyktige leukocytter og (6) Levedyktige lymfocytter fra opprinnelige befolkningen ved propidiumjodidfarging. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
belastning / 52808 / 52808fig3.jpg "/>
Figur 3. gating strategi som brukes for å bestemme CD3 + T-celler. Strømningscytometri blot analyse av CD3 + T-celler før (3A) og etter (3B) celle berikelse er vist her. Det er viktig å bestemme hvor mange CMV-spesifikke peptid-aktiverte T-celler er til stede i prøvene før og etter berikelse prosessen. I denne figur, tallene 1 til 6 angir den tilsvarende cellepopulasjon, enten etter størrelse eller farget med et spesifikt antistoff. (1) Justering av tidsporten, (2) Fjerning av doublet celler, (3) Valg av CD45 + -celler, (4) Fjerning av cellerester (5) Valg av levedyktige leukocytter og (6) Levedyktig CD3 + lymfocytter. Propidiumjodidfarging ble utført for å fjerne døde celler./52808fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. gating strategi som brukes for å bestemme renheten av IFN-γ + T-celler. Aktivert CMV-spesifikke T-celler er viktig for styring av CMV-infeksjon, så IFN-γ + ekspresjon på T-celler ble brukt for gating. IFN-y + T-celler blant CD4 + og CD8 + -undergrupper (A) før anrikning og (B) etter anrikning. (7/8) Prosent av CD4 + T-celler og CD8 + T-celler er vist i A og B (7a. ) Prosent av CD4 + IFN-y + T-celler er vist i firkantet boks (a) i løpet av portstyringsområdet og tilsvarende for C D8 + IFN-γ + T-celler i (8a). "T" representerer% av celler i total populasjon og "#" representerer% av cellene i gated befolkningen. Propidiumjodidfarging ble utført for å port ut døde celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1. Volumene av fraksjonene som brukes for cellefarging strategi.
Tabell 2. formler som benyttes for beregning av CD4 + IFN-γ + T-celler etter anrikningsprosessen. Beregning av CD8 + IFN-γ + T-celler blir utført på samme måte.
Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Tabell 3. Totalt celler i T-celle undergrupper før og etter berikelse. Prøve nr 1 resultater er vist her.
Tabell 4. Renhet og gjenvinning av IFN-γ + T-celle før og etter berikelse Fremgangsmåte ifølge prøve nr 1.
Tabell 5. Celle sortering strategier anvendes ved isolering av klinisk kvalitet CMV-antigenspesifikke T-celler. 5
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Adoptiv T-celleterapi har dukket opp som et levedyktig alternativ til å behandle B-cellemaligniteter 4. Dets terapeutiske potensialet er avhengig av å tilføre det ønskede antall mål antigenspesifikke T-celler som mangler replikative senescens 2. Dette kan oppnås ved å sortere ut en ren populasjon av antigenspesifikke T-celler fra ekspanderte T-cellene i samsvar med gjeldende Good Manufacturing Practices. To sorteringsprosedyrer er utbredt, nemlig fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) og magnetisk aktivert cellesortering (MACS) for å generere CMV antigenspesifikke T-celler som vi nylig har gjennom 5. Fordelen med å bruke en strategi over den andre er beskrevet i tabell 5. MACS-teknologi gir den høyeste celle berikelse renhet på en billigere og raskere måte enn FACS-teknologi. I tillegg bruk av engangs søyler og reagenser for celle berikelse hindrer helt prøven til prøvekontaminering gjør detlettere å søke i kliniske settinger. Den semi-automatisert celle anrikning anordning er arbeidskrevende og tidkrevende slik at utviklingen av automatiserte cellen anrikning anordning var det nødvendig å mate klinisk behov.
Den automatiserte celle anrikning CCS-enheten er en allsidig instrument for å isolere kliniske klasse celler slik som hematopoetiske stamceller, somatiske stamceller, i tillegg til T-celler for adoptiv overføring. Denne automatiserte anordning integrerer cellebehandling, herunder fraksjonering av utgangsmateriale, vask celle, celleseparasjon, cellekultur, og endelig produktdannelse i en engangs GMP-kompatibel disponibel enhet. Det lukkede systemet reduserer clean-rommet krav og minimerer operatør engasjement for å opprettholde GMP fasiliteter. Automatisering reduserer den tid som er nødvendig for en operatør som kan være tilstede og dermed redusere kostnadene forbundet med disse laboratorieprosedyrer.
For å validere den automatiserte celle berikelse enhet, sammenlignetmed den semi-automatisert celle berikelse enhet, vi isolert CMV-spesifikke T-celler etter inkubering av pp65 CMV-peptider med en aferese produkt. GMP grade CMV pp65-avledet peptid cocktail (f.eks PepTivator) er et peptid basseng som hovedsakelig består av 15 monomeren-peptider med 11 aminosyrer overlapper hverandre, som dekker den fullstendige sekvensen til pp65 proteinet av human cytomegalovirus. Prøvegjenvinning Utbyttet var 0,3 x 10 ~ 6 CD3 + IFN-y + T-celler fra 10 9 TNC. Kliniske studier har vist at å tilføre noen få tusen CMV-spesifikke T-celler som profylaktisk behandling av pasienter (~ 360 til 4000 celler / kg kroppsvekt) som gjennom HSCT resulterte i beskyttelse mot CMV. For eksempel, for å behandle CMV i kliniske studier ved bruk av denne teknologien, en 70 kg voksen og et barn 30 kg tilsynelatende krever bare 0,26 - 3,0 x 10 5 x 10 og en fire - 1,2 x 10 5 celler, henholdsvis, av Virus- spesifikke T-celler 12-15 et al., 13. Et høyere antall levedyktige celler vil også være akseptable, da dette vil være forbundet med tilstrekkelig materiale for forskjellige infusjoner. Men betyr mer levedyktige celler generelt også flere andre enn T-celler (B, NK, etc) celler. Våre data viser at CMV-spesifikke T-celler som genereres på den automatiserte celle anrikning system resulterte i klinisk-tiltalende antall av CMV-spesifikke T-celler som kan så bli tilført etter allogen HSCT.
CMV infeksjon kan være et stort problem etter HSCT resulterer i både økt sykelighet og dødelighet. Videre er CMV infeksjon assosiert med økte kostnader, til tross for nylige fremskritt i tidlig diagnose og tidlig behandling med antivirale legemidler 16. Den nåværende behandling ved hjelp av ganciklovir og foscarnet kan føre til toksisitet i medisinsk-skjøre mottakere av HSCT.Add-back av donor-avledet CMV-spesifikke T-celler har vist seg å forebygge og behandle opportunistiske infeksjoner hos mottakere av allogene HSCT 9. Denne tilnærmingen for adoptiv immunterapi er også blitt anvendt for å bidra til å gjenopprette immunitet mot andre patogener, slik som Epstein-Barr-virus (EBV), adenovirus 8, og Aspergillus 3 ved inkubering av mononukleære celler (MNC) med respektive antigen avledet klinisk klasse peptid cocktail reagenser ( Materialer og utstyr bord). Nylig har forskere sikkert tilført tredjeparts patogen-spesifikke T-celler som er matchet med i det minste en HLA allel i mottakerens presentere immunodominant peptid 17. Den automatiserte celle berikelse CCS-systemet kan også brukes til å generere tredjeparts T-celler for off-the-sokkel applikasjoner som vil være nyttig når donor er CMV-seronegative eller utilgjengelig, slik som tilfellet er med givere for allogen navlestrengsblod transplantatipå.
Oppsummert kan vi demonstrere nytten av en automatisert celle berikelse enhet for å generere CMV-spesifikke T-celler basert på automatisering av CCS. Vi tror at denne anordning har potensial til å senke terskelen for kliniske lagene å sette mot patogen-spesifikk, så vel som tumorspesifikke T-celler i immunsvekkede pasienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Både MD Anderson Cancer Center og Dr. Cooper har en økonomisk interesse i ZIOPHARM Oncology, Inc., og Intrexon Corporation. 7. mai 2015 ble Dr. Cooper utnevnt som administrerende direktør ved ZIOPHARM Oncology. Dr. Cooper er nå en Visiting Scientist ved MD Anderson. Dr. Cooper grunnla og eier InCellerate, Inc. Han har patenter med Sangamo biovitenskap med kunstige nukleaser. Han rådfører seg med Targazyme, Inc. (tidligere amerikanske Stamceller, Inc.), GE Healthcare, Ferring Pharmaceuticals, Fate Therapeutics, Janssen Pharmaceuticals, og Bristol-Myers Squibb. Han er på Scientific Advisory Board of Cellectis. Han mottar Godtgjørelse fra Miltenyi Biotec.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 700-29 | |
| CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-182 | |
| 5 L waste bag | Miltenyi Biotec GmbH | 110-004-067 | |
| CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) | Miltenyi Biotec GmbH | 279-01 | |
| Albumin (Human) 25% | Grifols | 58516-5216-2 | |
| Luer/Spike Interconnector | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-701 | |
| 0.9 % NaCl Solution (1 L) | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| MACS GMP PepTivator HCMV pp65 | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-109 | |
| Water for injections | Hospira, inc, Lake Forest, IL | NDC-0409-4887-10 | |
| MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm | Millipore | SLGV033RB | |
| TexMACS GMP Medium 2 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-306 | |
| Transfer Bag, 150 ml (for cellular starting material) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-301 | |
| CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec GmbH | 200-074-400 | |
| 60 ml Syringes, sterile | BD, Laagstraat, Temse, Belgium | 309653 | |
| CMV sero positive apheresis product | Key Biologics, LLC, Memphis | ||
| Flow Cytometry Materials | Manufacturer | Catalog number | |
| AB Serum, GemCell | Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA | 100-512 | |
| CD3-FITC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-080-401 | |
| CD4-APC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-033 | |
| CD8-APC-Vio770 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-065 | |
| CD14-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-072 | |
| CD20-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-077 | |
| CD45-VioBlue | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-136 | |
| aIFN-γ-PE, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-940 | |
| CD3-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-374 | |
| Propidium Iodide Solution (100 µg/ml) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-233 | |
| Equipment | Manufacturer | Catalog Number | |
| CliniMACS Prodigy Device | Miltenyi Biotec GmbH | 200-075-301 | |
| Software V1.0.0.RC | |||
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-343 | |
| Software 2.4 | |||
| Centrifuge 5415R | Eppendorf AG | 22331 | |
| Cellometer K2 | Nexelom Bioscience, Lawrence, MA | LB-001-0016 | |
| Sterile tubing welder SCDIIB | Terumo Medical Corp., Elkton, MA | 7811 |
References
- Syed, B. A., Evans, J. B. From the Analyst's Couch Stem Cell Therapy Market. Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 185-186 (2013).
- Maus, M. V., et al. Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses. Annu Rev Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Kumaresan, P. R., et al. Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).
- Singh, H., et al. Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 68 (8), 2961-2971 (2008).
- Kumaresan, P. R., et al. Automating the manufacture of clinically appealing designer T cells. Treatment Strategies-BMT. (1), Available from: http://www.cambridgeresearchcentre.co.uk/all-publications/blood-and-marrow-transplantation/ 55-59 (2014).
- Einsele, H., et al. Adoptive transfer of CMVpp65-peptide loaded DCs to improve CMV-specific T cell reconstitution following allogeneic stem cell transplantation. Blood. 100 (11), 214a-214a (2002).
- Blyth, E., et al. Donor-derived CMV-specific T cells reduce the requirement for CMV-directed pharmacotherapy after allogeneic stem cell transplantation. Blood. 121 (18), 3745-3758 (2013).
- Gerdemann, U., et al. Safety and clinical efficacy of rapidly-generated trivirus-directed T cells as treatment for adenovirus, EBV, and CMV infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant. Mol Ther. 21 (11), 2113-2121 (2013).
- Meij, P., et al. Effective treatment of refractory CMV reactivation after allogeneic stem cell transplantation with in vitro-generated CMV pp65-specific CD8+ T-cell lines. J Immunother. 35 (8), 621-628 (2012).
- Lee Buckler, J. Enal Razvi,. Rise of Cell-Based Immunotherapy : Personalized Medicine Takes Next Step Forward. Genetic Engineering & Biotechnology News. 33 (5), 12-13 (2013).
- Apel, M., et al. Integrated Clinical Scale Manufacturing System for Cellular Products Derived by Magnetic Cell Separation, Centrifugation and Cell Culture. Chem-Ing-Tech. 85 (1-2), 103-110 (2013).
- Brestrich, G., et al. Adoptive T-Cell Therapy of a Lung Transplanted Patient with Severe CMV Disease and Resistance to Antiviral Therapy. Am J Transplant. 9 (7), 1679-1684 (2009).
- Feuchtinger, T., et al. Clinical grade generation of hexon-specific T cells for adoptive T-cell transfer as a treatment of adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. J Immunother. 31 (2), 199-206 (2008).
- Peggs, K. S., et al. Directly selected cytomegalovirus-reactive donor T cells confer rapid and safe systemic reconstitution of virus-specific immunity following stem cell transplantation. Clin Infect Dis. 52 (1), 49-57 (2011).
- Tischer, S., et al. Rapid generation of clinical-grade antiviral T cells: selection of suitable T-cell donors and GMP-compliant manufacturing of antiviral T cells. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 336 (2014).
- Svahn, B. M., Remberger, M., Alvin, O., Karlsson, H., Ringden, O. Increased Costs after Allogeneic Haematopoietic Sct Are Associated with Major Complications and Re-Transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 18 (2), S339-S339 (2012).
- Leen, A. M., et al. Multicenter study of banked third-party virus-specific T cells to treat severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 121 (26), 5113-5123 (2013).
