Abstract
De ingewanden - die het grootste aantal immuuncellen van elk orgaan in het lichaam te bevatten - worden voortdurend blootgesteld aan vreemde antigenen, zowel microbiële en dieet. Gegeven een beter begrip dat deze luminale antigenen meehelpen aan de immuunreactie en vorming van immuuncellen in de darm is essentieel voor een aantal systemische aandoeningen, is er toegenomen belangstelling voor het karakteriseren van de intestinale immuunsysteem. Echter, vele gepubliceerde protocollen lastig en tijdrovend. We presenteren hier een eenvoudige protocol voor de isolatie van lymfocyten uit de dunne darm lamina propria, intra-epitheliale laag en plaques van Peyer die snel, reproduceerbaar en vereist geen moeizame Percoll gradiënten. Hoewel het protocol staat de dunne darm, maar ook voor de analyse van de dikke darm. Bovendien zetten we enkele aspecten die extra optimalisatie kan nodig zijn afhankelijk van de specifieke wetenschappelijke wachtrijentie. Deze benadering resulteert in de isolatie van grote aantallen levensvatbare lymfocyten die vervolgens kan worden gebruikt voor flowcytometrische analyse of alternatieve wijze van karakterisering.
Introduction
De belangrijkste taak van de dunne darm wordt vaak beschouwd als de vertering en opname van voedingsstoffen 1 zijn. Hoewel deze metabole functie duidelijk essentieel, heeft de dunne darm een even belangrijke rol in de gastheer te beschermen tegen de voortdurende versperring van antigenen uit de omgeving binnen het lumen 2. Het darmkanaal scheidt de buitenwereld (bv., Luminale antigenen) uit de interne omgeving van de gastheer met een epitheellaag dat slechts één cel laag dik. Als zodanig, de dunne darm immuunsysteem de enorme taak van een sluitende drempel reactiviteit, waardoor vreemde antigenen uit de voeding en commensale bacteriën aan het slijmvlies voeren met minimale of geen immuunrespons tijdens het monteren een robuuste respons tegen binnendringende pathogenen en andere "schadelijk" antigenen. Overmatige of ongepaste immuunreacties op deze antigenen kunnen leiden tot een pathologische aandoening (bv., Inflammatory darmziekte, type I diabetes, multiple sclerose), en moet worden vermeden 3-6.
In het algemeen wordt het maagdarmkanaal beschouwd als de grootste immuun orgaan in het lichaam vertegenwoordigen, met meer dan 70% van antilichaam uitscheidende cellen 7. De kleine-intestinale immuunsysteem is opgebouwd uit 3 hoofdvakken - de lamina propria (LP), de intra-epitheliale laag en plaques van Peyer (PPS) - die elk bevat een opvallende groep van lymfocyten 2. De LP lymfocyten (LPLs) primair TCRαβ + T-cellen met ~ 20% B-cellen; intra-epitheliale lymfocyten (IELs) bevatten zeer weinig B-cellen meer TCRγδ + T cellen dan TCRαβ + T-cellen; en PP, die secundaire lymfoïde organen ingebed in de kleine darmwand zijn, bevatten ~ 80% B-cellen. Hoewel elk van deze anatomische gebieden heeft iets verschillende functies en ontologische bases, functioneren ze in aharmonized mode naar de host van pathogene beledigingen beschermen.
Verder groeit de waardering die de microbiota een bepalende factor voor de ontwikkeling van de intestinale immuunsysteem, met toenemende erkenning van de verwante relatie tussen specifieke microben en de ontogenie van bepaalde cellijnen 8,9. Aangezien bovendien vorming van de intestinale immuunsysteem beïnvloedt immuunresponsen in anatomisch afstand gelegen plaatsen (bv. Artritis, multiple sclerose, pneumonie), is gebleken dat de ontwikkeling van de intestinale immuunsysteem meer ziekteprocessen relevant is dan eerder opgenomen 10 -12. Als zodanig heeft interesse in kwantitatief beoordelen van de intestinale immuunsysteem verlengd tot na gastheer-pathogeen interacties om nu ook gastheer-commensaal interacties en de pathogenese van vele systemische ziekten ook.
Gezien de verschillen in de huidige methodenisolatie van intestinale lymfocyten, een methode die is geoptimaliseerd voor opbrengst, levensvatbaarheid en consistentie waarbij een evenwicht de benodigde tijd steeds belangrijker. Protocollen die Percoll gradiënten betrekken zijn tijd en arbeidsintensief en mogelijk meer kans op menselijke fouten, wat leidt tot variabele opbrengst en uitvoerbaarheid 13. Hierin geven we een geoptimaliseerd protocol voor de isolatie en karakterisering van lymfocyten uit alle 3 dunne darm immune compartimenten. Daarbij komt steeds meer belangstelling microbe-geïnduceerde veranderingen in het mucosale immuunsysteem, nemen we stappen die kunnen worden gebruikt om de horizontale overdracht van micro-organismen tussen muizen om te bepalen hoe deze veranderingen kwantitatief beïnvloeden de intestinale immuunsysteem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle studies werden uitgevoerd onder strikte toetsing en richtlijnen op basis van de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Harvard Medical School, waar de veterinaire normen van de American Association for Laboratory Animal Science (AALAS) in te stellen voldoet.
1. horizontale overdracht van bacteriën via Co-behuizing (optioneel)
- Om exogene besmetting te minimaliseren (in het bijzonder bij gebruik van gnotobiotische muizen), oefenen aseptische techniek tijdens het monteren steriele kooien, met behulp van voedsel en water dat beide zijn geautoclaveerd.
- Gebruik oor stoten of tags om individueel te markeren 6 weken oude C57BL / 6 muizen die verschillende microbiotas haven en huisvesten ze in dezelfde kooi. Omdat muizen Coprofagie eten fecale pellets uit de kooi vloer, microben vanzelf horizontaal doorgegeven tussen de muizen.
- Co-house muizen voor ≥1 week om tijd voor microbiële overdracht en immunologische veranderingen voorafgaand aan de analyse mogelijk te maken. 2. Bereiding van een suspensie van losse cellen van de Small-intestinale Intra-epitheliale Layer en Lamina Propria
- Voorbereiding van de Solutions
- Bereid extractiemedium (per dunne darm): 30 ml RPMI + 93 pl 5% (w / v) dithiothreitol (DTT) + 60 gl 0,5 M EDTA + 500 ul foetaal runderserum (FBS). Voeg de DTT onmiddellijk voor gebruik.
- Bereid spijsvertering media (per dunne darm): 25 ml RPMI + 12,5 mg dispase + 37,5 mg collagenase II + 300 ul FBS. Voeg de dispase en collagenase onmiddellijk voor gebruik.
- Voor alle incubaties uitgevoerd bij 37 ° C, voorverwarmen oplossingen tot 37 ° C.
- Euthanaseren de muis door CO 2 stikken, gevolgd door cervicale dislocatie.
- Plaats de muis dorsale zijde en spuit de buik met 70% ethanol. Gebruik een schaar om een laparotomie te voeren door achtereenvolgens het snijden van de huid en vervolgens peritoneale fascia langs de ventrale middellijn weerm de symphysis de processus xiphoideus, waardoor de peritoneale holte bloot.
- Knip met een schaar de dunne darm van de maag te scheiden door doorsnijden de pylorus sfincter. Verwijder de dunne darm van het buikvlies, plagen weg de mesenteriale vet.
- Om volledig verwijderen van de dunne darm, maak een tweede snede in het ileo-cecal kruising. Plaats de geïsoleerde dunne darm in koude (bijv., 4 ° C) RPMI dat 10% FBS om cellevensvatbaarheid te maximaliseren.
- Verwijder voorzichtig grote stukken vet met behulp van gebogen pincet. Wees voorzichtig om te voorkomen dat het scheurt darmweefsel zichzelf terwijl het proberen om vet te verwijderen.
- Om darminhoud, voorzichtig spoelen darmen te verwijderen met 15 - 20 ml koud PBS met behulp van een 18 G feeding naald bevestigd aan een injectiespuit.
- Gebruik een schaar om accijnzen PP's, en leg ze in koud RPMI dat 5% FBS. PP bevinden zich aan de antimesenteric zijde van de dunne darm en verschijnen als een multi-gelobde witmassa. Afhankelijk van de specifieke stam, een muis heeft meestal 8-12 PP.
- Snijd de dunne darm in 3-4 inch segmenten.
- Resten vet door rollen elke dunne darm segment op keukenpapier bevochtigd met RPMI, met een doffe scalpel om het vet van het weefsel plagen.
- Draai het weefsel in cannuleren door de intestinale segmenten gebogen pincet en grijpen het distaal uiteinde van het weefsel. gebruik dan een paar rechte tang verwijder de weefselsegment van de gebogen pincet (vanaf het proximale uiteinde), waardoor het weefsel wordt omgekeerd.
- Plaats weefsel segmenten in een beker met 30 ml van de winning media en een roerstaafje. Bevestig de deksel op de beker, en roer bij 500 rpm gedurende 15 min bij 37 ° C; roeren moet krachtig, maar niet turbulent zijn.
- Na incubatie, gebruik dan een stalen zeef om weefsel stukken scheiden van de epitheel-bevattende supernatant, die troebel moeten verschijnen. Deze supernatant bevat intraepithelial lymfocyten die verder kunnen worden geanalyseerd, desgewenst, door een filtering van het monster in stappen 2,18-2,23.
- Manueel in beweging de weefselstukken in RPMI om resterend extractiemedium wegspoelen.
- Plaats weefsel op een droge papieren handdoek en draai het einde meer dan een paar maal om de verwijdering van de resterende slijm dat niet werd bevrijd door de winning medium te vergemakkelijken.
- Plaats weefselfragmenten in een 1,5 ml buis met 600 ui digestiemedium.
- Gebruik een schaar om het weefsel te vermalen tot stukken niet langer vasthouden aan de schaar en de oplossing lijkt homogeen. Deze stap is essentieel om volledige enzymatische afbraak van het weefsel te verzekeren.
- Voeg gehakt dunne darm een kopje met 25 ml van de spijsvertering media. Roeren bij 500 rpm gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Halverwege de spijsvertering (bijv., 15 min), pipet op en neer met een serologische pipet te helpen breken elke grote brokken van weefsel.
- Filter verteerd weefsel (of epithEliel laag uit stap 2.12 wanneer de verwerking IELs) door een 100 micrometer cel zeef in een 50 ml buis. Spoel het filter met 20 ml RPMI met 10% FBS.
- Centrifugeer de gefilterde oplossing bij 500 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Decanteer supernatant en resuspendeer pellet voorzichtig in 1 ml RPMI met 10% FBS.
- Filter geresuspendeerde cellen door een 40 um cel zeef in een 50 ml buis. Spoel zeef met 20 ml RPMI met 10% FBS.
- Centrifugeer gefiltreerde oplossing bij 500 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- decanteren zorgvuldig supernatant en resuspendeer pellet in 1 ml RPMI met 2% FBS.
- Transfer uitgesneden PP naar een beker met 25 ml van de spijsvertering media en een roerstaafje. Veiligheidsafsluiting en centrifugeren bij 500 rpm gedurende 10 min bij 37 ° C.
- Filter verteerd PP's door een 40 um cel zeef in een 50 ml buis. Als er klontjes Remain, druk ze door de zeef met het platte uiteinde van de plunjer van een 1 ml spuit.
- Spoel zeef met 10 ml RPMI met 10% FBS.
- Centrifugeer gefiltreerde oplossing bij 500 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- decanteren zorgvuldig supernatant en resuspendeer pellet in 1 ml RPMI met 2% FBS.
- Aliquot zodanige hoeveelheid van cellen (bijv., 200 pl LPLs) in een 96 putjes ronde bodemplaat.
- Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet supernatant door het omkeren van de plaat.
- Resuspendeer cellen in 90 ui RPMI dat 2% FBS en een 1: 100 verdunning van anti-CD16 / 32 (Fc blok). Incubeer gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- Voeg 10 ul PBS. Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet supernatant door het omkeren van de plaat.
- Resuspendeer cellen in 250 ul PBS. Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet supernatant dooromkeren van de plaat.
- (Optioneel) Stain cellen met levensvatbaarheid kleurstof, indien gewenst, door volgens het protocol van de fabrikant.
- Resuspendeer cellen in 100 gl 1% formaline om de cellen te repareren. Incubeer gedurende 1 uur in het donker bij 4 ° C.
- Voeg 200 ul PBS. Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet supernatant door het omkeren van de plaat.
- Resuspendeer cellen in 250 ul PBS. Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet supernatant door het omkeren van de plaat.
- Resuspendeer cellen in 200 ul PBS. Analyseren cellen met een flow cytometer.
3. Voorbereiding van een enkele celsuspensie van Patches Peyer's
4. Surface kleuring voor flowcytometrie
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flow cytometrische analyse van enkelvoudige celsuspensies van dunne darm lymfocyten zou een discrete populatie van cellen die soortgelijke voorwaartse en zijwaartse verstrooiing karakteristieken als splenocyten (Figuren 1A en 1B) hebben verkregen. De lymfocyten kan beginnen te sterven als het weefsel tijdens de eerste stadia van de isolatie niet bij 4 ° C wordt gehouden, waardoor de lymfocyt populatie een onderste voorwaartse verstrooiing en zijn moeilijker te scheiden van andere epitheliale en dode cellen (figuur 1C) . Bovendien, als de kleine-darmweefsel niet volledig ontdaan van de mesenteriale vet, bijna volledig verlies van lymfocyten (figuur 1D). Deze kenmerken illustreren hoe snel werken (bijv., Niet waardoor het weefsel op te warmen) en aandacht voor detail (bijv., Het verwijderen van zelfs kleine hoeveelheden mesenteriale vet) moet sample kwaliteit. typically, krijgen we ~ 80% levensvatbaarheid van kleine-intestinale LPLs (figuur 1E).
Figuur 2A toont hoe de samenstelling van de microbiota sterk het aantal specifieke celpopulaties kunnen beïnvloeden. Zoals we al eerder aangetoond kiemvrije (GF) muizen, die volledig verstoken van elke micro-organismen, een dunne darm immuunsysteem dat sterk onvolwassen vergeleken met specifieke pathogeenvrije (SPF) muizen en kolonisatie van GF muizen met een normale muis microbiota (MMB) leidt tot herstel van de dunne darm immuunsysteem 14. Daarentegen gnotobiotische muizen die een normale menselijke microbiota (HMB) - en dat een vergelijkbaar aantal en de diversiteit van fecale bacteriën MMB muizen - een dunne darm immuunsysteem dat niet te onderscheiden van die van GF 14 muizen.
Voordeel nemen vande Coprofagie aard van muizen, co-housing muizen vertegenwoordigt samen een eenvoudige, maar krachtige methode voor het toestaan van horizontale overdracht van organismen tussen de muizen. Deze aanpak maakt het mogelijk om te testen of de daaruit voortvloeiende verandering van de microbiota invloed op de dunne darm immuunsysteem. Als voorbeeld hebben we aangetoond dat co-behuizing HMB muizen met MMB muizenmaagjes 4 weken resulteerde in normalisatie van het aantal CD3 + CD8 + T cellen in de SI LP (figuur 2B) 14. Dit resultaat bevestigt dat de verschillen tussen MMB en HMB muizen waargenomen in Figuur 2A gevolg van variaties in de microbiota tussen deze muizen - variaties die de muizen samen ondervangen door co-behuizing.
Figuur 1. Intestinale lymfocyten hebben FSC en SSC soortgelijke kenmerken Splenocyten A -. D. Dot plots beeltenis SSC en FSC voor optimaal voorbereid splenocyten (A) en kleine intestinale lamina propria (SI LP) cellen (B - D). B. De SI LP monster werd bereid volgens de beschreven protocol. C. Het darmweefsel werd opzettelijk opgewarmd aantonen dat SI LP cellen beginnen op een lagere FSC hebben. D. De mesenteriale vet werd niet schoongemaakt de dunne darm alvorens met enkele cellen, wat resulteert in het verlies van een waarneembare SI LP lymfocyt populatie. E. Het monster afgeschilderd in panel B werd gekleurd in stap 4.7 met fixeerbaar levensvatbaarheid kleurstof (bv., EFluor 780) volgens de instructies van de fabrikant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. De Microbiota Effecten rijping van de Small-INTESTrechtelijke immuunsysteem. A. CD3 + CD8 + T-cellen werden geteld in het SI LP SPF, MMB, HMB en GF muizen. B. HMB muizen werden samen gehuisvest met MMB muizenmaagjes 4 weken voor het opsommen CD3 + CD8 + T cellen in de SI LP. MMB en HMB muizen die niet werden samen ondergebracht werden geanalyseerd ter vergelijking. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt een individuele muis, en de horizontale balken geven de gemiddelde. NS, niet significant; *, P <0,05; **, P <0,01; *** P <0,001. De cijfers worden weergegeven-met toestemming-uit referentie 14, met een lichte wijziging van B. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We presenteren een protocol voor de isolatie en flow cytometrische karakterisatie van small-intestinale lymfocyten, met inbegrip van de LPLs, IELs en lymfocyten in de PP. Voor diegenen die geïnteresseerd zijn in de evaluatie van hoe veranderingen in de microbiota van invloed op de dunne darm immuunsysteem, we detail de eenvoudige stappen die betrokken zijn bij de horizontale overdracht van organismen tussen de muizen die verschillende microbiotas. Hoewel dit protocol is gericht op de dunne darm, de procedure is hetzelfde voor de analyse van de dikke darm, met als enige verschil dat er geen PP verwijderen (hoewel colon pleisters aanwezig zijn, zijn dit meestal geen grove toegankelijk).
Er zijn een aantal belangrijke stappen in het bereiken van optimale isolatie van lymfocyten van kleine-darmweefsel. Zorgvuldige verwijdering van vetweefsel is absoluut noodzakelijk om te zorgen voor levensvatbaarheid van de lymfocyten en een optimale opbrengst. Bovendien, DTT is een cruciaal mucolytisch gebruikt bij de extractievan epitheelcellen. Gezien de onstabiele aard, raden we het opslaan van single-use hoeveelheden van een 5% oplossing bij ≤ -20 ° C en niet opnieuw invriezen ongebruikte volume. Hoewel EDTA wordt gebruikt in het extractiemedium om te helpen bij het verwijderen van epitheelcellen 15, zijn aanwezigheid - alsmede overtollig FBS of slijm - kan tijdens het verteringsproces de collagenase remt. De concentratie van collagenase gebruikt is aangetoond verschillend beïnvloeden oppervlakte marker expressie en cellevensvatbaarheid 13,16,17. Bovendien, afhankelijk van het oppervlak merker van belang is kan het zijn dat een andere formulering van collagenase (bijv., Collagenase type I, II, VI of VIII) optimaal 13,17. Sommige empirische optimalisatie kan vereist zijn afhankelijk van de specifieke experimentele vraag alsmede wegens lot-to-lot variatie van de specifieke partij en relatieve activiteitsniveau van collagenase. Bovendien kunnen aanvullende optimalisatie nodig zijn, afhankelijk van de specific stam en leeftijd van de muis gebruikt. Zo hebben de hier genoemde tijden geoptimaliseerd voor een ~ 6 weken oude C57BL / 6 muis; een ~ 8 weken oude Zwitserse Webster muizen, kan de vertering tijd worden verhoogd tot 40 minuten.
Samengevat hebben we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van de dunne darm lymfocyten van de lamina propria, intra-epitheliale laag en PP ontvangen. Eenmaal onder de knie, kan men redelijkerwijs verwerken 4 muizen en hebben enkele cel suspensies gereed voor kleuring in ~ 4 uur. Hoewel de directe kleuring van deze cellen beschrijven flowcytometrische karakteriseren, kan men alternatief stimuleert deze cellen om cytokineproductie beoordelen cellen voor transcriptie en / of proteomische analyses, of de cellen te kweken sorteren te kijken in vitro interactie met andere celtypen. Bovendien, terwijl we ons gericht op de lymfocyt bevolking, dit protocol kan ook worden gebruikt om myeloïde cellen te onderzoeken. Bij elkaar genomen, deze gestroomlijnde aanpak van het isoleren van enkele cell populaties van diverse intestinale compartimenten kan men zowel ondervragen hoe verschillende factoren (bv., microbiota, dieet antigenen) die de ontogenie van de intestinale immuunsysteem en ook hoe deze cellen betrokken in extra-intestinale ziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Gloves | Kimberly-Clark | 555092 | |
| sterile mouse cage | Innovive | MS2-AD | contains lid, cage bottom, and alpha-dri bedding |
| Metal feeder | Innovive | M-FEED | |
| Water bottle | Innovive | M-WB-300 | |
| Card holder | Innovive | CRD-HLD-H | |
| Autoclavable rodent chow (NIH-31M) | Zeigler | 4131207530 | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | 11875-119 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Ambion | AM9262 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GemBio | 100-510 | |
| Dispase II | Invitrogen | 17105-041 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 1.878 U/mg |
| Collagenase, type II | Invitrogen | 17101-015 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 245 U/mg |
| Dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Feeding needle (18 G, 2" length) | Roboz | FN-7905 | |
| 10 ml Syringe | BD | 305482 | |
| PBS | Gibco | 14190-250 | |
| Disposable Scalpel (15 blade) | Miltex | 4-415 | |
| Curved forceps | Roboz | RS-5211 | |
| Straight forceps | Roboz | RS-5132 | |
| Multi-purpose cups, 120 ml | VWR | 89009-662 | |
| Stir bar | VWR | 58949-062 | |
| Multi-position stir plate, 9-position | VWR | 12621-048 | |
| Stainless steel conical strainer, 3 inch | RSVP | ||
| 1.5 ml Tube | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 100 μm Cell strainer | Falcon | 08-771-19 | |
| 40 μm Cell strainer | Falcon | 08-771-1 | |
| 50 ml Conical tube | Falcon | 352098 | |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 96-well Plate, round-bottom | Corning | 3799 | |
| Anti-mouse CD16/32 (Fc block) | Biolegend | 101320 | |
| (Optional) Fixable viability dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-18 | |
| 10% Formalin, neutral buffered | Thermo Scientific | 5725 |
References
- Cummings, D. E., Overduin, J.
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14 (10), 667-685 (2014).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (5), 313-323 (2009).
- Sartor, R. B. Microbial influences in inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 134 (2), 577-594 (2008).
- Tlaskalova-Hogenova, H., et al. Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases. Immunol Lett. 93 (2-3), 97-108 (2004).
- Wen, L., et al. Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes. Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue distribution of lymphocytes and plasma cells and the role of the gut. Trends Immunol. 29 (5), author reply 209-210 206-208 (2008).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. The yin yang of bacterial polysaccharides: lessons learned from B. fragilis PSA. Immunol Rev. 245 (1), 13-26 (2012).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. Deciphering the tete-a-tete between the microbiota and the immune system. J Clin Invest. 124 (10), 4197-4203 (2014).
- Gauguet, S., et al. Intestinal microbiota of mice influences resistance to Staphylococcus aureus pneumonia. Infect Immun. , (2015).
- Ochoa-Reparaz, J., et al. A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease. Mucosal Immunol. 3 (5), 487-495 (2010).
- Wu, H. J., et al. Gut-residing segmented filamentous bacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17 cells. Immunity. 32 (6), 815-827 (2010).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Chung, H., et al. Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota. Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).
- Resendiz-Albor, A. A., Esquivel, R., Lopez-Revilla, R., Verdin, L., Moreno-Fierros, L. Striking phenotypic and functional differences in lamina propria lymphocytes from the large and small intestine of mice. Life Sci. 76 (24), 2783-2803 (2005).
- Carrasco, A., et al. Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa. J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
