Abstract
आंतों - जो शरीर में किसी भी अंग की प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संख्या सबसे अधिक होते हैं - लगातार विदेशी एंटीजन, दोनों माइक्रोबियल और आहार के संपर्क में हैं। एक बढ़ती हुई समझ है कि इन ल्यूमिनल एंटीजन मदद प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की है कि शिक्षा के आकार के भीतर आंत प्रणालीगत रोगों के एक नंबर के लिए महत्वपूर्ण है को देखते हुए, वहाँ आंतों प्रतिरक्षा प्रणाली निस्र्पक में दिलचस्पी बढ़ा दी गई है। हालांकि, कई प्रकाशित प्रोटोकॉल कठिन और समय लेने वाली हैं। हम यहाँ छोटे आंत्र लामिना propria, अंतःउपकला परत, और Peyer पैच कि, तेजी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और श्रमसाध्य Percoll ढ़ाल की आवश्यकता नहीं है से लिम्फोसाइटों के अलगाव के लिए एक सरल प्रोटोकॉल उपस्थित थे। हालांकि प्रोटोकॉल छोटी आंत पर केंद्रित है, यह भी पेट के विश्लेषण के लिए उपयुक्त है। इसके अलावा, हम कुछ पहलुओं है कि विशिष्ट वैज्ञानिक सवाल के आधार पर अतिरिक्त अनुकूलन की जरूरत हो सकती है पर प्रकाश डालाtion। यह दृष्टिकोण व्यवहार्य लिम्फोसाइट की बड़ी संख्या है कि बाद में प्रवाह cytometric विश्लेषण या लक्षण वर्णन के वैकल्पिक साधन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का अलगाव में यह परिणाम है।
Introduction
छोटी आंत का मुख्य कार्य अक्सर पाचन और पोषक तत्वों के अवशोषण 1 माना जाता है। इस चयापचय समारोह स्पष्ट रूप से आवश्यक है, छोटी आंत पर्यावरण एंटीजन लुमेन 2 के भीतर पाया की नित्य बैराज से मेजबान की रक्षा करने में एक समान रूप से महत्वपूर्ण भूमिका है। आंत्र पथ बाहर की दुनिया को अलग करती है (जैसे।, ल्यूमिनल एंटीजन) एक उपकला परत है कि केवल एक ही सेल परत मोटी के साथ मेजबान के आंतरिक वातावरण से। जैसे, छोटे-आंतों प्रतिरक्षा प्रणाली जेट के लिए अपनी सीमा यदि कोई हो, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया संतुलन, कम से कम के साथ म्यूकोसा में प्रवेश के लिए आहार और खानेवाला रोगाणुओं से विदेशी एंटीजन की इजाजत दी, जबकि हमलावर रोगज़नक़ों और के खिलाफ एक मजबूत प्रतिक्रिया बढ़ते दुर्जेय काम है अन्य "हानिकारक" एंटीजन। इन एंटीजन को अत्यधिक या अनुचित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (वैकृत रोग के लिए नेतृत्व कर सकते हैं जैसे।, Inflammaइतिहास आंत्र रोग, मधुमेह प्रकार मैं, एकाधिक काठिन्य) और 3-6 से परहेज किया जाना चाहिए।
कुल मिलाकर, जठरांत्र पथ शरीर में सबसे बड़ा प्रतिरक्षा अंग का प्रतिनिधित्व करने के लिए, सभी प्रतिरक्षी कोशिकाओं स्रावित 7 के 70% से युक्त माना जाता है। लामिना propria (एलपी), अंतःउपकला परत, और Peyer पैच (पीपीएस) - - छोटे आंत्र प्रतिरक्षा प्रणाली 3 मुख्य डिब्बों के शामिल है कि प्रत्येक लिम्फोसाइट 2 के एक विशिष्ट समूह में शामिल है। एल.पी. लिम्फोसाइटों (LPLs) मुख्य रूप से ~ 20% बी कोशिकाओं के साथ TCRαβ + टी कोशिकाओं रहे हैं; अंतःउपकला लिम्फोसाइटों (IELs) TCRαβ + टी कोशिकाओं की तुलना में अधिक TCRγδ + टी कोशिकाओं के साथ बहुत कुछ बी कोशिकाओं होते हैं; और पी पी एस, जो माध्यमिक लसीकावत् छोटे-आंतों की दीवारों में एम्बेडेड अंग हैं, ~ 80% बी कोशिकाओं होते हैं। हालांकि इन संरचनात्मक क्षेत्रों में से प्रत्येक से थोड़ा अलग कार्यों और सात्विक कुर्सियां है, वे में कार्य आहarmonized फैशन रोगजनक अपमान से मेजबान की रक्षा के लिए।
इसके अलावा, वहाँ बढ़ रही सराहना की है कि माइक्रोबायोटा आंतों प्रतिरक्षा प्रणाली के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण निर्धारक, विशिष्ट रोगाणुओं और विशेष सेल प्रजातियों 8,9 के ontogeny के बीच आत्मीय रिश्ते की मान्यता में वृद्धि के साथ है। इसके अलावा, यह देखते हुए कि आंतों प्रतिरक्षा प्रणाली की शिक्षा anatomically दूर साइटों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रभावित करता है (जैसे।, गठिया, एकाधिक काठिन्य, निमोनिया), यह स्पष्ट हो गया है कि आंतों प्रतिरक्षा प्रणाली के विकास के लिए और अधिक रोग प्रक्रियाओं के लिए प्रासंगिक की तुलना में पहले 10 में मान्यता प्राप्त है -12। जैसे, मात्रात्मक आंतों प्रतिरक्षा प्रणाली का आकलन करने में दिलचस्पी अब मेजबान खानेवाला बातचीत और कई प्रणालीगत रोगों के रोगजनन को भी शामिल करने के लिए मेजबान रोगज़नक़ बातचीत से आगे बढ़ाया गया है।
में मौजूदा तरीकों की परिवर्तनशीलता को देखते हुएआंतों लिम्फोसाइटों के अलगाव, एक विधि है, जबकि समय की आवश्यकता संतुलन तेजी से महत्वपूर्ण है कि उपज, व्यवहार्यता, और स्थिरता के लिए अनुकूलित है। प्रोटोकॉल है कि Percoll ढ़ाल शामिल है, समय और श्रम गहन और संभवतः अधिक मानव त्रुटि से ग्रस्त हैं चर उपज के लिए अग्रणी और 13 व्यवहार्यता। इस के साथ साथ, हम सब 3 छोटे-आंतों प्रतिरक्षा डिब्बों से अलगाव और लिम्फोसाइटों के लक्षण वर्णन के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इसके अतिरिक्त, श्लैष्मिक प्रतिरक्षा प्रणाली में सूक्ष्म जीव प्रेरित परिवर्तन में दी बढ़ती रुचि है, हम कदम है कि चूहों के बीच सूक्ष्म जीवाणुओं की क्षैतिज संचरण का आकलन करने के लिए कैसे इन परिवर्तनों मात्रात्मक आंतों प्रतिरक्षा प्रणाली को प्रभावित करने के लिए अनुमति देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता शामिल हैं।
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Protocol
सभी अध्ययनों संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) हार्वर्ड मेडिकल स्कूल में है, जो पशु चिकित्सा मानकों प्रयोगशाला पशु विज्ञान के लिए अमेरिकन एसोसिएशन (AALAS) द्वारा निर्धारित मिलता है के अनुसार सख्त समीक्षा और दिशा निर्देशों के तहत आयोजित की गई।
1. सह-आवास के माध्यम से जीवाणु की क्षैतिज संचरण (वैकल्पिक)
- बहिर्जात प्रदूषण को कम करने के लिए (विशेष रूप से अगर gnotobiotic चूहों का उपयोग), सड़न रोकनेवाला तकनीक का अभ्यास बाँझ डिस्पोजेबल पिंजरों कोडांतरण जबकि, भोजन और पानी की है कि दोनों autoclaved दिया इस्तेमाल करते हैं।
- उपयोग कान घूंसे या टैग को व्यक्तिगत रूप से चिह्नित करने के लिए 6 सप्ताह पुरानी C57BL / 6 चूहों कि विभिन्न microbiotas बंदरगाह और उन्हें एक ही पिंजरे में घर। यह देखते हुए कि चूहों coprophagic हैं और पिंजरे मंजिल से मल छर्रों खाते हैं, रोगाणुओं स्वाभाविक रूप से चूहों के बीच क्षैतिज प्रेषित किया जाएगा।
- ≥1 सप्ताह के लिए सह-घर चूहों माइक्रोबियल हस्तांतरण और विश्लेषण करने से पहले immunologic बदलाव के लिए समय की अनुमति है। छोटे आंत्र अंतःउपकला परत और लामिना propria से एक एकल कक्ष निलंबन की 2. तैयारी
- समाधान की तैयारी
- निकासी मीडिया (छोटी आंत के अनुसार) तैयार: 30 मिलीलीटर RPMI + 93 μl 5% (w / v) dithiothreitol (डीटीटी) + 60 μl 0.5 एम EDTA + 500 μl भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)। उपयोग करने से पहले तुरंत डीटीटी जोड़ें।
- 25 मिलीलीटर RPMI + 12.5 मिलीग्राम Dispase + 37.5 मिलीग्राम collagenase द्वितीय + 300 μl FBS: (छोटी आंत के अनुसार) पाचन मीडिया तैयार करें। उपयोग करने से पहले तुरंत Dispase और collagenase जोड़ें।
- 37 डिग्री सेल्सियस 37 डिग्री सेल्सियस, prewarm समाधान पर प्रदर्शन सभी incubations के लिए।
- ग्रीवा अव्यवस्था के बाद सीओ 2 asphyxiation द्वारा माउस euthanize।
- माउस पृष्ठीय पक्ष नीचे रखें और स्प्रे 70% इथेनॉल के साथ पेट। क्रमिक रूप से इधर-उधर उदर midline के साथ त्वचा और फिर पेरिटोनियल प्रावरणी काटने से एक laparotomy प्रदर्शन करने के लिए कैंची का प्रयोग करेंजिफाएडा प्रक्रिया के लिए जघन सहवर्धन हूँ, इस प्रकार पेरिटोनियल गुहा को उजागर।
- जठरनिर्गम दबानेवाला यंत्र transecting द्वारा पेट से छोटी आंत अलग करने के लिए कैंची का प्रयोग करें। धीरे पेरिटोनियम से छोटी आंत को हटाने, mesenteric वसा दूर चिढ़ा।
- पूरी तरह से छोटी आंत निकालने के लिए, ileo-cecal जंक्शन पर एक दूसरे काट कर। ठंड में पृथक छोटी आंत की जगह (यानी।, 4 डिग्री सेल्सियस) RPMI 10% FBS युक्त सेल व्यवहार्यता को अधिकतम करने के लिए।
- धीरे घुमावदार संदंश का उपयोग वसा के बड़े टुकड़े को हटा दें। सावधानी बरतें आंतों के ऊतकों में ही फाड़ वसा को दूर करने की कोशिश कर रहा है, जबकि बचने के लिए।
- एक 18 जी खिला सुई एक सिरिंज से चिपका का उपयोग कर ठंड पीबीएस के 20 मिलीलीटर - 15 के साथ आंतों की सामग्री, धीरे फ्लश आंतों को दूर करने के लिए।
- पी पी एस आबकारी करने के लिए कैंची का उपयोग करें, और उन्हें ठंड 5% FBS युक्त RPMI में जगह है। पी पी एस छोटी आंत के antimesenteric ओर स्थित है और एक बहु lobulated सफेद के रूप में प्रकट कर रहे हैंसामूहिक। 12 पी पी एस - विशिष्ट तनाव के आधार पर, एक माउस आम तौर पर 8 है।
- 4 इंच खंडों - 3 में छोटी आंत कट।
- एक कागज तौलिया RPMI के साथ सिक्त पर प्रत्येक छोटे-आंतों खंड रोलिंग, एक सुस्त छुरी का उपयोग कर वसा ऊतकों से दूर तंग करने से अवशिष्ट वसा निकालें।
- घुमावदार संदंश के साथ आंतों खंडों cannulating और ऊतकों के बाहर का अंत लोभी द्वारा अंदर से बाहर ऊतक मुड़ें। फिर धीरे घुमावदार संदंश (समीपस्थ अंत में शुरुआत) से ऊतक खंड दूर करने के लिए, ऊतक उल्टे की जा रही है, जिसके परिणामस्वरूप सीधे संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें।
- एक कप निकासी मीडिया के 30 मिलीग्राम और एक हलचल बार युक्त ऊतक खंडों रखें। कप पर ढक्कन सुरक्षित है, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 500 rpm पर हलचल; सरगर्मी जोरदार लेकिन अशांत नहीं होना चाहिए।
- ऊष्मायन के बाद, एक स्टील झरनी का उपयोग उपकला युक्त सतह पर तैरनेवाला, जो बादल दिखाई देनी चाहिए से ऊतक के टुकड़े को अलग करने के लिए। इस सतह पर तैरनेवाला मैं शामिलntraepithelial लिम्फोसाइट कि आगे विश्लेषण किया जा सकता है, अगर कदम 2.18 में नमूना छानने के लिए आगे बढ़ने से, वांछित - 2.23।
- मैन्युअल अवशिष्ट निकासी मीडिया दूर धोने के लिए RPMI में ऊतक टुकड़े आंदोलन।
- एक सूखी कागज तौलिया पर ऊतक की जगह और फ्लिप यह कई बार अंत पर खत्म हो अवशिष्ट बलगम कि निकासी के मध्यम से मुक्त नहीं किया गया था को हटाने की सुविधा के लिए।
- पाचन माध्यम के 600 μl के साथ एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में ऊतक टुकड़े रखें।
- ऊतक कीमा जब तक टुकड़े नहीं रह कैंची से चिपके रहते हैं और समाधान समरूप प्रतीत होता कैंची का प्रयोग करें। यह कदम ऊतक की पूरी enzymatic पाचन सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है।
- एक कप पाचन मीडिया के 25 मिलीग्राम से युक्त करने के लिए कीमा छोटी आंत जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 500 rpm पर हिलाओ। आधे रास्ते के माध्यम से पाचन (15 मिनट पर अर्थात्।), Pipet और एक सीरम वैज्ञानिक pipet के साथ मदद करने के लिए नीचे ऊतक के किसी भी बड़ा हिस्सा टूट गया।
- फ़िल्टर पचा ऊतक (या epithकदम 2.12 से elial परत अगर प्रसंस्करण IELs) एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में एक 100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से। 10% FBS युक्त RPMI के 20 मिलीलीटर के साथ झरनी कुल्ला।
- फ़िल्टर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 500 XG पर समाधान अपकेंद्रित्र।
- ध्यान से 10% FBS युक्त RPMI के 1 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली छानना।
- फ़िल्टर एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से resuspended कोशिकाओं। 10% FBS युक्त RPMI के 20 मिलीलीटर के साथ झरनी कुल्ला।
- अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 500 XG पर समाधान फ़िल्टर।
- ध्यान से 2% FBS युक्त RPMI के 1 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला, और resuspend गोली छानना।
- स्थानांतरण पाचन मीडिया के 25 मिलीग्राम और हलचल पट्टी के साथ एक कप के लिए पी पी एस excised। सुरक्षित ढक्कन, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 500 rpm पर स्पिन।
- फ़िल्टर एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से पी पी एस पच। यदि किसी भी झुरमुटों Remaमें, एक 1 मिलीलीटर सिरिंज से सवार के फ्लैट अंत का उपयोग कर झरनी के माध्यम से उन्हें प्रेस।
- 10% FBS युक्त RPMI के 10 मिलीलीटर के साथ झरनी कुल्ला।
- अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 500 XG पर समाधान फ़िल्टर।
- ध्यान से 2% FBS युक्त RPMI के 1 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला, और resuspend गोली छानना।
- कोशिकाओं की अशेष उचित मात्रा (जैसे।, LPLs के 200 μl) एक 96 अच्छी तरह से दौर नीचे की थाली में।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर अपकेंद्रित्र। inverting थाली से सतह पर तैरनेवाला छानना।
- RPMI 2% FBS युक्त के 90 μl में Resuspend कोशिकाओं और एक 1: विरोधी CD16 / 32 (एफसी ब्लॉक) के 100 कमजोर पड़ने। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
- 10 μl पीबीएस जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर अपकेंद्रित्र। inverting थाली से सतह पर तैरनेवाला छानना।
- 250 μl पीबीएस में कोशिकाओं Resuspend। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर अपकेंद्रित्र। द्वारा छानना सतह पर तैरनेवालाप्लेट inverting।
- (वैकल्पिक) व्यवहार्यता डाई के साथ कोशिकाओं दाग, अगर वांछित, निर्माता प्रोटोकॉल का पालन करके।
- 100 μl 1% formalin में Resuspend कोशिकाओं कोशिकाओं को ठीक करने के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 1 घंटे के लिए सेते हैं।
- 200 μl पीबीएस जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर अपकेंद्रित्र। inverting थाली से सतह पर तैरनेवाला छानना।
- 250 μl पीबीएस में कोशिकाओं Resuspend। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर अपकेंद्रित्र। inverting थाली से सतह पर तैरनेवाला छानना।
- 200 μl पीबीएस में कोशिकाओं Resuspend। एक प्रवाह कोशिकामापी का उपयोग कोशिकाओं का विश्लेषण।
3. Peyer पैच से एक एकल कक्ष निलंबन की तैयारी
4. से फ्लो के लिए सतह धुंधला
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Representative Results
छोटे आंत्र लिम्फोसाइटों के एकल कक्ष निलंबन की cytometric विश्लेषण प्रवाह कोशिकाओं है कि के रूप में splenocytes (आंकड़े 1 ए और 1 बी) के आगे इसी तरह के और पक्ष तितर बितर विशेषताओं में से एक असतत आबादी उपज चाहिए। लिम्फोसाइट लिम्फोसाइट आबादी में जिसके परिणामस्वरूप एक कम आगे तितर बितर होने और अन्य उपकला और मृत कोशिकाओं से अलग करने के लिए और अधिक कठिन जा रहा है, अगर ऊतक अलगाव के प्रारंभिक चरणों के दौरान 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा नहीं है मरने के लिए शुरू हो सकता है (चित्रा 1 सी) । इसके अलावा, अगर छोटे आंत्र ऊतक पूरी तरह से अपनी mesenteric वसा की साफ नहीं है, वहाँ लगभग लिम्फोसाइटों (चित्रा -1) का एक पूरा नुकसान हुआ है। इन सुविधाओं को कैसे जल्दी से काम कर रहा है (यानी।, ऊतक को गर्म करने के लिए अनुमति नहीं है) और विस्तार पर ध्यान दे रही है (यानी।, Mesenteric वसा की भी थोड़ी मात्रा को हटाने) नमूना गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है वर्णन। typically, हम प्राप्त ~ छोटे आंत्र LPLs (चित्रा 1E) के लिए 80% व्यवहार्यता।
चित्रा 2A दर्शाता है कि कैसे माइक्रोबायोटा की संरचना बहुत विशेष सेल आबादी की संख्या को प्रभावित कर सकते हैं। हम पहले से प्रदर्शन किया है के रूप में, रोगाणु मुक्त (GF) चूहों, जो किसी भी सूक्ष्मजीवों का पूरी तरह से रहित हैं, एक छोटे से आंत्र प्रतिरक्षा प्रणाली है कि के रूप में विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त (एसपीएफ) चूहों की तुलना में स्पष्ट रूप से अपरिपक्व है, और GF चूहों के उपनिवेशन छोटे आंत्र प्रतिरक्षा प्रणाली को 14 वर्ष की बहाली में एक सामान्य माउस माइक्रोबायोटा (संदेश-बोर्ड) परिणामों के साथ। इसके विपरीत, gnotobiotic चूहों एक सामान्य मानव माइक्रोबायोटा (HMB) को शरण - और कि एक समान संख्या और संदेश-बोर्ड चूहों के रूप में मल बैक्टीरिया की विविधता है - एक छोटे से आंत्र प्रतिरक्षा प्रणाली है कि GF चूहों 14 के उस से पृथक है।
का लाभ उठानाचूहों के coprophagic प्रकृति, सह आवास चूहों को एक साथ चूहों के बीच जीवों की क्षैतिज संचरण की अनुमति के लिए एक सरल, अभी तक शक्तिशाली विधि का प्रतिनिधित्व करता है। इस दृष्टिकोण से एक है कि क्या माइक्रोबायोटा में जिसके परिणामस्वरूप परिवर्तन छोटे आंत्र प्रतिरक्षा प्रणाली को प्रभावित करता है परीक्षण करने के लिए अनुमति देता है। एक उदाहरण के रूप में, हम एसआई एलपी (चित्रा 2 बी) में 14 CD3 + सीडी 8 + टी कोशिकाओं की संख्या को सामान्य बनाने में हुई 4 सप्ताह के लिए संदेश-बोर्ड चूहों के साथ कि सह-आवास HMB चूहों का प्रदर्शन किया। इस परिणाम की पुष्टि करता है कि चित्रा 2A में मनाया संदेश-बोर्ड और HMB चूहों के बीच मतभेद इन चूहों के बीच माइक्रोबायोटा में बदलाव की वजह से है - बदलाव है कि चूहों को एक साथ सह-आवास से दूर कर रहे हैं।
डी। डी - चित्रा 1. आंतों लिम्फोसाइटों FSC और एसएससी लक्षण Splenocytes एक के समान हैओटी भूखंडों बेहतर तैयार splenocytes (ए) और छोटे आंत्र लामिना propria (एसआई एलपी) कोशिकाओं (बी - डी) के लिए एसएससी और एफएससी चित्रण। बी एसआई एल.पी. नमूना वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार किया गया था। सी आंतों के ऊतकों जानबूझकर को दिखाना है कि एसआई एल.पी. कोशिकाओं को एक कम एफएससी है शुरू गर्म करने के लिए अनुमति दी गई थी। डी mesenteric वसा छोटी आंत एकल कक्षों की तैयारी, एक नमूदार एसआई एल.पी. लिम्फोसाइट आबादी का नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप के लिए पहले से साफ नहीं किया गया था। ई नमूना पैनल बी में दर्शाया फिक्स व्यवहार्यता डाई के साथ कदम 4.7 में सना हुआ था (जैसे।, EFluor 780) निर्माता के निर्देशों के अनुसार। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. माइक्रोबायोटा प्रभावों छोटे-intest की परिपक्वताinal प्रतिरक्षा प्रणाली। ए CD3 + सीडी 8 + टी कोशिकाओं एसपीएफ, संदेश-बोर्ड, HMB, और GF चूहों के एसआई एल.पी. में प्रगणित थे। बी HMB चूहों सह रखे थे एसआई एल.पी. में CD3 + सीडी 8 + टी कोशिकाओं की गणना करने से पहले 4 सप्ताह के लिए संदेश-बोर्ड चूहों के साथ। संदेश-बोर्ड और HMB चूहों कि सह-रखे नहीं थे तुलना के लिए विश्लेषण किया गया। प्रत्येक डेटा बिंदु एक व्यक्ति माउस का प्रतिनिधित्व करता है, और क्षैतिज सलाखों मतलब दर्शाते हैं। एन एस, महत्वपूर्ण नहीं; *, पी <0.05; **, पी <0.01; ***, पी <0.001। आंकड़े reproduced-साथ कर रहे हैं अनुमति से संदर्भ 14, बी के मामूली संशोधन के साथ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
हम अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत और प्रवाह LPLs, IELs, और पी पी एस में लिम्फोसाइट सहित छोटे आंत्र लिम्फोसाइटों के cytometric विशेषता। का मूल्यांकन कैसे माइक्रोबायोटा में परिवर्तन छोटे आंत्र प्रतिरक्षा प्रणाली को प्रभावित करने में रुचि रखने वालों के लिए, हम विस्तार से सीधा अलग microbiotas शरण चूहों के बीच जीवों की क्षैतिज संचरण में शामिल कदम। हालांकि इस प्रोटोकॉल छोटी आंत पर केंद्रित है, प्रक्रिया फर्क सिर्फ इतना है निकालने के लिए कोई पी पी एस देखते हैं कि (हालांकि colonic पैच मौजूद हैं, ये आम तौर पर नहीं निहायत दिखाई दे रहे हैं) के साथ, बड़ी आंत के विश्लेषण के लिए एक ही है।
वहाँ छोटे-आंतों के ऊतकों से लिम्फोसाइटों के इष्टतम अलगाव को प्राप्त करने में कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। वसा ऊतकों की सावधानीपूर्वक हटाने बिल्कुल लिम्फोसाइट व्यवहार्यता और इष्टतम उपज सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, डीटीटी एक महत्वपूर्ण निकासी में प्रयोग किया जाता है mucolyticउपकला कोशिकाओं की। अपनी अस्थिर प्रकृति को देखते हुए, हम ≤ -20 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% समाधान के एकल उपयोग aliquots भंडारण और फिर से ठंड किसी भी अप्रयुक्त मात्रा सुझाव देते हैं। हालांकि EDTA उपकला कोशिकाओं 15 को हटाने में सहायता करने के लिए निकासी के माध्यम में प्रयोग किया जाता है, अपनी उपस्थिति - और साथ ही अतिरिक्त FBS या बलगम - पाचन प्रक्रिया के दौरान collagenase बाधित कर सकते हैं। कोलैजिनेज़ इस्तेमाल की एकाग्रता विभिन्न सतह मार्कर अभिव्यक्ति और सेल व्यवहार्यता 13,16,17 को प्रभावित करने के लिए प्रदर्शन किया गया है। इसके अलावा, ब्याज की सतह मार्कर पर निर्भर करता है, यह हो सकता है कि कोलैजिनेज़ का एक अलग सूत्रीकरण (जैसे।, Collagenase प्रकार मैं, द्वितीय, छठी, आठवीं या) इष्टतम 13,17 है। कुछ अनुभवसिद्ध अनुकूलन विशिष्ट प्रयोगात्मक सवाल पर निर्भर करता है और बहुत कुछ करने वाली बहुत भिन्नता, विशिष्ट बहुत कुछ है और collagenase के रिश्तेदार गतिविधि के स्तर के कारण, आवश्यक हो सकता है। इसके अलावा, अतिरिक्त अनुकूलन के आधार पर विशिष्ट आवश्यकता हो सकती हैआईसी तनाव और माउस की उम्र का इस्तेमाल किया। उदाहरण के लिए, कई बार यहाँ सूचीबद्ध एक ~ 6 सप्ताह पुरानी C57BL / 6 माउस के लिए अनुकूलित किया गया है; एक ~ 8 सप्ताह पुरानी स्विस वेबस्टर माउस के लिए, पाचन समय 40 मिनट के लिए बढ़ाया जा सकता है।
सारांश में, हम लामिना propria से छोटे आंत्र लिम्फोसाइट, अंतःउपकला परत, और पी पी एस के अलगाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान की है। एक बार जब महारत हासिल है, एक हद तक 4 चूहों की प्रक्रिया और एकल कक्ष निलंबन ~ 4 घंटा में धुंधला के लिए तैयार हो सकता है। हालांकि हम प्रवाह cytometric लक्षण वर्णन के लिए इन कोशिकाओं के तत्काल धुंधला का वर्णन है, एक वैकल्पिक रूप से, साइटोकाइन उत्पादन का आकलन अन्य प्रकार की कोशिकाओं के साथ इन विट्रो बातचीत को देखने के लिए ट्रांसक्रिप्शनल और / या प्रोटिओमिक विश्लेषण, या कोशिकाओं संस्कृति के लिए कोशिकाओं से हल करने के लिए इन कोशिकाओं को उत्तेजित कर सकते हैं। इसके अलावा, जब तक हम लिम्फोसाइट आबादी पर ध्यान केंद्रित, इस प्रोटोकॉल भी माइलॉयड कोशिकाओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एकल सीई को अलग-थलग करने के लिए साथ में ले ली, इस सुव्यवस्थित दृष्टिकोणदोनों कैसे विभिन्न कारकों (जैसे।, माइक्रोबायोटा, आहार एंटीजन) आंतों प्रतिरक्षा प्रणाली के ontogeny को प्रभावित करती है और यह भी कि कैसे इन कोशिकाओं अतिरिक्त आंत्र रोग में प्रासंगिक हो सकता है विभिन्न आंतों डिब्बों से करूँगा आबादी एक से पूछताछ करने की अनुमति देता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Gloves | Kimberly-Clark | 555092 | |
| sterile mouse cage | Innovive | MS2-AD | contains lid, cage bottom, and alpha-dri bedding |
| Metal feeder | Innovive | M-FEED | |
| Water bottle | Innovive | M-WB-300 | |
| Card holder | Innovive | CRD-HLD-H | |
| Autoclavable rodent chow (NIH-31M) | Zeigler | 4131207530 | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | 11875-119 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Ambion | AM9262 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GemBio | 100-510 | |
| Dispase II | Invitrogen | 17105-041 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 1.878 U/mg |
| Collagenase, type II | Invitrogen | 17101-015 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 245 U/mg |
| Dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Feeding needle (18 G, 2" length) | Roboz | FN-7905 | |
| 10 ml Syringe | BD | 305482 | |
| PBS | Gibco | 14190-250 | |
| Disposable Scalpel (15 blade) | Miltex | 4-415 | |
| Curved forceps | Roboz | RS-5211 | |
| Straight forceps | Roboz | RS-5132 | |
| Multi-purpose cups, 120 ml | VWR | 89009-662 | |
| Stir bar | VWR | 58949-062 | |
| Multi-position stir plate, 9-position | VWR | 12621-048 | |
| Stainless steel conical strainer, 3 inch | RSVP | ||
| 1.5 ml Tube | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 100 μm Cell strainer | Falcon | 08-771-19 | |
| 40 μm Cell strainer | Falcon | 08-771-1 | |
| 50 ml Conical tube | Falcon | 352098 | |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 96-well Plate, round-bottom | Corning | 3799 | |
| Anti-mouse CD16/32 (Fc block) | Biolegend | 101320 | |
| (Optional) Fixable viability dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-18 | |
| 10% Formalin, neutral buffered | Thermo Scientific | 5725 |
References
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