Abstract
Tarmene - som inneholder det største antallet immunceller av alle organ i kroppen - er stadig utsatt for fremmede antigener, både mikrobielle og kosttilskudd. Gitt en økende forståelse for at disse antigenene luminal å forme immunrespons, og at utdannelse av immunceller i tarmen er kritisk for en rekke systemiske sykdommer, har det vært økende interesse for å karakterisere tarmimmunsystemet. Men mange publiserte protokoller er vanskelige og tidskrevende. Vi presenterer her en forenklet protokoll for isolering av lymfocytter fra den lille tarm lamina propria, intraepitelial lag, og Peyers lapper som er rask, reproduserbar, og som ikke krever møysommelige Percoll gradienter. Selv om protokollen fokuserer på tynntarmen, er det også egnet for analyse av colon. Videre fremheve vi noen aspekter som kan trenge ytterligere optimalisering avhengig av spesifikke vitenskapelige spørssjon. Denne fremgangsmåten resulterer i isolering av et stort antall levedyktige lymfocytter som senere kan brukes for flowcytometrisk analyse eller alternativ måte for karakterisering.
Introduction
Hovedoppgave tynntarmen er ofte ansett for å være den fordøyelsen og absorpsjon av næringsstoffer 1. Selv om dette metabolske funksjon er helt klart viktig, har det tynntarmen en like viktig rolle i å beskytte verten fra den kontinuerlige bombardement av antigener fra miljøet som finnes i hulrommet 2. Tarmkanalen skiller omverdenen (f.eks., Luminal antigener) fra det indre miljø av verten med en epitelial lag som er bare en enkelt celle lag tykk. Som sådan, har den lille-tarmimmunsystemet den formidable oppgaven med å balansere sin terskel for reaktivitet, slik at fremmede antigener fra kostholdet og commensal mikrober å gå inn i slimhinnene med minimal, om noen, immunrespons ved montering en robust respons mot invaderende patogener og andre "skadelige" antigener. Overdreven eller upassende immunresponser mot disse antigenene kan føre til patologisk sykdom (f.eks., Inflammatory tarmsykdom, type I diabetes, multippel sklerose) og må unngås 3-6.
Totalt sett er mage-tarmkanalen antas å representere den største immun organ i kroppen, som inneholder over 70% av alle antistoff-utskillende celler 7. Den lille-tarmimmunsystem består av 3 hoved avdelinger - lamina propria (LP), den intraepitelial lag, og Peyers patcher (PPS) - som hver inneholder en særegen gruppe av lymfocytter 2. LP lymfocytter (LPLs) er primært TCRαβ + T-celler med ~ 20% B-celler; intraepitelial lymfocytter (IELs) inneholder svært få B-celler med flere TCRγδ + T celler enn TCRαβ + T-celler; og PP, som er sekundære lymfoide organer innebygd i små-tarmveggen, inneholder ~ 80% B-celler. Selv om hver av disse anatomiske regioner har litt forskjellige funksjoner og ontologiske baser, fungerer de i aharmonized mote å beskytte verten fra patogene fornærmelser.
Videre er det en økende forståelse for at bakterieflora er et viktig determinant for utviklingen av tarmimmunsystemet, med økende erkjennelse av den beslektede forholdet mellom spesifikke mikrober og ontogeny av bestemte celle linjene 8,9. Dessuten, gitt at utdanning av tarmimmunsystemet påvirker immunresponser i anatomisk fjerne områder (f.eks., Leddgikt, multippel sklerose, lungebetennelse), har det blitt klart at utviklingen av tarmimmunsystemet er relevant for flere sykdomsprosesser enn tidligere anerkjent 10 -12. Som sådan, har interessen for kvantitativt vurdere tarmimmunsystemet utvides utover verts patogen interaksjoner for å kunne inkludere verts commensal interaksjoner og patogenesen av mange systemiske sykdommer i tillegg.
Gitt variasjon av dagens metoder iisolering av intestinal lymfocytter, en metode som er optimalisert for utbytte, levedyktighet, og konsistensen mens balansere den nødvendige tid blir stadig mer kritisk. Protokoller som involverer Percoll graderinger er tids- og arbeidskrevende og potensielt mer utsatt for menneskelige feil, som fører til variabel avkastning og levedyktighet 13. Heri, gir vi en optimal protokoll for isolering og karakterisering av lymfocytter fra alle 3 small-tarmimmun kammere. I tillegg, gitt økende interesse for mikrobe-induserte endringer i slimhinneimmunsystemet, omfatte vi trinn som kan brukes til å tillate den horisontale overføring av mikroorganismer mellom mus for å vurdere hvordan disse endringene kvantitativt påvirker tarmimmunsystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle studier ble utført under streng gjennomgang og retningslinjer i henhold til Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Harvard Medical School, som oppfyller de veterinære standarder satt av American Association for Laboratory Animal Science (AALAS).
1. Horisontal Overføring av bakterier via Co-boliger (valgfritt)
- For å minimere eksogene forurensning (spesielt hvis du bruker gnotobiotiske mus), øve aseptisk teknikk ved montering sterile engangs bur, ved hjelp av mat og vann som har begge blitt autoklaveres.
- Bruk øret slag eller koder til individuelt markere seks uker gamle C57BL / 6 mus som havn forskjellige microbiotas og huse dem i samme bur. Gitt at mus er coprophagia og spise fecal pellets fra buret gulvet, vil mikrober naturligvis overføres horisontalt mellom mus.
- Co-huset mus for ≥1 uke å gi tid for mikrobiell overføring og immunologisk endring før analyse. 2. Utarbeidelse av en enkelt celle Suspensjon fra Small-tarm intraepitelial Layer og lamina propria
- Utarbeidelse av Solutions
- Forbered ekstraksjonsmedia (pr tynntarmen): 30 ml RPMI + 93 ul 5% (w / v) ditiotreitol (DTT) + 60 pl 0,5 M EDTA + 500 pl fetalt bovint serum (FBS). Tilsett DTT umiddelbart før bruk.
- Klargjør fordøyelsen media (per tynntarmen): 25 ml RPMI + 12,5 mg dispase + 37,5 mg kollagenase II + 300 mL FBS. Tilsett dispase og kollagenase umiddelbart før bruk.
- For alle inkubasjoner ble utført ved 37 ° C, prewarm løsninger til 37 ° C.
- Avlive musen ved CO 2 kvelning fulgt ved halshugging.
- Plasser musen ryggsiden ned og spray magen med 70% etanol. Bruk saks til å utføre en laparotomi ved sekvensielt å kutte i huden og deretter peritoneal fascia langs ventrale midtlinjen from den symfyseprovokasjonstester til xiphoid prosessen, og dermed utsette bukhulen.
- Bruk saks til å skille tynntarmen fra magen ved transecting pyloric sphincter. Fjern forsiktig tynntarmen fra peritoneum, ertende bort mesenteric fett.
- For å fjerne den lille tarmen fullt ut, gjøre et nytt kutt på ileo-cecal veikryss. Plasser isolert tynntarmen inn i kald (f.eks., 4 ° C) RPMI inneholdende 10% FBS for å maksimere cellenes levedyktighet.
- Fjern forsiktig store biter av fett ved hjelp av buede tang. Vær forsiktig for å unngå å rive tarmvevet selv mens du prøver å fjerne fett.
- For å fjerne tarminnholdet, forsiktig skylle tarmene med 15 - 20 ml kald PBS ved hjelp av en 18 G fôring nål festet til en sprøyte.
- Bruk saks til å skjære PP, og plassere dem i kaldt RPMI som inneholder 5% FBS. PPs ligger på antimesenteric siden av tynntarmen og vises som en multi-Lobulær hvitmasse. Avhengig av den spesifikke påkjenning, har en mus typisk 8 - 12 PP.
- Skjær tynntarmen inn i 3 - 4 tommers segmenter.
- Fjerne gjenværende fett ved valsing hver lille-tarmsegmentet på et papir fuktet med RPMI, ved hjelp av en skalpell kjedelig å erte fettet vekk fra vevet.
- Snu vev inn og ut av et kanylerør tarmsegmenter med buet pinsett og gripe den distale ende av vev. Deretter bruke et par rette tang til å forsiktig fjerne vev segmentet fra de buede tang (som starter ved den proksimale ende), som resulterer i vevet som blir invertert.
- Plasser vev segmenter i en kopp med 30 ml ekstraksjonsmedia og en rørepinne. Fest lokket på koppen, og røre ved 500 rpm i 15 minutter ved 37 ° C; røring bør være sprek, men ikke turbulent.
- Etter inkubasjon, bruk en stål sil for å skille vev stykker fra Epitel-supernatant, som skal vises skyet. Denne supernatanten inneholder intraepithelial lymfocytter som kan bli ytterligere analysert, om ønsket, ved å gå frem for å filtrere prøven i trinn 2,18 - 2,23.
- agitere manuelt vevet brikker i RPMI å vaske bort rester utvinning media.
- Plasser vev på en tørr papirhåndkle og snu den ende over ende flere ganger for å lette fjerning av gjenværende slim som ikke ble frigjort av ekstraksjonsmediet.
- Plasser vev fragmenter i en 1,5 ml tube med 600 mL av fordøyelsen medium.
- Bruk saks til å hakke vevet inntil biter ikke lenger holde seg til saksen og løsningen vises homogen. Dette trinnet er kritisk for å sikre fullstendig enzymatisk nedbrytning av vevet.
- Tilsett hakket tynntarmen til en kopp som inneholder 25 ml fordøyelsen medier. Omrør ved 500 rpm i 30 minutter ved 37 ° C. Halvveis gjennom fordøyelse (f.eks., 15 min), pipetter opp og ned med en serologisk pipette for å bidra til å bryte opp eventuelle store biter av vev.
- Filter fordøyd vev (eller epithelial lag fra trinn 2,12 hvis behandlingen IELs) gjennom en 100 um celle sil inn i et 50 ml rør. Skyll filteret med 20 ml RPMI inneholdende 10% FBS.
- Sentrifuger den filtrerte løsningen ved 500 xg i 10 min ved 4 ° C.
- dekanter nøye supernatant og resuspender pelleten i 1 ml RPMI inneholdende 10% FBS.
- Filter resuspenderes cellene gjennom et 40 um celle sil inn i et 50 ml rør. Skyll sil med 20 ml RPMI inneholdende 10% FBS.
- Sentrifuger filtrerte oppløsning ved 500 xg i 10 min ved 4 ° C.
- dekanter supernatanten forsiktig, og resuspender pelleten i 1 ml RPMI inneholdende 2% FBS.
- Overføring skåret PPs til en kopp med 25 ml fordøyelsen media og en rørepinne. Sikker lokk, og sentrifugering ved 500 rpm i 10 min ved 37 ° C.
- Filter spaltet PP gjennom et 40 um celle sil inn i et 50 ml rør. Hvis noen klumper remainn, trykk dem gjennom silen ved hjelp av den flate enden av stempelet fra en 1 ml sprøyte.
- Skyll sil med 10 ml RPMI inneholdende 10% FBS.
- Sentrifuger filtrerte oppløsning ved 500 xg i 10 min ved 4 ° C.
- dekanter supernatanten forsiktig, og resuspender pelleten i 1 ml RPMI inneholdende 2% FBS.
- Alikvoter passende volum av celler (f.eks., 200 ul LPLs) i en 96-brønners rundbunnet plate.
- Sentrifuger ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanter supernatanten ved å snu platen.
- Resuspender celler i 90 ul RPMI inneholdende 2% FBS og en 1: 100 fortynning av anti-CD16 / 32 (Fc blokk). Inkuber i 10 minutter ved 4 ° C.
- Tilsett 10 mL PBS. Sentrifuger ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanter supernatanten ved å snu platen.
- Resuspender celler i 250 ul PBS. Sentrifuger ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanter supernatanten vedsnu platen.
- (Valgfritt) Flekke celler med levedyktighet fargestoff, hvis ønskelig, ved å følge produsentens protokoll.
- Resuspender celler i 100 ul 1% formalin for å fiksere cellene. Inkuber i 1 time i mørke ved 4 ° C.
- Tilsett 200 mL PBS. Sentrifuger ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanter supernatanten ved å snu platen.
- Resuspender celler i 250 ul PBS. Sentrifuger ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanter supernatanten ved å snu platen.
- Resuspender celler i 200 ul PBS. Analyser celler ved anvendelse av et strømningscytometer.
3. Utarbeidelse av en enkelt celle Suspensjon fra Peyers Patches
4. Surface Farging for flowcytometrisystemer
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flowcytometrisk analyse av enkeltcellesuspensjoner av små-tarm lymfocytter bør gi en diskret populasjon av celler som har lignende fremover og sidespredning egenskaper som splenocytes (figur 1A og 1B). Lymfocyttene kan begynne å dø hvis vevet ikke blir opprettholdt ved 4 ° C i løpet av de første trinn av isoleringen, som resulterer i lymfocyttpopulasjon har en nedre forover spredning og å være mer vanskelig å skille fra andre epiteliale og døde celler (figur 1C) . Videre, hvis de små-tarmvevet ikke er fullstendig renset for sin mesentrialfett, er det praktisk talt et fullstendig tap av lymfocytter (figur 1D). Disse funksjonene illustrere hvordan jobbe raskt (ie., Ikke slik at vevet å varme opp) og betale oppmerksomhet på detaljer (ie., Fjerning av selv små mengder mesenteric fett) er nødvendig for å sikre prøvekvalitet. typically, får vi ~ 80% levedyktighet for små-tarm LPLs (figur 1E).
Figur 2A viser hvordan sammensetningen av bakterieflora i stor grad kan påvirke antallet av spesifikke cellepopulasjoner. Som vi tidligere har vist, bakterie-fri (GF) mus, som er fullstendig blottet for mikroorganismer, har en liten-tarmimmunsystem som er markert umoden i forhold til spesifikke patogen-fri (SPF) mus, og kolonisering av GF mus med en vanlig mus bakterieflora (MMB) resulterer i restaurering av den lille-tarmimmunsystem 14. I kontrast, gnotobiotiske mus huse en normal normalflora (HMB) - og som har et tilsvarende antall og mangfold av fecal bakterier som MMB mus - har en liten-tarmimmunsystem som er umulig å skille fra det av GF mus 14.
Benytte seg avden coprophagia natur mus, co-bolig mus representerer sammen en enkel, men kraftig metode for å tillate horisontal spredning av organismer mellom mus. Denne fremgangsmåten gjør det mulig å teste hvorvidt den resulterende forandring i den bakterieflora påvirker tynn-tarmimmunsystem. Som et eksempel, demonstrerte vi at samtidig huset HMB mus med MMB mus i 4 uker resulterte i en normalisering av antall CD3 + CD8 + T-celler i SI LP (figur 2B) 14. Dette resultatet bekrefter at forskjellene mellom MMB og HMB mus observert i figur 2A er på grunn av variasjoner i den bakterieflora mellom disse mus - variasjoner som overvinnes ved ko-huset musene sammen.
Figur 1. Tarm Lymfocytter har FSC og SSC egenskaper som ligner på Splenocytter A -. D. Dot plott som viser SSC og FSC for optimalt fremstilt splenocytter (A) og små-intestinal lamina propria (SI LP) celler (B - D). B. SI LP prøve ble fremstilt i henhold til den beskrevne protokoll. C. tarmvevet ble med hensikt oppvarmes for å demonstrere at SI LP cellene begynner å ha en lavere FSC. D. mesentrialfett ble ikke renset av tynntarmen før fremstilling av enkeltceller, noe som resulterer i tap av en merkbar SI LP lymfocyttpopulasjon. E. Prøven avbildet i panel B ble farget i trinn 4.7 med fikses levedyktighet fargestoff (f.eks., EFluor 780) i henhold til produsentens instruksjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. microbiota Konsekvenser Modning av Small-INTESTInal immunsystem. A. CD3 + CD8 + T-celler ble nummerert i SI LP SPF, MMB, HMB, og GF mus. B. HMB mus ble ko-huset med MMB mus i 4 uker før opplisting CD3 + CD8 + T-celler i SI LP. MMB og HMB mus som ikke ble co-plassert ble analysert for sammenligning. Hvert datapunkt representerer en individuell mus, og de horisontale stolpene gjenspeiler middelverdien. NS, ikke signifikant; * P <0,05; **, P <0,01; *** P <0,001. Tallene er gjengitt-med tillatelse-fra referanse 14, med liten endring av B. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterer en protokoll for isolering og flowcytometrisk karakterisering av små-tarm-lymfocytter, inkludert LPLs, IELs, og lymfocytter i PP. For de som er interessert i å vurdere hvordan endringer i microbiota påvirke den lille-tarmimmunsystem, vi detalj de enkle trinnene involvert i horisontal spredning av organismer mellom mus huser ulike microbiotas. Selv om denne protokollen fokuserer på tynntarmen, er fremgangsmåten den samme for analyse av tykktarmen, med den eneste forskjellen er at det ikke er noen PP for å fjerne (selv om colonic flekker er til stede, er dette vanligvis ikke er grovt synlig).
Det er flere viktige trinn for å oppnå optimal isolering av lymfocytter fra små-tarmvevet. Grundig fjerning av fettvev er helt avgjørende for å sikre lymfocytt levedyktighet og optimal avkastning. I tillegg er en avgjørende DTT mucolytic som brukes i ekstraksjonenav epitelceller. Gitt sin ustabile natur, foreslår vi at du lagrer engangs porsjoner av en 5% løsning ved ≤-20 ° C og ikke re-frysing ubrukt volum. Selv om EDTA anvendes i ekstraksjonsmediet for å hjelpe til med fjerning av epitelceller 15, dens tilstedeværelse - så vel som overskudd av FBS eller slim - kan i løpet av fordøyelsesprosessen inhibere kollagenase. Konsentrasjonen av kollagenase benyttet har vist seg å differensielt påvirke overflatemarkør ekspresjon og cellelevedyktigheten 13,16,17. Dessuten, avhengig av overflatemarkør av interesse, kan det være at en forskjellig formulering av kollagenase (f.eks., Kollagenase type I, II, VI eller VIII) er optimal 13,17. Noen empirisk Optimaliseringen kan være nødvendig, avhengig av den spesifikke eksperimentelle spørsmål og, på grunn av masse-til-mange variasjoner er den spesifikke masse og relative aktivitetsnivå av kollagenase. Videre kan ytterligere optimalisering være nødvendig, avhengig av specific belastning og alder på musen brukes. For eksempel har de tider som er oppført her er optimalisert for en ~ 6 uker gamle C57BL / 6 mus; for en ~ 8 uker gamle Swiss Webster mus, kan koketiden økes til 40 minutter.
I sammendraget, har vi gitt en detaljert protokoll for isolering av små-tarm lymfocytter fra lamina propria, intraepitelial lag og PP. Når mestret, kan man med rimelighet behandle 4 mus og har enkeltcellesuspensjoner klar for farging i ~ 4 timer. Selv om vi beskrive den umiddelbare farging av disse cellene for flowcytometrisk karakterisering, kan man alternativt stimulere disse cellene til å vurdere cytokinproduksjon, sortere celler for transkripsjonen og / eller proteomic analyser, eller kultur cellene til å se på in vitro-interaksjoner med andre celletyper. Videre, mens vi fokusert på lymfocyttpopulasjon, denne protokollen kan også brukes til å undersøke myeloide celler. Til sammen denne strømlinjeformet tilnærming til å isolere enkelt cell populasjoner fra ulike tarm avdelinger gjør det mulig å avhøre både hvordan ulike faktorer (f.eks., microbiota, kosttilskudd antigener) påvirke ontogeny av tarmimmunsystemet, og også hvordan disse cellene kan være relevant i ekstra-tarmsykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Gloves | Kimberly-Clark | 555092 | |
| sterile mouse cage | Innovive | MS2-AD | contains lid, cage bottom, and alpha-dri bedding |
| Metal feeder | Innovive | M-FEED | |
| Water bottle | Innovive | M-WB-300 | |
| Card holder | Innovive | CRD-HLD-H | |
| Autoclavable rodent chow (NIH-31M) | Zeigler | 4131207530 | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | 11875-119 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Ambion | AM9262 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GemBio | 100-510 | |
| Dispase II | Invitrogen | 17105-041 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 1.878 U/mg |
| Collagenase, type II | Invitrogen | 17101-015 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 245 U/mg |
| Dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Feeding needle (18 G, 2" length) | Roboz | FN-7905 | |
| 10 ml Syringe | BD | 305482 | |
| PBS | Gibco | 14190-250 | |
| Disposable Scalpel (15 blade) | Miltex | 4-415 | |
| Curved forceps | Roboz | RS-5211 | |
| Straight forceps | Roboz | RS-5132 | |
| Multi-purpose cups, 120 ml | VWR | 89009-662 | |
| Stir bar | VWR | 58949-062 | |
| Multi-position stir plate, 9-position | VWR | 12621-048 | |
| Stainless steel conical strainer, 3 inch | RSVP | ||
| 1.5 ml Tube | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 100 μm Cell strainer | Falcon | 08-771-19 | |
| 40 μm Cell strainer | Falcon | 08-771-1 | |
| 50 ml Conical tube | Falcon | 352098 | |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 96-well Plate, round-bottom | Corning | 3799 | |
| Anti-mouse CD16/32 (Fc block) | Biolegend | 101320 | |
| (Optional) Fixable viability dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-18 | |
| 10% Formalin, neutral buffered | Thermo Scientific | 5725 |
References
- Cummings, D. E., Overduin, J.
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14 (10), 667-685 (2014).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (5), 313-323 (2009).
- Sartor, R. B. Microbial influences in inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 134 (2), 577-594 (2008).
- Tlaskalova-Hogenova, H., et al. Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases. Immunol Lett. 93 (2-3), 97-108 (2004).
- Wen, L., et al. Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes. Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue distribution of lymphocytes and plasma cells and the role of the gut. Trends Immunol. 29 (5), author reply 209-210 206-208 (2008).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. The yin yang of bacterial polysaccharides: lessons learned from B. fragilis PSA. Immunol Rev. 245 (1), 13-26 (2012).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. Deciphering the tete-a-tete between the microbiota and the immune system. J Clin Invest. 124 (10), 4197-4203 (2014).
- Gauguet, S., et al. Intestinal microbiota of mice influences resistance to Staphylococcus aureus pneumonia. Infect Immun. , (2015).
- Ochoa-Reparaz, J., et al. A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease. Mucosal Immunol. 3 (5), 487-495 (2010).
- Wu, H. J., et al. Gut-residing segmented filamentous bacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17 cells. Immunity. 32 (6), 815-827 (2010).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Chung, H., et al. Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota. Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).
- Resendiz-Albor, A. A., Esquivel, R., Lopez-Revilla, R., Verdin, L., Moreno-Fierros, L. Striking phenotypic and functional differences in lamina propria lymphocytes from the large and small intestine of mice. Life Sci. 76 (24), 2783-2803 (2005).
- Carrasco, A., et al. Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa. J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
