Abstract
Los intestinos - que contienen el mayor número de células inmunes de cualquier órgano en el cuerpo - están constantemente expuestos a antígenos extraños, tanto microbiana y la dieta. Dada la comprensión creciente de que estos antígenos luminales ayudan a dar forma a la respuesta inmune y que la educación de las células inmunes en el intestino es crítica para un número de enfermedades sistémicas, se ha aumentado el interés en la caracterización del sistema inmunitario intestinal. Sin embargo, muchos protocolos publicados son arduo y que consume tiempo. Presentamos aquí un protocolo simplificado para el aislamiento de linfocitos de la propria del intestino delgado lámina, capa intraepitelial, y las placas de Peyer que es rápido, reproducible, y no requiere gradientes de Percoll laboriosas. Aunque el protocolo se centra en el intestino delgado, también es adecuado para el análisis de los dos puntos. Por otra parte, se destacan algunos aspectos que pueden necesitar una optimización adicional en función del ques científica específicación. Este enfoque da como resultado el aislamiento de un gran número de linfocitos viables que posteriormente se pueden utilizar para el análisis de citometría de flujo o medios alternativos de caracterización.
Introduction
La tarea principal del intestino delgado es a menudo considerada como la digestión y absorción de nutrientes 1. Si bien esta función metabólica es claramente esencial, el intestino delgado tiene un papel igualmente importante en la protección del huésped de la descarga continua de antígenos ambientales que se encuentran dentro de la luz 2. El tracto intestinal separa el mundo exterior (por ejemplo., Antígenos luminales) de el ambiente interno del huésped con una capa epitelial que es sólo una única capa de células de espesor. Como tal, el sistema inmunitario del intestino delgado tiene el formidable tarea de equilibrar su umbral para la reactividad, lo que permite antígenos extraños de la dieta y comensales microbios para entrar en la mucosa con un mínimo, en su caso, la respuesta inmune mientras que el montaje de una respuesta sólida contra la invasión de patógenos y otros antígenos "perjudiciales". Las respuestas inmunitarias excesivas o inapropiadas a estos antígenos pueden conducir a la enfermedad patológica (por ejemplo., Inflammaenfermedad toria del intestino, diabetes tipo I, esclerosis múltiple) y debe evitarse 3-6.
En general, se considera que el tracto gastrointestinal para representar el órgano más grande inmune en el cuerpo, que contiene más de 70% de todas las células 7 que secretan anticuerpo. El sistema inmunitario del intestino delgado se compone de 3 compartimentos principales - la lámina propia (LP), la capa intraepitelial, y parches de Peyer (PP) - que cada uno contiene un grupo distintivo de linfocitos 2. Los linfocitos LP (LPLS) son principalmente las células T TCRαβ con células ~ 20% de B; linfocitos intraepiteliales (IEL) contienen muy pocas células B con más células T que TCRγδ + células T TCRαβ; y PP, que son los órganos linfoides secundarios incrustados en la pared del intestino delgado, contienen células B ~ 80%. Aunque cada una de estas regiones anatómicas tiene funciones ligeramente distintas y bases ontológicas, que funcionará de ahmoda armonized para proteger al huésped de insultos patógenos.
Por otra parte, existe un creciente reconocimiento de que la microbiota es un determinante crítico para el desarrollo del sistema inmune intestinal, con un creciente reconocimiento de la relación entre los microbios específicos afines y la ontogenia de determinados linajes celulares 8,9. Además, dado que la educación del sistema inmunitario intestinal afecta a las respuestas inmunes en sitios anatómicamente distantes (por ejemplo., La artritis, la esclerosis múltiple, neumonía), se ha hecho evidente que el desarrollo del sistema inmunitario intestinal es relevante para más procesos de la enfermedad de reconocido previamente 10 -12. Como tal, el interés en evaluar cuantitativamente el sistema inmune intestinal ha extendido más allá de las interacciones huésped-patógeno para incluir ahora la interacción huésped-comensal y la patogénesis de muchas enfermedades sistémicas así.
Dada la variabilidad de los métodos actuales de laaislamiento de los linfocitos intestinales, un método que se ha optimizado para el rendimiento, la viabilidad, y la consistencia y equilibrar el tiempo requerido es cada vez más crítica. Protocolos que involucran gradientes de Percoll son el tiempo y mano de obra intensiva y potencialmente más propenso a un error humano, dando lugar a un rendimiento variable de 13 y viabilidad. En este documento, se proporciona un protocolo optimizado para el aislamiento y caracterización de linfocitos de los 3 compartimentos inmunes del intestino delgado. Además, dado el aumento de interés en alteraciones de microbios inducida en el sistema inmune de la mucosa, que incluye pasos que se pueden utilizar para permitir la transmisión horizontal de microorganismos entre los ratones para evaluar cómo estos cambios afectan cuantitativamente el sistema inmunitario intestinal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Se llevaron a cabo todos los estudios que se examina y las directrices estrictas de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Facultad de Medicina de Harvard, que cumple con los estándares veterinarios establecidos por la American Association for Laboratory Animal Science (AALAS).
1. Horizontal transmisión de bacterias a través de co-vivienda (Opcional)
- Para minimizar la contaminación exógena (sobre todo si el uso de ratones gnotobióticos), practicar una técnica aséptica durante el montaje de las jaulas estériles desechables, el uso de alimentos y agua que ambos se han tratado en autoclave.
- Use punzones para los oídos o etiquetas para marcar de forma individual 6 semanas de edad C57BL / 6 ratones que albergan diferentes microbiotas y alojarlos en la misma jaula. Dado que los ratones son coprofagia y comen bolitas fecales desde el suelo de la jaula, microbios, naturalmente, serán transmitidos horizontalmente entre los ratones.
- los ratones co-Casa en ≥1 semana para dar tiempo a que la transferencia microbiana y el cambio inmunológica antes del análisis. 2. Preparación de una suspensión de células individuales de la capa intraepitelial Small-intestinal y la lámina propia
- Preparación de las soluciones
- Preparar los medios de extracción (por intestino delgado): 30 ml de RPMI + 93 l 5% ditiotreitol (DTT) (v / w) + 60 l de EDTA 0,5 M + 500 l de suero bovino fetal (FBS). Añadir la TDT inmediatamente antes de su uso.
- Preparar los medios de digestión (por el intestino delgado): 25 ml de RPMI + 12,5 mg dispasa + 37,5 mg colagenasa II + 300 l de FBS. Añadir la colagenasa y dispasa inmediatamente antes de su uso.
- Para todas las incubaciones se realizan a 37 ° C, soluciones Precaliente a 37 ° C.
- La eutanasia a los ratones por asfixia de CO 2 seguido por dislocación cervical.
- Coloque el lado dorsal del ratón y rociar el abdomen con un 70% de etanol. Use las tijeras para realizar una laparotomía cortando secuencialmente la piel y la fascia peritoneal a continuación a lo largo de la línea media ventral lado a otrom la sínfisis púbica a la apófisis xifoides, exponiendo así a la cavidad peritoneal.
- Con unas tijeras para separar el intestino delgado desde el estómago por transección del esfínter pilórico. Retire con cuidado el intestino delgado del peritoneo, las burlas lejos la grasa mesentérica.
- Para eliminar completamente el intestino delgado, hacer un segundo corte en la unión íleo-cecal. Coloque el intestino delgado aislado en frío (es decir., 4 ° C) RPMI que contiene 10% de FBS para maximizar la viabilidad celular.
- Retire con cuidado las grandes trozos de grasa utilizando pinzas curvas. Tenga cuidado para evitar que se rompa el propio tejido intestinal al intentar quitar la grasa.
- Para eliminar el contenido intestinal, los intestinos suavemente a ras con 15 - 20 ml de PBS frío usando una aguja de alimentación 18 G colocada en una jeringa.
- Use las tijeras para extirpar PP, y colocarlos en RPMI frío que contenía FBS al 5%. EPA se encuentra en el lado antimesentérico del intestino delgado y aparecen como un blanco multi-lobuladamasa. Dependiendo de la cepa específica, un ratón normalmente tiene 8 - 12 PP.
- Cortar el intestino delgado hasta 3 - 4 pulgadas segmentos.
- Eliminar la grasa residual enrollando cada segmento del intestino delgado en una toalla de papel humedecida con RPMI, utilizando un bisturí aburrida para provocar la grasa lejos del tejido.
- Girar el tejido dentro por canulación de los segmentos intestinales con pinzas curvas y agarrar el extremo distal del tejido. A continuación, utilice un par de pinzas rectas para eliminar suavemente el segmento de tejido de las pinzas curvas (comenzando en el extremo proximal), lo que resulta en el tejido que se está invertida.
- Coloque los segmentos de tejido en un vaso que contiene 30 ml de medio de extracción y una barra de agitación. Asegure la tapa en el recipiente, y se agita a 500 rpm durante 15 minutos a 37 ° C; agitación debe ser vigorosa pero no turbulento.
- Después de la incubación, utilizar un filtro de acero para separar piezas de tejido a partir del sobrenadante que contiene epitelio, que debe aparecer turbia. Este sobrenadante contiene ilinfocitos ntraepithelial que se pueden analizar aún más, si se desea, proceder a la filtración de la muestra en los pasos 2.18 - 2.23.
- agitar manualmente las piezas de tejido en RPMI para lavar medios de extracción residuales.
- Coloque el tejido en una toalla de papel seca y se tapa de punta a punta varias veces para facilitar la eliminación de moco residuales que no fue liberado por el medio de extracción.
- Coloque los fragmentos de tejido en un tubo de 1,5 ml con 600 l de medio de digestión.
- Use las tijeras para picar el tejido hasta que las piezas ya no se adhieren a las tijeras y la solución parece homogénea. Este paso es crítico para asegurar la digestión enzimática completa del tejido.
- Añadir el intestino delgado picada a una taza que contiene 25 ml de medio de digestión. Se agita a 500 rpm durante 30 min a 37 ° C. A mitad de camino a través de la digestión (es decir., A los 15 min), pipetear arriba y abajo con una pipeta serológica para ayudar a romper cualquier grandes trozos de tejido.
- tejido digerido Filter (o epithELIAL capa de la etapa 2.12 si va a componer de procesamiento) a través de un filtro de células de 100 micras en un tubo de 50 ml. Enjuague el filtro con 20 ml de RPMI que contenía 10% de FBS.
- Centrifugar la solución filtrada a 500 xg durante 10 min a 4 ° C.
- decantar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 ml de RPMI que contenía 10% de FBS.
- Filtro de células se resuspendió a través de un filtro de 40 micras de células en un tubo de 50 ml. Enjuague filtro con 20 ml de RPMI que contenía 10% de FBS.
- Centrifugar la solución se filtró a 500 xg durante 10 min a 4 ° C.
- decantar cuidadosamente el sobrenadante y pellet se resuspende en 1 ml de RPMI que contenía 2% de FBS.
- Transferencia extirpó PP a una taza con 25 ml de medio de fermentación y una barra de agitación. Asegure la tapa y centrifugado a 500 rpm durante 10 minutos a 37 ° C.
- Filtrar digerido PP a través de un filtro de 40 micras de células en un tubo de 50 ml. Si cualquier grupo remaen, ellos presione a través del filtro usando el extremo plano del émbolo de una jeringa de 1 ml.
- Enjuague filtro con 10 ml de RPMI que contenía 10% de FBS.
- Centrifugar la solución se filtró a 500 xg durante 10 min a 4 ° C.
- decantar cuidadosamente el sobrenadante y pellet se resuspende en 1 ml de RPMI que contenía 2% de FBS.
- Alícuota volumen apropiado de células (por ejemplo., 200 l de LPL) en una placa de fondo redondo de 96 pocillos.
- Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante por inversión de la placa.
- Resuspender las células en 90 l de RPMI que contiene FBS al 2% y una dilución 1: 100 de anti-CD16 / 32 (bloque Fc). Incubar durante 10 minutos a 4 ° C.
- Añadir 10 l de PBS. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante por inversión de la placa.
- Resuspender las células en 250 l de PBS. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante porinvirtiendo la placa.
- (Opcional) las células se tiñen con tinte de viabilidad, si se desea, siguiendo el protocolo del fabricante.
- Resuspender las células en 100 l 1% de formalina para fijar las células. Incubar durante 1 hora en la oscuridad a 4 ° C.
- Añadir 200 l de PBS. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante por inversión de la placa.
- Resuspender las células en 250 l de PBS. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante por inversión de la placa.
- Resuspender las células en 200 l de PBS. Analizar las células utilizando un citómetro de flujo.
3. Preparación de una suspensión de células individuales de las placas de Peyer
4. La tinción de pavimentación de Citometría de Flujo
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Análisis citométrico de flujo suspensiones de células individuales de linfocitos pequeños intestinal debe producir una discreta población de células que tienen similares dispersión frontal y lateral características como esplenocitos (Figuras 1A y 1B). Los linfocitos pueden comenzar a morir si el tejido no se mantiene a 4 ° C durante las etapas iniciales del aislamiento, lo que resulta en la población de linfocitos que tiene una dispersión frontal inferior y ser más difíciles de separar de otras células epiteliales y muertas (Figura 1C) . Por otra parte, si el tejido del intestino delgado no se limpia completamente de su grasa mesentérica, no hay prácticamente una pérdida completa de linfocitos (Figura 1D). Estas características ilustran la forma en que trabaja rápidamente (es decir., No permitiendo que el tejido se caliente) y prestando atención a los detalles (es decir., La eliminación de incluso pequeñas cantidades de grasa mesentérica) es necesario para garantizar la calidad de la muestra. typicaLLY, obtenemos ~ 80% de viabilidad para la LPL del intestino delgado (Figura 1E).
La Figura 2A muestra cómo la composición de la microbiota puede afectar en gran medida el número de poblaciones de células específicas. Como hemos demostrado anteriormente, (GF) los ratones libres de gérmenes, que son completamente desprovisto de cualquier microorganismo, tienen un sistema inmunológico del intestino delgado que es notablemente inmadura en comparación con los ratones libres de patógenos específicos (SPF), y la colonización de los ratones GF con una microbiota normal de ratón (MMB) da como resultado la restauración del sistema inmunitario del intestino delgado 14. En contraste, los ratones gnotobióticos albergar una microbiota humana normal (HMB) - y que tienen un número y diversidad de bacterias fecales como ratones MMB similares - tener un sistema inmunitario del intestino delgado que es indistinguible de la de los ratones GF 14.
Aprovechandola naturaleza coprofagia de los ratones, los ratones co-vivienda en conjunto representa un método simple, pero potente para permitir la transmisión horizontal de organismos entre los ratones. Este enfoque permite una para probar si el cambio resultante en la microbiota afecta al sistema inmunitario del intestino delgado. A modo de ejemplo, hemos demostrado que los ratones HMB co-vivienda con ratones MMB durante 4 semanas dio lugar a la normalización del número de células T CD3 + CD8 + en el SI LP (Figura 2B) 14. Este resultado confirma que las diferencias entre los ratones MMB y HMB observados en la Figura 2A es debido a variaciones en la microbiota entre estos ratones - variaciones que se superan por la co-vivienda los ratones juntos.
Figura 1. Intestinal Los linfocitos tienen FSC y SSC características similares a esplenocitos A -. D. Dot parcelas que representan SSC y FSC para esplenocitos preparados de forma óptima (A) y las células del intestino delgado de la lámina propia (LP) SI (B - D). muestra B. La SI LP se preparó de acuerdo con el protocolo descrito. C. El tejido intestinal se dejó intencionadamente calentar a demostrar que las células LP SI comenzar a tener un FSC inferior. D. La grasa mesentérica no se elimina del intestino delgado antes de preparar las células individuales, lo que resulta en la pérdida de un discernible SI LP población de linfocitos. E. La muestra se muestra en el panel B se tiñó en el paso 4.7 con el tinte de viabilidad puede arreglar (por ejemplo., EFluor 780) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La microbiota Impactos Maduración del Pequeño-intestinal sistema inmunológico. A. Células T CD3 + CD8 + se enumeraron en el SI LP del SPF, MMb, HMB, y los ratones GF. B. ratones HMB fueron co-ubicado con los ratones MMB durante 4 semanas antes de la enumeración de las células T CD3 + CD8 + en el SI LP. MMB ratones y HMB que no fueron co-albergaban fueron analizados para la comparación. Cada punto de datos representa un ratón individual, y las barras horizontales reflejan la media. NS: no significativo; *, P <0,05; **, P <0,01; *** P <0,001. Las cifras se reproducen con permiso-de-referencia 14, con una ligera modificación de B. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Se presenta un protocolo para el aislamiento y caracterización de citometría de los linfocitos del intestino delgado, incluyendo la LPL va a componer, y linfocitos en el PP de flujo. Para los interesados en la evaluación de cómo los cambios en la microbiota afectan el sistema inmunológico del intestino delgado, se detallan los pasos sencillos que intervienen en la transmisión horizontal de organismos entre los ratones que albergan diferentes microorganismos involucrados. Aunque este protocolo se centra en el intestino delgado, el procedimiento es el mismo para el análisis del intestino grueso, con la única diferencia de que no hay PPs para eliminar (aunque parches colon están presentes, éstos normalmente no son totalmente visible).
Hay varios pasos clave para lograr un óptimo aislamiento de linfocitos a partir de tejido del intestino delgado. la eliminación meticulosa de tejido adiposo es absolutamente crítico para asegurar la viabilidad de los linfocitos y el rendimiento óptimo. Además, DTT es un mucolítico fundamental utilizado en la extracciónde las células epiteliales. Dada su naturaleza inestable, sugerimos almacenar alícuotas de un solo uso de una solución al 5% a ≤-20 ° C y no volver a congelar cualquier volumen no utilizado. Aunque EDTA se utiliza en el medio de extracción para ayudar en la eliminación de las células epiteliales de 15, su presencia -, así como el exceso de FBS o moco - durante el proceso de la digestión pueden inhibir la colagenasa. La concentración de colagenasa utilizado se ha demostrado que afectan diferencialmente a la expresión de marcadores de superficie y 13,16,17 viabilidad celular. Por otra parte, dependiendo del marcador de superficie de interés, puede ser que una formulación diferente de la colagenasa (por ejemplo., Colagenasa de tipo I, II, VI, o VIII) es óptima 13,17. Algunos optimización empírica puede ser necesaria dependiendo de la pregunta experimental específico y, debido a la variación de lote a lote, el lote específico y el nivel de actividad relativa de la colagenasa. Por otra parte, la optimización adicional puede ser necesario dependiendo de la espeic cepa y edad de ratón utilizados. Por ejemplo, los períodos mencionados aquí se han optimizado para una semana de edad ~ 6 ratón C57BL / 6; para un ~ 8 semanas de edad de ratón Swiss Webster, el tiempo de digestión puede aumentarse a 40 minutos.
En resumen, hemos proporcionado un protocolo detallado para el aislamiento de linfocitos del intestino delgado de la lámina propia, capa intraepitelial y PP. Una vez dominado, uno razonablemente puede procesar 4 ratones y tienen suspensiones de células individuales listos para la tinción de ~ 4 horas. Aunque se describe la tinción inmediata de estas células para la caracterización de citometría de flujo, uno alternativamente pueden estimular estas células para evaluar la producción de citoquinas, ordenar las células para la transcripción y / o análisis proteómicos, o cultivo de las células para mirar las interacciones in vitro con otros tipos de células. Por otra parte, mientras que nos centramos en la población de linfocitos, este protocolo también se puede utilizar para examinar células mieloides. En su conjunto, este enfoque simplificado para aislar solo CEpoblaciones ll de varios compartimentos intestinales permite interrogar tanto cómo diversos factores (por ejemplo., microbiota, antígenos de la dieta) influyen en la ontogenia del sistema inmunitario intestinal y también cómo estas células pueden ser relevantes en las enfermedades extra-intestinales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Gloves | Kimberly-Clark | 555092 | |
| sterile mouse cage | Innovive | MS2-AD | contains lid, cage bottom, and alpha-dri bedding |
| Metal feeder | Innovive | M-FEED | |
| Water bottle | Innovive | M-WB-300 | |
| Card holder | Innovive | CRD-HLD-H | |
| Autoclavable rodent chow (NIH-31M) | Zeigler | 4131207530 | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | 11875-119 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Ambion | AM9262 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GemBio | 100-510 | |
| Dispase II | Invitrogen | 17105-041 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 1.878 U/mg |
| Collagenase, type II | Invitrogen | 17101-015 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 245 U/mg |
| Dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Feeding needle (18 G, 2" length) | Roboz | FN-7905 | |
| 10 ml Syringe | BD | 305482 | |
| PBS | Gibco | 14190-250 | |
| Disposable Scalpel (15 blade) | Miltex | 4-415 | |
| Curved forceps | Roboz | RS-5211 | |
| Straight forceps | Roboz | RS-5132 | |
| Multi-purpose cups, 120 ml | VWR | 89009-662 | |
| Stir bar | VWR | 58949-062 | |
| Multi-position stir plate, 9-position | VWR | 12621-048 | |
| Stainless steel conical strainer, 3 inch | RSVP | ||
| 1.5 ml Tube | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 100 μm Cell strainer | Falcon | 08-771-19 | |
| 40 μm Cell strainer | Falcon | 08-771-1 | |
| 50 ml Conical tube | Falcon | 352098 | |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 96-well Plate, round-bottom | Corning | 3799 | |
| Anti-mouse CD16/32 (Fc block) | Biolegend | 101320 | |
| (Optional) Fixable viability dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-18 | |
| 10% Formalin, neutral buffered | Thermo Scientific | 5725 |
References
- Cummings, D. E., Overduin, J.
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14 (10), 667-685 (2014).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (5), 313-323 (2009).
- Sartor, R. B. Microbial influences in inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 134 (2), 577-594 (2008).
- Tlaskalova-Hogenova, H., et al. Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases. Immunol Lett. 93 (2-3), 97-108 (2004).
- Wen, L., et al. Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes. Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue distribution of lymphocytes and plasma cells and the role of the gut. Trends Immunol. 29 (5), author reply 209-210 206-208 (2008).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. The yin yang of bacterial polysaccharides: lessons learned from B. fragilis PSA. Immunol Rev. 245 (1), 13-26 (2012).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. Deciphering the tete-a-tete between the microbiota and the immune system. J Clin Invest. 124 (10), 4197-4203 (2014).
- Gauguet, S., et al. Intestinal microbiota of mice influences resistance to Staphylococcus aureus pneumonia. Infect Immun. , (2015).
- Ochoa-Reparaz, J., et al. A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease. Mucosal Immunol. 3 (5), 487-495 (2010).
- Wu, H. J., et al. Gut-residing segmented filamentous bacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17 cells. Immunity. 32 (6), 815-827 (2010).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Chung, H., et al. Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota. Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).
- Resendiz-Albor, A. A., Esquivel, R., Lopez-Revilla, R., Verdin, L., Moreno-Fierros, L. Striking phenotypic and functional differences in lamina propria lymphocytes from the large and small intestine of mice. Life Sci. 76 (24), 2783-2803 (2005).
- Carrasco, A., et al. Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa. J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
