Abstract
Os intestinos - que contêm o maior número de células imunes de qualquer órgão do corpo - são constantemente expostos a antígenos estranhos, tanto microbiana e dietética. Dado que uma maior compreensão destes antigénios luminais ajudar a dar forma a resposta imune e que a formação de células imunitárias no intestino é crítica para uma série de doenças sistémicas, tem havido um interesse crescente na caracterização do sistema imune do intestino. No entanto, muitos protocolos publicados são árduos e consumidores de tempo. Apresentamos aqui um protocolo simplificado para o isolamento de linfócitos a partir da própria lâmina do intestino delgado, a camada intraepitelial, e placas de Peyer, que é rápido, reprodutível, e não necessita de gradientes de Percoll laboriosos. Embora o protocolo centra-se no intestino delgado, é também adequado para a análise do cólon. Além disso, destacam-se alguns aspectos que podem precisar de otimização adicional, dependendo do ques científica específicação. Esta abordagem resulta no isolamento de um grande número de linfócitos viáveis que podem, subsequentemente, ser utilizadas para a análise de citometria de fluxo ou meio alternativo de caracterização.
Introduction
A tarefa principal do intestino delgado é muitas vezes considerada a digestão e absorção de nutrientes 1. Enquanto essa função metabólica é claramente essencial, o intestino delgado tem um papel igualmente importante na defesa do hospedeiro, da barragem contínua de antigénios ambientais encontradas no interior do lúmen 2. O tracto intestinal separa o mundo exterior (por exemplo., Antigénios luminais) a partir do ambiente interno do hospedeiro com uma camada epitelial que é apenas uma única camada de células de espessura. Como tal, o sistema imune do intestino delgado tem a tarefa formidável de equilibrar o seu limiar de reactividade, permitindo antigénios estranhos provenientes dos micróbios dieta e comensais de introduzir a mucosa com mínima, se alguma, resposta imune, enquanto a montagem de uma resposta robusta contra patogénios invasores e outras "prejudiciais" antígenos. Respostas imunes excessiva ou inadequada para esses antígenos pode levar a doença patológica (por exemplo., Inflammadoença tory intestino, diabetes tipo I, esclerose múltipla) e deve ser evitado 06/03.
No geral, o tracto gastrointestinal é pensado para representar a maior órgão imune no corpo, contendo mais de 70% de todas as células secretoras de anticorpos 7. O sistema imunitário do intestino delgado é constituída por 3 compartimentos principais - a lâmina própria (LP), a camada intraepitelial, e placas de Peyer (PP) - que cada um contém um grupo distinto de linfócitos 2. Os linfócitos LP (LPLs) são principalmente as células TCRαβ + T com ~ células 20% de B; linfócitos intra-epiteliais (IELs) contêm células B muito poucos com mais células TCRγδ + T do que as células TCRαβ + T; e PPS, que são órgãos linfóides secundários embutidos no intestino delgado, parede contêm células ~ 80% de B. Embora cada uma destas regiões anatómicas tem funções ligeiramente distintas e bases ontológicas, elas funcionam em AHmoda armonized para proteger o hospedeiro de insultos patogénicos.
Além disso, há um crescente apreciação que a microbiota é um determinante crítico para o desenvolvimento do sistema imunitário intestinal, com o aumento do reconhecimento cognato da relação entre os micróbios e a ontogenia específicos de determinadas linhagens celulares 8,9. Além disso, dado que a formação do sistema imune intestinal afeta as respostas imunes em locais anatomicamente distantes (por ex., Artrite, esclerose múltipla, a pneumonia), tornou-se claro que o desenvolvimento do sistema imunitário do intestino é relevante para mais processos de doença do que anteriormente reconhecido 10 -12. Como tal, o interesse em avaliar quantitativamente o sistema imunológico intestinal foi muito além interações patógeno-hospedeiro para incluir agora interações hospedeiro-comensais e patogênese de muitas doenças sistêmicas bem.
Tendo em conta a variabilidade dos métodos actuais naisolamento de linfócitos intestinais, um método que é otimizado para a produção, viabilidade e consistência, equilibrando o tempo necessário é cada vez mais crítica. Os protocolos que envolvem gradientes de Percoll são tempo e trabalho intensivo e potencialmente mais propenso a erro humano, levando a um rendimento variável e viabilidade 13. Aqui, nós fornecemos um protocolo optimizado para o isolamento e caracterização de linfócitos a partir de todos os compartimentos 3 imunes no intestino delgado. Além disso, dado o interesse crescente em alterações induzidas pelo micróbio no sistema imune das mucosas, que incluem passos que podem ser utilizados para permitir a transmissão horizontal de microrganismos entre ratos para avaliar como estas alterações afectam quantitativamente o sistema imune do intestino.
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Protocol
Todos os estudos foram conduzidos em análise rigorosa e orientações de acordo com a Comissão dos Assuntos Institucionais animal Cuidado e Uso (IACUC) da Harvard Medical School, que atende aos padrões veterinários estabelecidos pela Associação Americana de Ciência Animal Laboratory (AALAS).
1. Horizontal transmissão de bactérias via co-habitação (Opcional)
- Para minimizar a contaminação exógena (especialmente se estiver usando camundongos gnotobióticos), praticar uma técnica asséptica durante a montagem gaiolas descartáveis estéreis, utilizando alimentos e água que ambos foram autoclavados.
- Use socos de ouvido ou tags para marcar individualmente 6 semanas de idade C57BL / 6 ratos que abrigam diferentes microbiotas e abrigá-los na mesma gaiola. Dado que os ratos são coprofagia e comer a partir de peletes fecais do chão da gaiola, micróbios irá, naturalmente, ser transmitida horizontalmente entre os ratinhos.
- camundongos co-casa para ≥1 semana para dar tempo para a transferência de microrganismos e mudança imunológica antes da análise. 2. Preparação de uma suspensão de células isoladas a partir da camada intra-epitelial do intestino delgado e Lâmina Própria
- Preparação de Soluções
- Prepare meios de extracção (por intestino delgado): 30 ml de RPMI + 93% 5 ul de ditiotreitol (DTT) (v / W) + 60 ul de EDTA 0,5 M + 500 uL de soro fetal de bovino (FBS). Adicione o DTT imediatamente antes da utilização.
- Prepare a mídia de digestão (por intestino delgado): 25 ml RPMI + 12,5 mg dispase + 37,5 mg de colagenase II + 300 ml FBS. Adicione o dispase e colagenase imediatamente antes da utilização.
- Para todas as incubações realizadas a 37 ° C, soluções Pré-aquecer a 37 ° C.
- Euthanize o mouse por asfixia com CO2, seguido por deslocamento cervical.
- Coloque o lado o rato dorsal para baixo e pulverizar o abdômen com etanol 70%. Use a tesoura para realizar uma laparotomia cortando sequencialmente a pele e fáscia então peritoneal ao longo da linha média ventral from da sínfise púbica até o processo xifóide, expondo a cavidade peritoneal.
- Utilize uma tesoura para separar o intestino delgado a partir do estômago, ao seccionar o esfíncter pilórico. Remova cuidadosamente o intestino delgado do peritônio, provocando afastado a gordura mesentérica.
- Para remover completamente o intestino delgado, fazer um segundo corte na junção íleo-cecal. Colocar o intestino delgado isolado em frio (isto é., 4 ° C) RPMI contendo 10% de FBS para maximizar a viabilidade celular.
- Gentilmente remover grandes pedaços de gordura usando uma pinça curva. Tenha cuidado para evitar rasgar o próprio tecido intestinal durante a tentativa de remover a gordura.
- Para remover conteúdo intestinal, intestino delicadamente lave com 15 - 20 ml de PBS frio utilizando uma agulha de alimentação 18 G aposta em uma seringa.
- Use a tesoura para extirpar PPs, e colocá-los em RPMI frio contendo 5% de FBS. PPs estão localizados no lado antimesentérica do intestino delgado e aparecem como um branco multi-lobuladamassa. Dependendo da estirpe específica, um rato tem tipicamente 8 - 12 PPs.
- Cortar o intestino delgado em 3 - 4 segmentos polegadas.
- Remover a gordura residual rolando cada segmento do intestino delgado em uma toalha de papel umedecido com RPMI, utilizando um bisturi maçante para provocar a gordura para fora do tecido.
- Rodar o tecido de dentro para fora através da canulação os segmentos intestinais com pinças curvas e agarrar a extremidade distai do tecido. Em seguida, usar um par de pinças consecutivas para remover suavemente o segmento de tecido a partir das pinças curvas (com início na extremidade proximal), resultando no tecido a ser invertido.
- Coloque segmentos de tecido em um copo contendo 30 ml de meio de extracção e uma barra de agitação. Fixar a tampa no copo, e agitar a 500 rpm durante 15 min a 37 ° C; agitação deve ser vigorosa, mas não turbulento.
- Após a incubação, usar um filtro de aço para separar pedaços de tecido a partir do sobrenadante contendo o epitélio, que deve aparecer turva. Este sobrenadante contém intraepithelial linfócitos que pode ser ainda mais analisados, se desejado, ao proceder à filtração da amostra nos passos 2.18 - 2.23.
- agitar manualmente as peças de tecidos em meio RPMI para lavar meios de extracção residuais.
- Coloque o tecido sobre uma toalha de papel seco e lançá-lo sobre a extremidade final várias vezes para facilitar a remoção de muco residuais que não foi libertada por meio de extracção.
- Coloque fragmentos de tecido em um tubo de 1,5 mL com 600 uL de meio de digestão.
- Use a tesoura para picar o tecido até peças não ficar com a tesoura e a solução aparece homogênea. Este passo é crítico para assegurar uma digestão enzimática completa do tecido.
- Adicionar o intestino delgado triturada para um copo contendo 25 ml de meio de digestão. Agita-se a 500 rpm durante 30 min a 37 ° C. No meio da digestão (ie., A 15 min), pipeta cima e para baixo com uma pipeta sorológica para ajudar a quebrar qualquer grandes pedaços de tecido.
- Filtro de tecido digerido (ou epithcamada Elial a partir do passo 2.12, se IELs processamento) através de um filtro de células 100 mm em um tubo de 50 ml. Lavar o filtro com 20 ml de RPMI contendo 10% de FBS.
- Centrifugar a solução filtrada a 500 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Cuidadosamente decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de RPMI contendo 10% de FBS.
- Filtrar células ressuspensas através de um filtro de 40 um da célula em um tubo de 50 ml. Lavar filtro com 20 ml de RPMI contendo 10% de FBS.
- Centrifugar solução filtrada a 500 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Cuidadosamente decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 ml de RPMI contendo 2% de FBS.
- Transferência excisadas PPs a um copo com 25 ml de meio de digestão e uma barra de agitação. Seguro tampa, e centrifugação a 500 rpm durante 10 min a 37 ° C.
- Filtrar PPs digerido através de um filtro de 40 um da célula em um tubo de 50 ml. Se qualquer rema aglomeradosem, pressioná-los através do filtro utilizando a extremidade plana do êmbolo de uma seringa de 1 ml.
- Lavar filtro com 10 ml de RPMI contendo 10% de FBS.
- Centrifugar solução filtrada a 500 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Cuidadosamente decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 ml de RPMI contendo 2% de FBS.
- Aliquota volume apropriado de células (por ex., A 200 ul de LPLs) numa placa de fundo redondo de 96 poços.
- Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante invertendo a placa.
- Ressuspender as células em 90 jil de meio RPMI contendo FBS a 2% e uma diluição 1: 100 de anti-CD16 / 32 (bloco Fc). Incubar durante 10 min a 4 ° C.
- Adicionar 10 ul de PBS. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante invertendo a placa.
- Ressuspender as células em 250 ul de PBS. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante atravésinvertendo a placa.
- células Mancha (opcional) com corante de viabilidade, se desejado, seguindo o protocolo do fabricante.
- Ressuspender as células em 100 ul 1% de formalina para fixar as células. Incubar durante 1 hora no escuro a 4 ° C.
- Adicionar 200 ul de PBS. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante invertendo a placa.
- Ressuspender as células em 250 ul de PBS. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante invertendo a placa.
- Ressuspender as células em 200 ul de PBS. Analise as células utilizando um citómetro de fluxo.
3. Preparação de uma suspensão de células individuais de placas de Peyer
4. manchas na superfície de Citometria de Fluxo
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Representative Results
Análise citométrica de fluxo de suspensões de células únicas de linfócitos no intestino delgado deve produzir uma população discreta de células que têm características semelhantes dispersão frontal e lateral como esplenócitos (Figuras 1A e 1B). Os linfócitos podem começam a morrer, se o tecido não é mantida a 4 ° C durante as fases iniciais do isolamento, resultando na população de linfócitos com uma dispersão frontal inferior e sendo mais difíceis de separar das outras células epiteliais e mortas (Figura 1C) . Além disso, se o tecido do intestino delgado não é completamente limpo da sua gordura mesentérica, não há praticamente uma completa perda de linfócitos (Figura 1D). Estas características ilustram como trabalhar rapidamente (ie., Não permitindo que o tecido para se aquecer) e prestando atenção aos detalhes (ie., Removendo até mesmo pequenas quantidades de gordura mesentérica) é necessária para garantir a qualidade da amostra. typically, obtemos ~ 80% de viabilidade para pequenos-intestinal LPLs (Figura 1E).
A Figura 2A demonstra como a composição da microbiota pode afectar grandemente o número de populações de células específicas. Como já demonstrado anteriormente, (GF) ratos livres de germes, que são completamente desprovido de quaisquer microorganismos, têm um sistema imunológico do intestino delgado que é marcadamente imaturo, em comparação com ratos específicos isentos de agentes patogénicos (SPF), e colonização de camundongos GF com uma microbiota normal de ratinho (MMb) resulta em restabelecimento do sistema imunitário do intestino delgado 14. Em contraste, os ratos gnotobióticos abrigando um microbioma humano normal (BLH) - e que têm um número e diversidade de bactérias fecais como ratos MMB similar - têm um sistema imunológico do intestino delgado que é indistinguível da GF ratos 14.
Aproveitandoa natureza coprofagia de ratos, camundongos co-habitação em conjunto representa um método simples, mas poderosa para permitir a transmissão horizontal de organismos entre camundongos. Esta abordagem permite uma para testar se a alteração resultante na microbiota afecta o sistema imunitário do intestino delgado. Como um exemplo, foi demonstrado que ratinhos HMB co-habitação com ratinhos MMB durante 4 semanas resultou na normalização do número de células T CD3 + CD8 + no SI LP (Figura 2B) 14. Este resultado confirma que as diferenças entre os ratos MMB e HMB observados na Figura 2A é devido às variações na microbiota entre estes ratinhos - variações que são superadas por co-habitação os ratos em conjunto.
Figura 1. Intestinal linfócitos têm FSC e SSC características semelhantes às Esplen�itos A -. D. Dparcelas ot retratando SSC e FSC para esplenócitos otimamente preparado (A) e células do intestino delgado lâmina própria (SI LP) (B - D). amostra B. O SI LP foi preparado de acordo com o protocolo descrito. C. O tecido intestinal foi intencionalmente deixada aquecer para demonstrar que as células SI LP começam a ter um menor FSC. D. A gordura mesentérica não foi feita fora do intestino delgado antes de preparar as células individuais, resultando na perda de uma população de linfócitos discernível SI LP. E. A amostra representada no painel B foi manchado no passo 4.7 com corante de viabilidade solucionáveis (por exemplo., EFluor 780) de acordo com as instruções do fabricante. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A microbiota Impactos Maturação do pequeno-intestinal do Sistema Imunológico. A. Células CD3 + T CD8 + foram enumeradas no SI LP do SPF, MMb, HMb e camundongos GF. B. HMB ratinhos foram co-alojados ratinhos com MMB durante 4 semanas antes de enumerar células T CD3 + CD8 + no SI LP. MMB e HMB ratinhos que não foram co-alojados foram analisadas para comparação. Cada ponto de dados representa um ratinho individual, e as barras horizontais reflectem a média. NS, não significativo; *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001. Figuras são reproduzidas-com permissão-de referência 14, com ligeira modificação do B. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nós apresentamos um protocolo para o isolamento e caracterização de citometria de fluxo de linfócitos pequenos-intestinal, incluindo a LPLs, IELs e linfócitos no PPs. Para aqueles interessados em avaliar como as mudanças na microbiota afetam o sistema imunológico do intestino delgado, detalhamos os passos simples envolvidos na transmissão horizontal de organismos entre os ratos que abrigam diferentes microbiotas. Embora este protocolo centra-se no intestino delgado, o procedimento é o mesmo para a análise do intestino grosso, com a única diferença de que não existem PPS para remover (embora remendos do cólon estão presentes, estes não são normalmente visíveis grosseiramente).
Há vários passos-chave para atingir o isolamento ideal de linfócitos a partir de tecido do intestino delgado. remoção meticulosa de tecido adiposo é absolutamente crucial para garantir a viabilidade dos linfócitos e rendimento óptimo. Além disso, DTT é um mucolítico fundamental usado na extracçãode células epiteliais. Dada a sua natureza instável, sugerimos armazenar alíquotas de uso único de uma solução a 5% a ≤-20 ° C e não re-congelando qualquer volume não utilizado. Embora o EDTA é utilizado no meio de extracção para auxiliar na remoção das células epiteliais 15, a sua presença - de FBS, bem como o excesso de muco ou - durante o processo de digestão pode inibir a colagenase. A concentração de colagenase usada foi demonstrada para afectar diferencialmente a expressão do marcador de superfície e 13,16,17 viabilidade celular. Além disso, dependendo do marcador de superfície de interesse, pode ser que uma formulação diferente da colagenase (por exemplo., Colagenase de tipo I, II, VI ou VIII) é óptima 13,17. Alguns optimização empírica pode ser necessária, dependendo da questão experimental específico e, devido à variação de lote para lote, o lote específico e nível de atividade relativa de colagenase. Além disso, a otimização adicional pode ser necessária, dependendo da especiic estirpe e idade dos rato usado. Por exemplo, os tempos listados aqui foram otimizados para a ~ 6 semanas de idade C57BL / 6 do mouse; para um 8 semanas de idade rato Swiss Webster ~, o tempo de digestão pode ser aumentada para 40 minutos.
Em resumo, nós fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento de linfócitos pequeno-intestinais da lâmina própria, camada intraepitelial e PPs. Uma vez dominado, pode-se razoavelmente Processo 4 ratinhos e têm suspensões de células individuais prontas para coloração em ~ 4 h. Embora nós descrevemos a coloração imediata destas células para a caracterização de citometria de fluxo, pode-se, alternativamente, estimular essas células para avaliar a produção de citoquinas, ordenar células para transcrição e / ou análises de proteómica, ou cultura de células de olhar para interacções in vitro com outros tipos de células. Além disso, enquanto focado na população de linfócitos, este protocolo pode também ser usado para examinar as células mielóides. No seu conjunto, esta abordagem simplificada para isolar única cepopulações ll de vários compartimentos intestinais permite interrogar tanto como os vários factores (por exemplo., microbiota, antígenos alimentares) influenciam a ontogenia do sistema imunológico intestinal e também como essas células podem ser relevantes em doenças extra-intestinais.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Gloves | Kimberly-Clark | 555092 | |
| sterile mouse cage | Innovive | MS2-AD | contains lid, cage bottom, and alpha-dri bedding |
| Metal feeder | Innovive | M-FEED | |
| Water bottle | Innovive | M-WB-300 | |
| Card holder | Innovive | CRD-HLD-H | |
| Autoclavable rodent chow (NIH-31M) | Zeigler | 4131207530 | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | 11875-119 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Ambion | AM9262 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GemBio | 100-510 | |
| Dispase II | Invitrogen | 17105-041 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 1.878 U/mg |
| Collagenase, type II | Invitrogen | 17101-015 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 245 U/mg |
| Dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Feeding needle (18 G, 2" length) | Roboz | FN-7905 | |
| 10 ml Syringe | BD | 305482 | |
| PBS | Gibco | 14190-250 | |
| Disposable Scalpel (15 blade) | Miltex | 4-415 | |
| Curved forceps | Roboz | RS-5211 | |
| Straight forceps | Roboz | RS-5132 | |
| Multi-purpose cups, 120 ml | VWR | 89009-662 | |
| Stir bar | VWR | 58949-062 | |
| Multi-position stir plate, 9-position | VWR | 12621-048 | |
| Stainless steel conical strainer, 3 inch | RSVP | ||
| 1.5 ml Tube | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 100 μm Cell strainer | Falcon | 08-771-19 | |
| 40 μm Cell strainer | Falcon | 08-771-1 | |
| 50 ml Conical tube | Falcon | 352098 | |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 96-well Plate, round-bottom | Corning | 3799 | |
| Anti-mouse CD16/32 (Fc block) | Biolegend | 101320 | |
| (Optional) Fixable viability dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-18 | |
| 10% Formalin, neutral buffered | Thermo Scientific | 5725 |
References
- Cummings, D. E., Overduin, J.
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14 (10), 667-685 (2014).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (5), 313-323 (2009).
- Sartor, R. B. Microbial influences in inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 134 (2), 577-594 (2008).
- Tlaskalova-Hogenova, H., et al. Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases. Immunol Lett. 93 (2-3), 97-108 (2004).
- Wen, L., et al. Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes. Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue distribution of lymphocytes and plasma cells and the role of the gut. Trends Immunol. 29 (5), author reply 209-210 206-208 (2008).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. The yin yang of bacterial polysaccharides: lessons learned from B. fragilis PSA. Immunol Rev. 245 (1), 13-26 (2012).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. Deciphering the tete-a-tete between the microbiota and the immune system. J Clin Invest. 124 (10), 4197-4203 (2014).
- Gauguet, S., et al. Intestinal microbiota of mice influences resistance to Staphylococcus aureus pneumonia. Infect Immun. , (2015).
- Ochoa-Reparaz, J., et al. A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease. Mucosal Immunol. 3 (5), 487-495 (2010).
- Wu, H. J., et al. Gut-residing segmented filamentous bacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17 cells. Immunity. 32 (6), 815-827 (2010).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Chung, H., et al. Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota. Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).
- Resendiz-Albor, A. A., Esquivel, R., Lopez-Revilla, R., Verdin, L., Moreno-Fierros, L. Striking phenotypic and functional differences in lamina propria lymphocytes from the large and small intestine of mice. Life Sci. 76 (24), 2783-2803 (2005).
- Carrasco, A., et al. Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa. J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
