Abstract
Кишечник - которые содержат наибольшее количество иммунных клеток любого органа в теле - постоянно подвергаются чужеродные антигены, как микробного и диетического. Принимая во внимание все большее понимание того, что эти антигены просветные помогают формировать иммунный ответ и что образование иммунных клеток в кишечнике имеет решающее значение для целого ряда системных заболеваний, наблюдается повышенный интерес к характеризующая кишечной иммунной системы. Тем не менее, многие опубликованные протоколы трудным и отнимает много времени. Мы представляем здесь упрощенный протокол для выделения лимфоцитов из тонкой кишки, собственной пластинке слизистой оболочки интраэпителиальной слоя и пейеровых бляшках, что является быстрым, воспроизводимым и не требует трудоемких градиенты перколлом. Хотя протокол фокусируется на тонком кишечнике, он также подходит для анализа толстой кишки. Кроме того, мы отмечаем некоторые аспекты, которые могут потребоваться дополнительные оптимизации в зависимости от конкретной научной Quesции. Такой подход приводит к выделению большого количества жизнеспособных лимфоцитов, которые впоследствии могут быть использованы для анализа потока цитометрии или альтернативные средства определения характеристик.
Introduction
Основная задача тонкой кишки часто считается переваривание и всасывание питательных веществ 1. В то время как эта метаболическая функция явно необходима, в тонкой кишке имеет столь же значительную роль в защите хозяина от постоянной шквал антигенов окружающей среды , найденных в просвете 2. Кишечный тракт отделяет внешний мир (например., Просветные антигены) из внутренней среды организма хозяина с эпителиального слоя , который является только один слой клеток толщиной. Таким образом, малые кишечной иммунной системы имеет непростую задачу балансирования порог на реактивность, позволяя чужеродные антигены из рациона и синантропных микробов, чтобы войти в слизистую оболочку с минимальными, если таковые имеются, иммунный ответ, в то время как монтаж надежный ответ против вторгающихся патогенов и другие "вредные" антигены. Чрезмерное или неуместные иммунные ответы на эти антигены могут привести к патологическим заболеванием (например., Inflammaтори заболевания кишечника, сахарный диабет типа I, множественный склероз) , и его следует избегать 3-6.
В целом, желудочно - кишечный тракт , как полагают, представляют собой самый большой иммунный орган в организме, содержащий более 70% всех секретирующих антитела клеток 7. Тонкой кишки иммунная система состоит из 3 -х основных отсеков - собственная пластинка (LP), в интраэпителиальной слое и пейеровы бляшки (ПФС) - что каждая из них содержит характерную группу лимфоцитов 2. ЛВ - лимфоциты (LPLs) являются в основном TCRαβ + Т - клеток с ~ 20% В - клеток; интраэпителиальной лимфоциты (IELS) содержат очень мало В - клеток с более TCRγδ + Т - клеток , чем TCRαβ + Т - клеток; и СПП, которые являются вторичными лимфоидные органы, встроенные в малой кишечной стенки, содержат ~ 80% В-клеток. Хотя каждая из этих анатомических областей имеет несколько различных функций и онтологические основания, они функционируют в ахarmonized способа, чтобы защитить хозяина от патогенных оскорблений.
Кроме того, растет понимание , что микрофлора является важным фактором , определяющим для развития кишечной иммунной системы, с увеличением признание родственной связи между конкретными микробами и онтогенезе отдельных клеточных клонов 8,9. Кроме того, учитывая , что образование кишечной иммунной системы влияет на иммунную реакцию в анатомически удаленных сайтах (например., Артрит, рассеянный склероз, воспаление легких), стало ясно , что развитие кишечной иммунной системы имеет отношение к более болезненных процессов , чем считалось ранее 10 -12. Таким образом, интерес к количественной оценке кишечной иммунной системы расширилась за пределы хозяин-патоген взаимодействий в настоящее время включают хост-синантропных взаимодействий и патогенеза многих системных заболеваний, а также.
Учитывая изменчивость текущих методов ввыделение кишечных лимфоцитов, метод, который оптимизирован для доходности, жизнеспособности и последовательности, при этом балансируя время, необходимое приобретает все большее значение. Протоколы , которые включают перколлом градиенты по времени и трудоемкими и потенциально более склонны к человеческой ошибки, что приводит к переменной доходности и жизнеспособности 13. При этом мы обеспечиваем оптимизированный протокол для выделения и характеризации лимфоцитов, полученных от всех 3-х небольших кишечных иммунных отсеках. Кроме того, учитывая возрастающий интерес к микробно-индуцированное изменений в иммунной системе слизистой оболочки, мы включаем шаги, которые могут быть использованы для обеспечения горизонтальной передачи микроорганизмов между мышами, чтобы оценить, как эти изменения количественно влияют на кишечную иммунную систему.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования проводились под строгим обзора и руководящих принципов в соответствии с животных по уходу и использованию комитета (Institutional IACUC) в Гарвардской медицинской школе, которая отвечает ветеринарным стандартам, установленным Американской ассоциации лабораторных животных науки (AALAS).
1. Горизонтальная передача бактерий через Co-корпус (необязательно)
- Для того, чтобы свести к минимуму экзогенное загрязнения (в частности, при использовании гнотобионтных мышей), в асептических условиях при сборке стерильные одноразовые клетки, используя пищу и воду, которые оба были автоклавного.
- Используйте пуансоны уха или метки индивидуально отмечать в возрасте 6 недель мышей C57BL / 6, которые укрывают различные микробиот и их размещения в одной клетке. Учитывая, что мыши копрофаг и едят фекальные шарики из клетки пола, естественно, микробы будут передаваться горизонтально между мышами.
- Co-домовые мыши для ≥1 недели, чтобы дать время для микробного передачи и иммунологической изменения перед анализом. 2. Получение суспензии отдельных клеток из тонкой кишки интраэпителиальной слоя и собственной пластинки
- Приготовление растворов
- Готовят экстракционные средства массовой информации (в тонкой кишке): 30 мл RPMI + 93 мкл 5% (вес / объем) дитиотреитола (DTT) + 60 мкл 0,5 М ЭДТА + 500 мкл фетальной бычьей сыворотки (ФБС). Добавьте DTT непосредственно перед использованием.
- Подготовить пищеварение носителя (за тонкой кишки): 25 мл RPMI + 12,5 мг диспазу + 37,5 мг коллагеназы II + 300 мкл FBS. Добавьте диспазу и коллагеназу непосредственно перед использованием.
- Для всех инкубирования при 37 ° С, prewarm растворов до 37 ° С.
- Эвтаназии мышь СО 2 удушья с последующим смещением шейных позвонков.
- Поместите мышь спинной стороной вниз и распылить живота с 70% этанола. Используйте ножницы, чтобы выполнить лапаротомии путем последовательного резки кожи и затем перитонеальный фасцию вдоль вентральной средней линии сюдам лобкового симфиза до мечевидного процесса, тем самым подвергая брюшную полость.
- Используйте ножницы, чтобы отделить тонкую кишку из желудка с помощью пересекающих пилорический сфинктер. Аккуратно снимите тонкую кишку из брюшины, дразня прочь брыжеечной жир.
- Чтобы полностью удалить тонкий кишечник, сделать второй разрез на подвздошно-слепой кишки перехода. Поместите изолированный тонкий кишечник в холодный (то есть., 4 ° С) среды RPMI , содержащей 10% FBS , чтобы максимизировать жизнеспособность клеток.
- Осторожно удалите большие куски жира с помощью изогнутых щипцов. Соблюдайте осторожность, чтобы избежать разрыва ткани кишечника сама при попытке удалить жир.
- Для удаления содержимого кишечника, осторожно промойте кишечник с 15 - 20 мл холодного PBS с использованием подачи иглы 18 G, прикрепленную к шприцу.
- Используйте ножницы, чтобы вырезать PPs, и поместить их в холодную среду RPMI, содержащей 5% FBS. PPs расположены на antimesenteric стороне тонкой кишки и появляются в виде мульти-дольчатую белыймасса. В зависимости от конкретного штамма, мыши, как правило, имеет 8 - 12 PPs.
- Отрежьте тонкий кишечник в 3-х - 4-дюймовых сегментов.
- Удалите остатки жира путем прокатки каждый маленький-кишечный сегмент на бумажное полотенце, смоченным RPMI, используя тупую скальпель, чтобы дразнить жир прочь из ткани.
- Поверните ткань наизнанку cannulating кишечных сегментов с изогнутым пинцетом и захватывая дистальный конец ткани. Затем с помощью пары прямых щипцов, чтобы аккуратно удалить сегмент ткани из изогнутых щипцов (начиная с проксимального конца), в результате чего ткань инвертирования.
- Поместите сегменты ткани в чашку, содержащую 30 мл экстракционного сред и мешалку. Закрепить крышку на чашку, и перемешивали при 500 оборотах в минуту в течение 15 мин при 37 ° С; Перемешивание должно быть энергичным, но не турбулентным.
- После инкубации используют стальной сетчатый фильтр, чтобы отделить куски ткани от эпителий, содержащий супернатант, который должен появиться мутным. Этот супернатант содержит Intraepithelial лимфоциты, которые могут быть дополнительно проанализированы, если это желательно, путем проведения фильтрации образца с шагом 2,18 - 2,23.
- Вручную перемешивать кусочки ткани в RPMI, чтобы смыть остаточных средств массовой экстракции.
- Поместите ткань на сухое бумажное полотенце и перевернуть его конец над концом несколько раз, чтобы облегчить удаление остаточной слизи, которая не была освобождена экстракционной среды.
- Поместите фрагменты ткани в 1,5 мл пробирку с 600 мкл среды сбраживания.
- Используйте ножницы, чтобы пропустить через мясорубку ткани, пока куски больше не придерживаться ножниц и раствор кажется однородным. Этот шаг имеет решающее значение для обеспечения полного ферментативного расщепления ткани.
- Добавьте рубленый тонкую кишку в чашку, содержащую 25 мл переваривания сред. Смесь перемешивают при 500 оборотах в минуту в течение 30 мин при 37 ° С. На полпути через переваривания (т.е.., Через 15 мин), пипеткой вверх и вниз с серологической пипеткой , чтобы помочь разрушить любые большие куски ткани.
- Фильтр переваривают ткани (или epithelial слой с шага 2.12, если обработка IELS) через сито 100 клеток мкм в 50 мл пробирку. Промыть фильтр 20 мл среды RPMI, содержащей 10% FBS.
- Центрифуга отфильтрованный раствор при 500g в течение 10 мин при 4 ° С.
- Супернатант осторожно декантируют и ресуспендируют осадок в 1 мл среды RPMI, содержащей 10% FBS.
- Фильтр ресуспендировали клеток через 40 мкм клеточный фильтр с в 50 мл пробирку. Промыть сетчатый фильтр с 20 мл среды RPMI, содержащей 10% FBS.
- Центрифуга отфильтрованный раствор при 500g в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
- Супернатант осторожно декантируют, и ресуспендируют осадок в 1 мл среды RPMI, содержащей 2% FBS.
- Передача вырезают PPs в чашку с 25 мл пищеварением сред и мешалкой. Безопасная крышка, и отжим при 500 оборотах в минуту в течение 10 мин при 37 ° С.
- Фильтр переваривается PPs через 40 мкм клеточный фильтр с в 50 мл пробирку. Если комков Ремав, нажмите их через сетчатый фильтр, используя плоский конец плунжера из шприца емкостью 1 мл.
- Промыть фильтр 10 мл среды RPMI, содержащей 10% FBS.
- Центрифуга отфильтрованный раствор при 500g в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
- Супернатант осторожно декантируют, и ресуспендируют осадок в 1 мл среды RPMI, содержащей 2% FBS.
- Аликвоты соответствующий объем клеток (например., 200 мкл LPLs) в 96-луночного круглым дном тарелку.
- Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Декантируют супернатант опрокидыванием планшета.
- Ресуспендируют клеток в 90 мкл среды RPMI, содержащей 2% FBS и 1: 100 разбавление анти-CD16 / 32 (Fc блок). Инкубировать в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
- Добавляют 10 мкл PBS. Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Декантируют супернатант опрокидыванием планшета.
- Ресуспендируют клеток в 250 мкл PBS. Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Слить супернатантопрокидыванием планшета.
- (Необязательно) Пятно клетки с жизнеспособностью красителя, при желании, следуя протоколу производителя.
- Ресуспендируют клеток в 100 мкл 1% -ного формалина, чтобы зафиксировать клетки. Инкубировать в течение 1 ч в темноте при температуре 4 ° С.
- Добавить 200 мкл PBS. Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Декантируют супернатант опрокидыванием планшета.
- Ресуспендируют клеток в 250 мкл PBS. Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Декантируют супернатант опрокидыванием планшета.
- Ресуспендируют клеток в 200 мкл PBS. Анализ клеток с использованием проточного цитометра.
3. Получение суспензии отдельных клеток из пейеровых бляшках
4. Поверхность Окрашивание для проточной цитометрии
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Цитометрический анализ одноклеточных суспензий мелких-кишечных лимфоцитов должны давать дискретную популяцию клеток , которые имеют аналогичные вперед и боковое рассеивание характеристики , как и спленоцитов (фигуры 1А и 1В). Лимфоциты могут начинают умирать , если ткань не поддерживается при температуре 4 ° С в течение начальных стадий выделения, в результате чего в популяции лимфоцитов , имеющий более низкую рассеяния вперед и быть более трудно отделить от других эпителиальных и мертвых клеток (рис 1C) , К тому же , если тонкой кишки ткани не полностью очищены от ее брыжейки жира, существует практически полная потеря лимфоцитов (рис 1D). Эти особенности показывают , как работает быстро (то есть., Не позволяя ткани , чтобы разогреть) и обращая внимание к деталям (то есть., Удаление даже небольшого количества мезентериального жира) необходимо для обеспечения качества образца. TypicaLLY, получаем ~ 80% жизнеспособность при малых-кишечного LPLs (рис 1E).
На фиг.2А показано , как состав микробиоты может сильно повлиять на количество специфических клеточных популяций. Как ранее мы показали, стерилен (GF) мыши, которые полностью лишены каких-либо микроорганизмов, имеют небольшой-кишечный иммунной системы, которая заметно незрелым по сравнению с конкретного патогена (SPF) мышей, и колонизация GF мышей с нормальной мыши микрофлора (ММБ) приводит к восстановлению малых кишечной иммунной системы 14. В противоположность этому , гнотобиотических мышей укрывательство нормальную микрофлору человека (ВМН) - и которые имеют одинаковое количество и разнообразие фекальных бактерий как мыши MMB - имеют небольшой-кишечный иммунной системы , которая не отличается от таковой у мышей GF 14.
Пользуяськопрофаг природа мышей, совместное жилье мышей вместе представляет собой простой, но мощный метод позволяет горизонтальной передачи организмов между мышей. Такой подход позволяет проверить, влияет ли результирующее изменение в флору тонкой кишки иммунную систему. В качестве примера, мы показали , что совместное жилье Hmb мышей с MMB мышей в течение 4 недель привело к нормализации количества CD3 + CD8 + Т - клеток в SI LP (рис 2В) 14. Этот результат подтверждает , что различия между ММВ и ВМН мышей , наблюдаемых на рисунке 2А обусловлено изменениями в микробиоты между этими мышами - вариации, которые преодолевают путем совместного размещени мыши вместе.
Рисунок 1. Кишечные Лимфоциты имеют FSC и SSC характеристики аналогичны спленоциты A - D. D.Ветхозаветные сюжеты, изображающие SSC и FSC для оптимально подготовленные спленоцитов (А) и тонкой кишки собственная пластинка слизистой оболочки (SI LP) клеток (B - D). Образец Б. С. Л. П. был получен в соответствии с описанным протоколом. С. кишечная ткань была намеренно оставляли нагреваться, чтобы продемонстрировать, что СИ LP клетки начинают иметь более низкий FSC. D. брыжеечной жир не был очищен от тонкой кишки до подготовки отдельных клеток, что приводит к потере заметному SI LP популяции лимфоцитов. Е. Образец , изображенный на панели B окрашивали на этапе 4.7 с фиксируемой жизнеспособности красителя (например., EFluor 780) в соответствии с инструкциями изготовителя. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Воздействие микробиоты Созревание Small-INTESTИнал иммунной системы. А. CD3 + CD8 + Т - клетки были перечислены в SI ЛП SPF, MMB, HMB и мышей GF. Мышей B. ВМН были совместно размещены с MMB мышей в течение 4 -х недель до перечислении CD3 + CD8 + Т - клеток в SI LP. ММВ и ВМН мышей, которые не совместно размещались были проанализированы для сравнения. Каждая точка данных представляет собой отдельную мышь, а горизонтальные полосы отражают среднее значение. NS, не имеет существенного значения; *, Р <0,05; **, Р <0,01; *** Р <0,001. Рисунки воспроизводимых с разрешением от-ссылки 14, с небольшой модификацией B. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы представляем протокол для выделения и проточной цитометрии характеристике небольших-кишечных лимфоцитов, в том числе LPLs, IELS и лимфоцитов в полипропиленов. Для тех, кто заинтересован в оценке того, как изменения в микробиоты влияют на тонкой кишки иммунную систему, мы детализируют простые шаги, вовлеченные в горизонтальной передачи организмов между мышей, несущих различные микробиот. Хотя этот протокол фокусируется на тонком кишечнике, процедура одинакова для анализа толстой кишки, с той лишь разницей, что не существует никаких PPs не удалить (хотя ободочной пятна присутствуют, то они, как правило, не сильно видны).
Есть несколько ключевых шагов в достижении оптимальной изоляции лимфоцитов из тонкой кишки ткани. Тщательное удаление жировой ткани является абсолютно решающее значение для обеспечения жизнеспособности лимфоцитов и оптимальный выход. Кроме того, DTT является одним из важнейших муколитическое используется при экстракцииэпителиальных клеток. Учитывая его нестабильным характер, мы рекомендуем хранить одноразовыми аликвот 5% -ного раствора при температуре ≤-20 ° C, а не повторного замораживания любые неиспользованные объемы. Хотя ЭДТА используется в экстракционной среды для помощи в удалении эпителиальных клеток 15, его присутствие - а также избыток ФБС или слизью - в процессе пищеварения может ингибировать коллагеназы. Концентрация коллагеназы , используемой было продемонстрировано , чтобы дифференцированно влиять на экспрессию маркера поверхности и жизнеспособность клеток 13,16,17. К тому же , в зависимости от поверхности маркера интерес, может быть , что другая формулировка коллагеназы (например., Типа коллагеназы I, II, VI или VIII) , является оптимальной 13,17. Некоторые оптимизации эмпирическое могут потребоваться в зависимости от конкретного экспериментального вопроса и из-за партии к партии, изменения в конкретной партии и относительного уровня активности коллагеназы. Кроме того, дополнительная оптимизация может потребоваться в зависимости от specifIC штамма и возраста мыши используется. Например, времена, перечисленные здесь, были оптимизированы для ~ 6-недельных мышей C57BL / 6 мыши; в течение ~ 8-недельных мышей Swiss Webster, время переваривания может быть увеличено до 40 минут.
Таким образом, мы представили подробный протокол для выделения небольших кишечных лимфоцитов из собственной пластинке слизистой оболочки, интраэпителиальной слоя и полипропиленов. После того, как освоены, можно разумно обрабатывать 4 мышей и имеют единичные клеточные суспензии, готовые для окрашивания в ~ 4 ч. Хотя мы описываем немедленное окрашивание этих клеток для проточной цитометрии характеристик, можно альтернативно стимулировать эти клетки для оценки продукции цитокинов, сортировки клеток для транскрипции и / или протеомных анализов или культуры клеток , чтобы посмотреть на взаимодействия в пробирке с другими типами клеток. К тому же, в то время как мы сосредоточили внимание на популяции лимфоцитов, этот протокол может также быть использован для изучения миелоидных клеток. В совокупности этот рациональный подход к выделению одного CEЛ.Л. популяции из различных кишечных отсеков позволяет опрашивать и как различные факторы (например., микрофлора, пищевые антигены) влияют на онтогенез кишечной иммунной системы , а также , как эти клетки могут иметь отношение к экстра-кишечных заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Gloves | Kimberly-Clark | 555092 | |
| sterile mouse cage | Innovive | MS2-AD | contains lid, cage bottom, and alpha-dri bedding |
| Metal feeder | Innovive | M-FEED | |
| Water bottle | Innovive | M-WB-300 | |
| Card holder | Innovive | CRD-HLD-H | |
| Autoclavable rodent chow (NIH-31M) | Zeigler | 4131207530 | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | 11875-119 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Ambion | AM9262 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GemBio | 100-510 | |
| Dispase II | Invitrogen | 17105-041 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 1.878 U/mg |
| Collagenase, type II | Invitrogen | 17101-015 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 245 U/mg |
| Dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Feeding needle (18 G, 2" length) | Roboz | FN-7905 | |
| 10 ml Syringe | BD | 305482 | |
| PBS | Gibco | 14190-250 | |
| Disposable Scalpel (15 blade) | Miltex | 4-415 | |
| Curved forceps | Roboz | RS-5211 | |
| Straight forceps | Roboz | RS-5132 | |
| Multi-purpose cups, 120 ml | VWR | 89009-662 | |
| Stir bar | VWR | 58949-062 | |
| Multi-position stir plate, 9-position | VWR | 12621-048 | |
| Stainless steel conical strainer, 3 inch | RSVP | ||
| 1.5 ml Tube | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 100 μm Cell strainer | Falcon | 08-771-19 | |
| 40 μm Cell strainer | Falcon | 08-771-1 | |
| 50 ml Conical tube | Falcon | 352098 | |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 96-well Plate, round-bottom | Corning | 3799 | |
| Anti-mouse CD16/32 (Fc block) | Biolegend | 101320 | |
| (Optional) Fixable viability dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-18 | |
| 10% Formalin, neutral buffered | Thermo Scientific | 5725 |
References
- Cummings, D. E., Overduin, J.
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14 (10), 667-685 (2014).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (5), 313-323 (2009).
- Sartor, R. B. Microbial influences in inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 134 (2), 577-594 (2008).
- Tlaskalova-Hogenova, H., et al. Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases. Immunol Lett. 93 (2-3), 97-108 (2004).
- Wen, L., et al. Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes. Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue distribution of lymphocytes and plasma cells and the role of the gut. Trends Immunol. 29 (5), author reply 209-210 206-208 (2008).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. The yin yang of bacterial polysaccharides: lessons learned from B. fragilis PSA. Immunol Rev. 245 (1), 13-26 (2012).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. Deciphering the tete-a-tete between the microbiota and the immune system. J Clin Invest. 124 (10), 4197-4203 (2014).
- Gauguet, S., et al. Intestinal microbiota of mice influences resistance to Staphylococcus aureus pneumonia. Infect Immun. , (2015).
- Ochoa-Reparaz, J., et al. A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease. Mucosal Immunol. 3 (5), 487-495 (2010).
- Wu, H. J., et al. Gut-residing segmented filamentous bacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17 cells. Immunity. 32 (6), 815-827 (2010).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Chung, H., et al. Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota. Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).
- Resendiz-Albor, A. A., Esquivel, R., Lopez-Revilla, R., Verdin, L., Moreno-Fierros, L. Striking phenotypic and functional differences in lamina propria lymphocytes from the large and small intestine of mice. Life Sci. 76 (24), 2783-2803 (2005).
- Carrasco, A., et al. Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa. J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
