Abstract
肠子 - 包含在身体任何器官的免疫细胞的数量最多 - 经常暴露于外来抗原，无论是微生物和饮食。鉴于越来越理解是，这些管腔抗原帮助塑造免疫反应和免疫细胞的教育中肠为数字全身性疾病的关键，已经在表征肠道免疫系统的兴趣增加。然而，许多已发表的协议是艰苦和耗时的。我们在这里提出一个简化的协议用于从小肠固有，上皮内层，和淋巴集结是快速的，可重复，并且不需要费力的Percoll梯度淋巴细胞的隔离。虽然该协议着重于小肠，它也适用于结肠的分析。此外，我们突出一些方面中，可能需要额外的优化取决于特定科学疑问句化。这种方法导致了大量可行的淋巴细胞，可以随后用于流式细胞术分析或表征备用装置的隔离。
Introduction
小肠的主要任务通常被认为是营养物1的消化和吸收。虽然这种代谢功能显然必不可少的，小肠具有在保护宿主免受内腔2内发现的环境抗原的持续拦河坝同样显著作用。肠道隔开外界（ 例如 ，管腔抗原）从主机的使用本身是只有一个单一的电池层厚的上皮细胞层的内部环境。这样，小肠道免疫系统具有平衡其为反应性的阈值，允许从饮食和共生微生物外来抗原以最小的进入黏膜，如果有的话，免疫反应而安装对抗入侵的病原体和强大的响应的艰巨任务其他“有害的”抗原。到这些抗原过度或不适当的免疫应答可导致病理疾病（ 如 ，inflamma托里肠炎，I型糖尿病，多发性硬化），必须避免3-6。
总体而言，在胃肠道被认为代表在体内最大的免疫器官，含有在所有抗体分泌细胞7的70％。小肠道免疫系统由3个主要的隔层-固有层（LP）时，上皮内层和Peyer氏斑（PPS） -每个包含淋巴细胞2的独特基团。在LP淋巴细胞（LPLs）主要TCRαβ+ T细胞以〜20％的B细胞;上皮内淋巴细胞（IELs）包含极少的B细胞与更多的TCRγδ+ T细胞比TCRαβ+ T细胞;和PPS，它们是嵌入在小肠壁次级淋巴器官，包含〜80％的B细胞。虽然这些解剖区域的稍有不同的功能和本体论基础，他们在发挥作用啊armonized时尚，以防止致病性侮辱的主机。
此外，有越来越多的赞赏菌群对肠道免疫系统的发展的关键因素，随着识别特定的微生物和特定的细胞谱系8,9的个体发育之间的同源关系。此外，鉴于肠道免疫系统的教育影响解剖学远处的免疫应答（ 例如 ，关节炎，多发性硬化症，肺炎），它已经很清楚，在肠道免疫系统的发展是有关多疾病过程比先前识别10 -12。这样，在定量评估肠道免疫系统的兴趣已扩展超出宿主 - 病原体相互作用现在包括主机共生相互作用和许多全身性疾病的发病机制，以及。
定在当前的方法的可变性肠淋巴细胞隔离，即对产量，活力，和一致性优化同时平衡所需要的时间是越来越重要的方法。涉及的Percoll梯度协议是时间和劳动力密集型的，而且可能更容易出现人为错误，导致可变的产量和存活率13。在此，我们提供了淋巴细胞的所有3小肠道免疫车厢分离和鉴定优化的协议。此外，在粘膜免疫系统微生物引起的改变给出越来越大的兴趣，我们包括可用于允许微生物小鼠之间的水平传播，以评估这些变化如何定量影响肠道免疫系统的步骤。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有研究均按照机构动物护理和使用委员会（IACUC）在哈佛医学院，符合由美国协会为实验动物科学（AALAS）设定的标准，兽药受到严格的审查和指导原则进行的。
1.通过合房细菌的水平传输（可选）
- 为了尽量减少外源性污染（特别是如果采用悉生只），实行无菌技术操作，而组装一次性无菌笼子，用食物和都被蒸压水。
- 使用耳钻或标签单独标记6周龄C57BL / 6小鼠窝藏不同microbiotas，并在同一个笼子里容纳他们。由于老鼠是食粪，吃从笼底粪便颗粒，微生物自然会水平的小鼠之间传输。
- 联合家鼠为≥1一周，以便有时间分析前微生物转移和免疫学变化。 从小肠上皮内层和固有层单细胞悬液的2.准备工作
- 溶液的制备
- 制备提取介质（每小肠）：30毫升RPMI + 93微升5％（重量/体积）二硫苏糖醇（DTT）+ 60微升的0.5M EDTA +500μl的胎牛血清（FBS）。临用前加入DTT。
- 准备消化介质（每小肠）：25毫升RPMI + 12.5毫克分散酶+ 37.5毫克胶原酶II + 300微升FBS。在使用之前立即加入中性蛋白酶和胶原酶。
- 为在37℃，prewarm溶液至37℃下进行所有温育。
- 安乐死用CO 2窒息之后颈脱位鼠标。
- 将鼠标背侧向下和喷雾用70％乙醇的腹部。用剪刀依次切开皮肤，然后腹膜筋膜沿腹中线来回进行剖腹手术m为耻骨联合至剑突过程，从而暴露腹腔。
- 用剪刀由横切幽门括约肌以从胃小肠分开。轻轻地从腹膜取出小肠，挑逗走肠系膜脂肪。
- 要完全删除小肠，使在回肠盲肠交界处第二晋级。放置分离小肠入冷水（ 即 ，4℃）含有10％FBS的RPMI以最大化细胞生存力。
- 轻轻地取出用弯钳大块脂肪。请小心，以避免撕破肠道组织本身，而试图去除脂肪。
- 要除去肠内容物，轻轻冲洗肠，15 - 用固定在一个注射器18G的喂食针20ml冷的PBS。
- 用剪刀切除PPS，并将它们放入含5％FBS冷RPMI。聚苯硫醚位于小肠的系膜侧，并且显示为多叶状白色肿块。根据具体的菌株，鼠标通常具有8 - 12的PP。
- 切小肠进入3 - 4寸段。
- 通过滚动与RPMI浸湿的纸巾各小肠段，用手术刀沉闷挑逗脂肪从组织上卸下剩余的脂肪。
- 通过cannulating与弯钳的肠段与抓取组织的远端转动而外组织。然后用一对直镊子轻轻地去除从弯钳（在近端处开始）的组织段，导致在组织中被反转。
- 将组织细分装有30ml萃取媒介和搅拌棒的杯子。固定在杯子上的盖子，并在37℃下以500rpm搅拌15分钟;搅拌应该是轰轰烈烈，但没有动荡。
- 孵化后，用滤网钢从含有上皮上清液，它应该出现混浊分离组织块。该上清包含了我ntraepithelial淋巴细胞可以进一步分析，如果需要的话，通过进行到过滤在步骤2.18的样品 - 2.23。
- 手动搅动RPMI组织块洗去残留的萃取介质。
- 放在干燥的纸巾组织翻转结束在结束了几次，以便卸下不是由萃取介质解放残留粘液。
- 放置组织片段在1.5ml管600微升的消化培养基。
- 用剪刀将剁碎的组织块，直到不再粘在剪刀和解决方案出现均匀。这个步骤是关键的，以确保组织的完整酶消化。
- 碎小肠添加到含25毫升消化媒体一杯。搅拌在500rpm在37℃下30分钟。半路通过消化（ 即 ，15分钟），吸管上下用血清吸管来帮助打破组织的任何大块。
- 过滤消化的组织（或epith从步骤2.12 elial层如果处理IELs）通过100微米的细胞过滤到50ml管中。冲洗用20ml的RPMI含有10％FBS的过滤器。
- 离心在500 xg离心在4℃下经过滤的溶液10分钟。
- 小心倒出上清，重悬沉淀在1ml的RPMI含有10％FBS。
- 过滤悬浮细胞通过40微米的细胞滤网到50毫升管中。冲洗过滤用20ml的RPMI含有10％FBS。
- 离心机在4℃下过滤溶液，在500×g离心10分钟。
- 小心倒出上清，重新悬浮颗粒在1毫升的RPMI含2％FBS。
- 转移切除百分点至一个杯子用25毫升消化媒体和搅拌棒。安全盖，并在500rpm，10分钟旋在37℃。
- 滤波器消化的PP通过40微米的细胞滤网到50毫升管中。如果有任何团块REMA在使用从1ml注射器柱塞的平端压它们通过过滤器。
- 冲洗过滤器，用10ml的RPMI含有10％FBS。
- 离心机在4℃下过滤溶液，在500×g离心10分钟。
- 小心倒出上清，重新悬浮颗粒在1毫升的RPMI含2％FBS。
- 细胞的等分试样适当体积（ 例如 ，200微升LPLs的）到96孔圆底板。
- 离心机在500×g离心在4℃下5分钟。通过倒转板倒出上清液。
- 悬浮细胞在90微升含有2％FBS的RPMI中，并以1：100稀释的抗CD16 / 32（Fc的块）。孵育在4℃下10分钟。
- 加10μlPBS。离心机在500×g离心在4℃下5分钟。通过倒转板倒出上清液。
- 悬浮细胞在250微升PBS中。离心机在500×g离心在4℃下5分钟。弃去上清液反相板。
- （可选的）染色细胞存活率染料，如果需要，通过按照制造商的协议。
- 在100μl1％福尔马林悬浮细胞以固定细胞。孵育在4℃下在黑暗中1小时。
- 加入200μlPBS。离心机在500×g离心在4℃下5分钟。通过倒转板倒出上清液。
- 悬浮细胞在250微升PBS中。离心机在500×g离心在4℃下5分钟。通过倒转板倒出上清液。
- 悬浮细胞在200μlPBS中。分析使用流式细胞仪的细胞。
3.单细胞悬液的制备从淋巴集结
4.表面染色的流式细胞仪
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
流的小肠淋巴细胞的单细胞悬浮液的流式细胞仪分析应该产生具有向前相似和侧向散射特征的脾细胞（ 图1A和1B）细胞的离散人口。淋巴细胞可开始死亡如果在隔离的初始阶段的组织不保持在4℃，导致淋巴细胞群具有较低的前向散射和是更难以从其他上皮细胞和死细胞分离（ 图1C） 。此外，如果小肠组织没有被完全清洁的其肠系膜脂肪，有实质上的淋巴细胞（ 图1D）的完全丧失。这些特点说明了如何快速地工作（ 即 ，不允许组织热身），并注重细节（ 即 ，除去即使少量的肠系膜脂肪）是必要的，以确保样品的质量。 TypicaLLY，我们得到〜对于小肠LPLs（ 图1E）80％存活率。
图2A展示了如何微生物群的组合物能极大地影响特定细胞群的编号。正如我们以前已经表明，无菌（GF）小鼠，这是完全没有任何微生物，有一个小肠道免疫系统，相比于无特定病原体（SPF）小鼠为明显稚嫩，GF小鼠的定植与在小肠道免疫系统14恢复正常小鼠微生物群（MMB）的结果。与此相反，限菌的小鼠携带一个正常人微生物群（HMB） -和具有相似的数量和粪便细菌作为MMB小鼠多样性-具有小肠道免疫系统，是从该GF小鼠14的没有区别。
趁着小鼠的食粪性，合房小鼠一起表示允许小鼠之间的生物体水平传播一个简单而有效的方法。该方法允许一个测试在菌群所得变化是否影响小肠的免疫系统。作为一个例子，我们表明与MMB小鼠共壳体HMB小鼠4周导致CD3 + CD8 + T细胞的SI LP（ 图2B）14数的正常化。这个结果证实，在图2A中观察到MMB和HMB小鼠之间的差异是由于在这些小鼠之间的菌群变化-变型是由共同壳体克服小鼠在一起。
图1.肠道淋巴细胞有FSC和SSC特性，以一个脾细胞相似- ðD.OT图描绘SSC和FSC用于最佳制备脾细胞（A）和小肠固有层（SI LP）细胞（B - D）。 B的SI LP样本是根据所描述的方案制备。 C的肠组织被有意温热至证明SI LP细胞开始具有较低的FSC。 D的肠系膜脂肪没有被清除掉之前制备单细胞，导致一个可辨别的SI LP淋巴细胞群的损失小肠。 E.在B组中所描述的样品在步骤4.7可以解决的可行性染料根据制造商的说明染色（ 如 ，eFluor 780）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.小INTEST的菌群影响成熟INAL免疫系统。A. CD3 + CD8 + T细胞的SPF，MMB，HMB和GF小鼠的SI LP进行了列举。 B. HMB小鼠共安置与MMB小鼠4周的SI LP枚举的 CD3 + CD8 + T细胞之前。没有共同的安置和MMB HMB小鼠进行了分析比较。每个数据点代表一个独立的鼠标和水平条反映的平均值。 NS，不显著; *，P <0.05; **，P <0.01; ***，P <0.001。图转载，经许可，从参考14，与B的轻微的修改，请点击此处查看该图的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我们提出了一个协议，用于分离和流动的小肠淋巴细胞，包括LPLs，IELs，并在PPS淋巴细胞术表征。对于那些有兴趣在评估中微生物的变化如何影响小肠的免疫系统，我们详细介绍参与小鼠窝藏不同microbiotas之间的生物体的水平传播的简单步骤。虽然该协议的重点是小肠，该过程是用于大肠的分析是相同的，唯一的区别是，有没有的PP去除（尽管结肠补丁都存在，这些通常不是严重可见）。
有来自小肠组织淋巴细胞达到最佳的隔离几个关键步骤。细致去除脂肪组织，是确保细胞活力和最佳产量绝对关键的。此外，DTT是在提取中使用的关键的粘液溶解的上皮细胞。鉴于其性质不稳定，我们建议在≤-20℃储存5％的溶液的单次使用的等分试样，而不是重新冻结任何未使用的卷。虽然EDTA在采样介质用于在去除上皮细胞15的帮助，它的存在-以及过量的FBS或粘液-在消化过程中能抑制胶原酶。胶原酶使用的浓度已经证明差异影响表面标记表达和细胞活力13,16,17。此外，根据所感兴趣的表面标记，它可以是胶原酶的不同制剂（ 例如 ，胶原酶I，II，VI或VIII）是最佳的13,17。一些经验优化可以根据具体的实验问题，并且由于大量的对大量变异，具体很多和胶原酶的相对活性水平是必需的。此外，附加的优化可以根据特异性需要IC应变和鼠标的年龄使用。例如，这里所列出的时间已为6〜周龄C57BL / 6小鼠进行了优化;为1〜8个周龄的瑞士韦伯斯特小鼠，消化时间可能会增加至40分钟。
总之，我们已经提供了的小肠淋巴细胞固有层，上皮内层和PPS隔离的详细协议。一旦掌握了，我们可以合理地处理4只小鼠，并在〜4小时准备好染色的单细胞悬浮液。尽管我们描述了这些细胞的直接染色流式细胞表征，可以替代地刺激这些细胞，以评估细胞因子的产生，排序为转录和/或蛋白质组分析中，或培养细胞的细胞来看待在体外与其他细胞类型的相互作用。此外，虽然我们针对在淋巴细胞群体，该协议也可以被用于检查骨髓细胞。总之，这种简化的方法来隔离单CE从各种肠室LL种群允许一个询问两个如何各种因素（ 例如 ，微生物群，膳食抗原）影响肠道免疫系统的个体发育以及如何这些细胞可以是在肠道外疾病相关。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Gloves | Kimberly-Clark | 555092 | |
| sterile mouse cage | Innovive | MS2-AD | contains lid, cage bottom, and alpha-dri bedding |
| Metal feeder | Innovive | M-FEED | |
| Water bottle | Innovive | M-WB-300 | |
| Card holder | Innovive | CRD-HLD-H | |
| Autoclavable rodent chow (NIH-31M) | Zeigler | 4131207530 | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | 11875-119 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Ambion | AM9262 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GemBio | 100-510 | |
| Dispase II | Invitrogen | 17105-041 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 1.878 U/mg |
| Collagenase, type II | Invitrogen | 17101-015 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 245 U/mg |
| Dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Feeding needle (18 G, 2" length) | Roboz | FN-7905 | |
| 10 ml Syringe | BD | 305482 | |
| PBS | Gibco | 14190-250 | |
| Disposable Scalpel (15 blade) | Miltex | 4-415 | |
| Curved forceps | Roboz | RS-5211 | |
| Straight forceps | Roboz | RS-5132 | |
| Multi-purpose cups, 120 ml | VWR | 89009-662 | |
| Stir bar | VWR | 58949-062 | |
| Multi-position stir plate, 9-position | VWR | 12621-048 | |
| Stainless steel conical strainer, 3 inch | RSVP | ||
| 1.5 ml Tube | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 100 μm Cell strainer | Falcon | 08-771-19 | |
| 40 μm Cell strainer | Falcon | 08-771-1 | |
| 50 ml Conical tube | Falcon | 352098 | |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 96-well Plate, round-bottom | Corning | 3799 | |
| Anti-mouse CD16/32 (Fc block) | Biolegend | 101320 | |
| (Optional) Fixable viability dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-18 | |
| 10% Formalin, neutral buffered | Thermo Scientific | 5725 |
References
- Cummings, D. E., Overduin, J. Gastrointestinal regulation of food intake. J Clin Invest. 117 (1), 13-23 (2007).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14 (10), 667-685 (2014).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (5), 313-323 (2009).
- Sartor, R. B. Microbial influences in inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 134 (2), 577-594 (2008).
- Tlaskalova-Hogenova, H., et al. Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases. Immunol Lett. 93 (2-3), 97-108 (2004).
- Wen, L., et al. Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes. Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue distribution of lymphocytes and plasma cells and the role of the gut. Trends Immunol. 29 (5), author reply 209-210 206-208 (2008).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. The yin yang of bacterial polysaccharides: lessons learned from B. fragilis PSA. Immunol Rev. 245 (1), 13-26 (2012).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. Deciphering the tete-a-tete between the microbiota and the immune system. J Clin Invest. 124 (10), 4197-4203 (2014).
- Gauguet, S., et al. Intestinal microbiota of mice influences resistance to Staphylococcus aureus pneumonia. Infect Immun. , (2015).
- Ochoa-Reparaz, J., et al. A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease. Mucosal Immunol. 3 (5), 487-495 (2010).
- Wu, H. J., et al. Gut-residing segmented filamentous bacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17 cells. Immunity. 32 (6), 815-827 (2010).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Chung, H., et al. Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota. Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).
- Resendiz-Albor, A. A., Esquivel, R., Lopez-Revilla, R., Verdin, L., Moreno-Fierros, L. Striking phenotypic and functional differences in lamina propria lymphocytes from the large and small intestine of mice. Life Sci. 76 (24), 2783-2803 (2005).
- Carrasco, A., et al. Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa. J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
