Abstract
המעיים - אשר מכילים את המספר הגדול ביותר של תאי מערכת החיסון של כל איבר בגוף - חשופים כל הזמן אנטיגנים זרים, הן חיידקים תזונתיים. בהתחשב שיש לנו הבנה גוברת כי אנטיגנים לומינל אלה לעזור לעצב את התגובה החיסונית וחינוך של תאים חיסוניים בתוך המעי הוא קריטי עבור מספר המחלות מערכתיות, שם כבר עלה עניין באפיון מערכת החיסון במעי. עם זאת, פרוטוקולים רבים שפורסמו הם מפרך זמן רב. אנו מציגים כאן פרוטוקול פשוט עבור הבידוד של לימפוציטים מתוך שכבת הרירית מיוחדת קטנה-מעיים, שכבת intraepithelial, והטלאים של Peyer כי הוא מהיר, לשחזור, ואינו דורש הדרגתי Percoll מייגע. אף על פי הפרוטוקול מתמקד במעי הדק, זה גם מתאים ניתוח של המעי הגס. יתר על כן, אנו מדגישים היבטים מסוימים שעשויות צריך אופטימיזציה נוספת תלויים בככפרו המדעי הספציפיtion. גישה זו גורמת לבידודה של מספר גדול של לימפוציטים קיימא כי לאחר מכן ניתן להשתמש עבור ניתוח תזרים cytometric או אמצעים חלופיים של אפיון.
Introduction
המשימה העיקרית של המעי הדק נחשב לעתים קרובות להיות עיכול וספיגה של חומרים מזינים 1. בעוד תפקוד המטבולי זה חיוני בבירור, המעי הדק יש תפקיד משמעותי לא פחות בהגנת המארח מן המטח המתמיד של אנטיגנים סביבה נמצאים בתוך לומן 2. המעי מפרידה בין העולם החיצוני (למשל., אנטיגנים לומינל) מהסביבה הפנימית של המארח עם שכבת האפיתל כי היא שכבה תא בודד רק עבה. ככזה, המערכת החיסונית הקטנה-מעיים יש את המשימה האדירה של איזון הסף שלה עבור תגובתיות, המאפשר אנטיגנים זרים מן חיידקי דיאטת commensal להיכנס רירי עם מינימאלי, אם בכלל, תגובה חיסונית תוך גובר תגובה חזקה נגד פתוגנים הפולשים "מזיקים" אנטיגנים אחרים. תגובות חיסוניות מוגזמות או לא מתאימות לאנטיגנים אלה יכולים להוביל למחלות פתולוגיים (למשל., Inflammaמחלות מעי טור, סוכרת מסוג I, טרשת נפוצה) ויש להימנע מהם 3-6.
בסך הכל, מערכת העיכול הוא חשב לייצג את איבר החיסון הגדול ביותר בגוף, המכיל מעל 70% מכלל התאים מפרישי נוגדן 7. המערכת החיסונית קטן-מעיים מורכב מ -3 תאים עיקריים - שכבת הרירית המיוחדת (LP), השכבה intraepithelial, וטלאים של Peyer (PPS) - שכל אחד מהם מכיל קבוצה ייחודית של לימפוציטים 2. הלימפוציטים LP (LPLs) הם בעיקר תאי TCRαβ + T עם תאים ~ 20% B; לימפוציטים intraepithelial (IELs) מכילים תאי B מעט מאוד עם יותר תאי TCRγδ + T מאשר תאי TCRαβ + T; ו- PPS, שהן איברים הלימפה משני מוטבע בקיר הקטן-מעיים, מכיל ~ 80% תאי B. למרות שכל אחד האזורים האנטומיים הללו יש פונקציות נפרדות מעט ובסיסים אונטולוגית, הם מתפקדים אהאופנה armonized להגן המארח מפני עלבונות פתוגניים.
יתר על כן, יש הערכה גוברת כי החיידקים הוא קובע קריטי להתפתחות של מערכת חיסון במעי, עם הכרה גוברת של קשר מאותו המקור בין חיידקים ספציפיים ואת ontogeny של שושלות תאים מסוימות 8,9. יתר על כן, בהתחשב בכך החינוך של מערכת החיסון במעי משפיע התגובה החיסונית לאתרים מרוחקים מבחינה אנטומית (למשל., דלקת פרקים, טרשת נפוצה, דלקת ריאות), זה הפך להיות ברור כי פיתוח של מערכת החיסון במעי רלוונטי יותר תהליכי מחלה מאשר שהוכר בעבר 10 -12. ככזה, עניין בהערכת כמותית מערכת החיסון במעי האריך מעבר אינטראקציות בין מאכסן לפתוגן עכשיו כולל אינטראקציות בין מאכסן commensal ואת בפתוגנזה של מחלות מערכתיות רבות גם כן.
בהתחשב בשונות של שיטות קיימות בהבידוד של לימפוציטים מעיים, שיטה כי הוא מותאם במיוחד תשואה, הכדאיות, ועקביות תוך איזון ראוי בין הזמן הנדרש הוא קריטי יותר ויותר. פרוטוקולים שכוללים הדרגתיים Percoll הם זמן העבודה אינטנסיבית יותר, אשר נוטה טעות אנושה, מוביל התשואה משתנית ואת כדאיות 13. בזאת, אנו מספקים פרוטוקול אופטימיזציה עבור הבידוד והאפיון של לימפוציטים מכל 3 תאי החיסון קטנים-המעיים. בנוסף, עניין גובר נתון שינויים מושרי חיידק במערכת החיסונית ברירית, נכלולי צעדים שיכולים לשמש כדי לאפשר את ההעברה האופקית של מיקרואורגניזמים בין העכברים להעריך כיצד שינויים אלה כמותית להשפיע על המערכת החיסונית של המעי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל המחקרים נערכו בבדיקה הנחיות קפדניות על פי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד, אשר עומדת בסטנדרטים וטרינריים שקבעה האגודה האמריקאית למדע בעלי חיים מעבדה (AALAS).
1. הילוכים אופקיים של חיידקים באמצעות Co-דיור (אופציונלית)
- כדי למזער זיהום אקסוגניים (במיוחד אם באמצעות עכברי gnotobiotic), לתרגל את הטכניקה ספטית בעוד רכבת כלובים פנויים סטרילי, באמצעות מזון ומים כי יש את שניהם כבר autoclaved.
- השתמשו אגרופי אוזן או תגים בנפרד לסמן 6 בן שבוע C57BL / 6 עכברים כי נמל microbiotas שונה לשכן אותם באותו כלוב. בהתחשב בכך עכברים קופרופאגי ולאכול כדורי צואה מן רצפת הכלוב, חיידקים יועברו באופן טבעי אופקי בין העכברים.
- Co-בית עכברים ≥1 בשבוע כדי לאפשר זמן העברת חיידקים ושינוי אימונולוגית לפני הניתוח. 2. הכנת תרחיף תא בודד משכבת אינטרה-אפיתל קטן-מעי Lamina propria
- הכנת פתרונות
- הכן התקשורת החילוץ (מחיר המעי הדק): 30 מ"ל RPMI + 93 μl 5% (w / v) dithiothreitol (DTT) + 60 μl 0.5 M EDTA + 500 μl עוברי בסרום שור (FBS). מוסיפים את DTT מיד לפני השימוש.
- הכן התקשורת העיכול (מחיר המעי הדק): 25 מ"ל RPMI + 12.5 מ"ג dispase + 37.5 מ"ג collagenase II + 300 FBS μl. מוסיפים את dispase ו collagenase מיד לפני השימוש.
- לכל incubations ביצע ב 37 מעלות צלזיוס, פתרונות prewarm ל -37 מעלות צלזיוס.
- להרדים את העכבר על ידי מחנק 2 CO ואחריו נקע בצוואר הרחם.
- הנח את הצד הגבי העכבר למטה ולרסס את הבטן עם אתנול 70%. השתמש במספריים לבצע פיום בטן ברצף על ידי חיתוך העור ולאחר מכן fascia הצפק לאורך קו האמצע הגחון הלוך ושובמ 'מאחת הערווה לתהליך xiphoid, ובכך חושף את חלל הצפק.
- השתמש במספריים כדי להפריד את המעי הדק מהקיבה על ידי חוצים את הסוגר השוער. הוצא בעדינות את המעי הדק מן הצפק, מנסה לשחזר את שומן mesenteric.
- כדי להסיר את המעי הדק היטב, לעשות חתך שני בצומת ileo-cecal. מניח את המעי הדק מבודד לתוך קר (כלומר., 4 ° C) RPMI המכיל 10% FBS כדי למקסם כדאי תא.
- הוצא בעדינות חתיכות גדולות של שומן באמצעות מלקחיים מעוקלים. היזהר כדי למנוע קריעה של רקמת המעי עצמו בעת שניסה להסיר שומן.
- כדי להסיר תוכן המעיים, המעיים סומק בעדינות עם 15 - 20 מ"ל של PBS קר באמצעות מחט האכלה 18 G מודבקת מזרק.
- השתמש במספריים שיחתוך PPS, ולהכניס אותם לתוך RPMI קר המכיל FBS 5%. PPS ממוקמים בצד antimesenteric של המעי הדק להופיע בתור רב lobulated לבןמסה. בהתאם לזן הספציפי, עכבר בדרך כלל יש 8 - 12 PPS.
- חותכים את המעי הדק לתוך 3 - 4 מגזרים אינץ.
- הסר שומן שייר ידי גלגול בכל מגזר קטן-מעיים על מגבת נייר טבולה RPMI, באמצעות אזמל משעמם להקניט את השומן מן הרקמה.
- סובב את הרקמות מבפנים החוצה על ידי cannulating מגזרי המעיים עם מלקחיים מעוקלים לתפוס את הקצה הדיסטלי של הרקמה. לאחר מכן השתמש זוג ישר מלקחיים כדי להסיר את קטע הרקמה בעדינות מן המלקחיים המעוקלים (החל בסוף הפרוקסימלי), וכתוצאה מכך הרקמה להיות הפוכה.
- מניחים קטעי רקמה בתוך כוס המכילה 30 מ"ל של התקשורת החילוץ ובר ומערבבים. אבטח את המכסה על הכוס, ומערבבים ב 500 סל"ד במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס; ערבוב צריך להיות נמרץ אבל לא מעורבב.
- לאחר דגירה, להשתמש מסננת פלדה להפריד חתיכות רקמה מן supernatant המכיל האפיתל, שאמורה להופיע מעונן. supernatant זה מכיל iלימפוציטים ntraepithelial כי ניתן לנתח עוד יותר, אם תרצה בכך, על ידי שתמשיך סינון המדגם בצעדים 2.18 - 2.23.
- ידני להתסיס את פיסות הרקמה ב RPMI לשטוף תקשורת חילוץ שיורית.
- מניח רקמות על מגבת נייר יבשה להעיף אותו מקצה אל מספר פעמים כדי להקל על הסרה של ריר שיורית כי לא שוחרר על ידי מדיום החילוץ.
- מניחים שברי רקמת צינור 1.5 מיליליטר עם 600 μl של מדיום עיכול.
- השתמש במספריים כדי לקצץ את הרקמה עד חתיכות כבר לא מקלות על המספריים והפתרון נראה הומוגני. שלב זה הוא קריטי על מנת להבטיח עיכול אנזימטי מלא של הרקמה.
- מוסיפים את המעי הדק טחון כוס המכילה 25 מ"ל של התקשורת העיכול. מערבבים ב 500 סל"ד במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. באמצע העיכול (כלומר., ב 15 דקות), pipet למעלה ולמטה עם pipet סרולוגיות לעזור לשבור את כל חתיכות גדולות של רקמה.
- רקמות מסננות מתעכלות (או epithשכבת elial משלב 2.12 אם IELs עיבוד) דרך מסננת תא 100 מיקרומטר לתוך צינור 50 מ"ל. יש לשטוף את מסננת עם 20 מ"ל של RPMI המכיל 10% FBS.
- צנטריפוגה הפתרון המסונן XG ב 500 במשך 10 דקות ב 4 °.
- בזהירות למזוג גלולה supernatant ו resuspend ב 1 מ"ל של RPMI המכיל 10% FBS.
- סנן resuspended התאים דרך מסננת תא 40 מיקרומטר לתוך שפופרת 50 מ"ל. לשטוף מסננת עם 20 מ"ל של RPMI המכיל 10% FBS.
- צנטריפוגה מסונן פתרון XG ב 500 במשך 10 דקות ב 4 ° C.
- בזהירות למזוג supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ"ל של RPMI המכיל 2% FBS.
- העברת נכרת PPS לכוס עם 25 מ"ל של התקשורת העיכול ובר ומערבבים. מכסה מאובטח, ספין ב 500 סל"ד במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- סנן מתעכל PPS דרך מסננת 40 מיקרומטר התא לתוך צינור 50 מ"ל. אם כל הרמ"א גושיםב, ללחוץ אותם דרך מסננת בעזרת קצה השטוח של הבוכנה של מזרק 1 מ"ל.
- לשטוף מסננת עם 10 מ"ל של RPMI המכיל 10% FBS.
- צנטריפוגה מסונן פתרון XG ב 500 במשך 10 דקות ב 4 ° C.
- בזהירות למזוג supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ"ל של RPMI המכיל 2% FBS.
- נפח Aliquot המתאים של תאים (למשל., 200 μl של LPLs) לתוך צלחת 96-היטב מסביב לתחתית.
- צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. למזוג supernatant על ידי היפוך לצלחת.
- תאים Resuspend ב 90 μl של RPMI המכיל 2% FBS ו דילול 1: 100 של אנטי CD16 / 32 (בלוק Fc). דגירה של 10 דקות ב 4 ° C..
- הוסף 10 μl PBS. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. למזוג supernatant על ידי היפוך לצלחת.
- תאים Resuspend ב 250 μl PBS. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. supernatant למזוג ידיהיפוך לצלחת.
- (אופציונליים) תאי כתם עם צבע כדאיות, אם ירצו בכך, על ידי ביצוע הפרוטוקול של היצרן.
- תאים Resuspend בפורמלין 100 μl 1% לתקן את התאים. דגירה עבור שעה 1 בחושך ב 4 ° C..
- הוסף 200 μl PBS. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. למזוג supernatant על ידי היפוך לצלחת.
- תאים Resuspend ב 250 μl PBS. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. למזוג supernatant על ידי היפוך לצלחת.
- תאים Resuspend ב 200 μl PBS. לנתח תאים באמצעות cytometer זרימה.
3. הכנת ההשעיה תא בודד מתוך תיקונים של Peyer
4. מכתים שטחי cytometry זרימה
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתוח תזרים cytometric של המתלים תא בודד של לימפוציטים קטנים-מעיים אמור להניב אוכלוסייה דיסקרטית של תאים בעלי מאפיינים דומים קדימה פיזור בצד כמו splenocytes (איורים 1 א ו -1 B). הלימפוציטים עשויים להתחיל למות אם הרקמה אינה נשמרת ב 4 ° C. במהלך השלבים הראשונים של בידוד, וכתוצאה מכך אוכלוסיית הלימפוציטים בעל פיזור קדימה נמוך ולהיות יותר קשה להפריד מתאי אפיתל מתים אחרים (איור 1 ג) . יתר על כן, אם הרקמה קטנה-מעיים לא ניקתה לחלוטין של שומן mesenteric שלה, אין כמעט אובדן מוחלט של לימפוציטים (איור 1D). תכונות אלה ממחישים כיצד עובד מהר (כלומר., שאינו מאפשר את הרקמה כדי להתחמם) ולשלם תשומת לב לפרטים (כלומר., הסרת אפילו כמויות קטנות של שומן mesenteric) הוא הכרחי על מנת להבטיח איכות המדגם. Typically, נקבל ~ 80% כדאיות עבור LPLs הקטן-מעיים (איור 1E).
איור 2 א ממחיש עד כמה הרכב החיידקים יכולים להשפיע על מספרים מאוד של אוכלוסיות תאים ספציפיים. כפי שהראנו קודם לכן, ניבטו חינם (GF) עכברים, אשר נטולים לחלוטין של כל מיקרואורגניזמים, יש מערכת חיסונית קטנה-מעיים כי הוא לא בשלה במידה ניכרת לעומת הפתוגן ללא ספציפיים (SPF) עכברים, והתנחלות של עכברי GF עם חיידקי עכבר רגילים (MMB) תוצאות שחזור המערכת החיסונית קטנה-מעי 14. לעומת זאת, בעכברי gnotobiotic מחסה חיידקי אדם נורמלים (HMB) - ויש לי כי מספר ומגוון דומים של חיידקים צואתיים כמו עכברי MMB - יש מערכת חיסונית קטנה-מעיים כי הוא נבדל מזה של עכברי GF 14.
ניצולהאופי קופרופאגי של עכברים, עכברי דיור שיתוף יחד מייצג שיטה חזקה פשוטה, אך עבור מאפשר העברה אופקית של אורגניזמים בין עכברים. גישה זו מאפשרת אחד כדי לבדוק אם השינוי וכתוצאה מכך החיידקים משפיע על מערכת החיסון הקטנה-מעיים. כדוגמא, הראינו כי עכברי שיתוף הדיור HMB עם עכברי MMB למשך 4 שבועות הביאו לנורמליזציה של מספר תאי CD3 + CD8 + T ב LP SI (איור 2 ב) 14. תוצאה זו מאשרת כי ההבדלים בין עכברי MMB ו HMB שנצפו איור 2A הוא עקב שינויי החיידקים בין עכברים אלה - הווריאציות כי הם להתגבר על ידי שיתוף דיור יחד העכברים.
יש באיור 1. מעיים לימפוציטים FSC ומאפייני SSC בדומה Splenocytes A -. ד Dמגרשים ot המתארים SSC ו FSC עבור splenocytes מוכן בצורה אופטימלית (א) ו שכבת הרירית המיוחדת קטן-מעיים (LP SI) תאים (B - D). .ב SI LP מדגם הוכן על פי הפרוטוקול המתואר. ג רקמת המעי הורשה בכוונה כדי לחמם מנת להוכיח כי SI LP התאים מתחילים להיות FSC נמוך. ד שומן mesenteric לא ניקה את המעי הדק לפני הכנת תאים בודדים, וכתוצאה מכך אובדן של אוכלוסיית הלימפוציטים להבחין SI LP. א המדגם המתואר בלוח B הוכתם בשלב 4.7 עם צבע כדאיות fixable (למשל., EFluor 780) על פי הוראות היצרן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. ההבשלה משפיע חיידקים של-intest הקטןהמערכת החיסונית Inal. א תאי CD3 + CD8 + T היו המנויים LP SI של SPF, MMB, HMB, ועכברים GF. העכברים ב HMB היו שיתוף שוכנו עם עכברי MMB למשך 4 שבועות לפני ספירת CD3 + CD8 + T תאי LP SI. עכברי MMB ו HMB שלא היו שיתוף שוכנו נותחו להשוואה. כל נקודת נתונים מייצגת עכבר פרט, ואת הפסים האופקיים משקפים את הממוצע. NS, לא משמעותי; *, P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001. דמויות הם לשכפל-באישור-בהפניה 14, עם שינויים קלים של B. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מציגים פרוטוקול עבור הבידוד וזרימת אפיון cytometric של לימפוציטים קטנים-מעיים, כולל LPLs, IELs, ואת הלימפוציטים PPS. למעוניינים בהערכה כיצד שינויי החיידקים להשפיע על המערכת החיסונית הקטנה-מעיים, נפרטנו את השלבים הפשוטים המעורבים בהעברה האופקית של אורגניזמים בין עכברי מחסה microbiotas שונה. למרות בפרוטוקול זה מתמקד המעי הדק, ההליך הוא זהה לניתוח של המעי הגס, עם ההבדל היחיד הוא שאין PPS להסיר (אם כי תיקונים גסים נוכחים, אלה הם בדרך כלל לא גסים גלויים).
ישנם מספר צעדי מפתח בהשגת בידוד האופטימלי של לימפוציטים מרקמות קטנות-מעיים. הסרה קפדנית של רקמת שומן היא קריטית להבטחת כדאיויות הלימפוציטים ואת תשואה אופטימלית. בנוסף, DTT הוא mucolytic חיוני המשמש החילוץשל תאי אפיתל. בהתחשב באופי היציבה שלה, אנו מציעים אחסון aliquots-לייחד של פתרון 5% ≤-20 ° C ולא מחדש הקפאה כל נפח בשימוש. למרות EDTA משמש מדיום החילוץ כדי לסייע להסרת תאי אפיתל 15, נוכחותה - כמו גם עודף FBS או ריר - במהלך תהליך העיכול יכולה לעכב את collagenase. ריכוז collagenase בשימוש הודגם באופן דיפרנציאלי להשפיע ביטוי סמן פני שטח 13,16,17 כדאיות תא. יתר על כן, בהתאם על סמן משטח של עניין, זה יכול להיות כי בניסוח שונה של collagenase (למשל., סוג collagenase I, II, VI, או השמיני) הוא אופטימלי 13,17. חלק אופטימיזציה אמפירי ייתכן שיידרש בהתאם לשאלה הספציפית הניסיונית, בשל וריאציה הרבה-אל-הרבה, במגרש הספציפי ורמת פעילות היחסית של collagenase. יתר על כן, אופטימיזציה נוספת עשויה להידרש תלוי specific זן וגיל של העכבר בשימוש. לדוגמה, פעמים המפורטים כאן כבר אופטימיזציה עבור ~ 6 בשבוע העכבר C57BL / 6 הישן; עבור עכבר השויצרי וובסטר ~ 8 שבוע ישן, הפעם העיכול ניתן להעלות עד 40 דקות.
לסיכום, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור הבידוד של לימפוציטים קטנים-מעיים מן השכבה הרירית מיוחדת, שכבת intraepithelial, וה- PPS. לאחר משתלט עליו, אפשר לעבד סביר 4 עכברים יש השעיות תא בודדות מוכנות מכתים ב ~ 4 שעות. למרות שאנו מתארים את המכתים המיידי של תאים אלה לאפיון התזרים cytometric, אפשר לחלופין לעורר תאים אלה כדי להעריך ייצור ציטוקינים, למיין תאים עבור תעתיק ו / או ניתוחי proteomic, או תרבות התאים להסתכל אינטראקציות במבחנה עם סוגי תאים אחרים. יתר על כן, בעוד התמקדנו אוכלוסיית הלימפוציטים, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לבחון תאים מיאלואידית. יחדיו, גישה יעילה זו כדי לבודד ce יחידאוכלוסיות ll מן התאים שונים מעיים מאפשרות לחקור הן כיצד גורמים שונים (למשל., חיידקים, אנטיגנים תזונתיים) משפיעים על ontogeny של מערכת חיסון במעי וגם איך תאים אלה עשויים להיות רלוונטיים במחלות חוץ-מעיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Gloves | Kimberly-Clark | 555092 | |
| sterile mouse cage | Innovive | MS2-AD | contains lid, cage bottom, and alpha-dri bedding |
| Metal feeder | Innovive | M-FEED | |
| Water bottle | Innovive | M-WB-300 | |
| Card holder | Innovive | CRD-HLD-H | |
| Autoclavable rodent chow (NIH-31M) | Zeigler | 4131207530 | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | 11875-119 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Ambion | AM9262 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GemBio | 100-510 | |
| Dispase II | Invitrogen | 17105-041 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 1.878 U/mg |
| Collagenase, type II | Invitrogen | 17101-015 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 245 U/mg |
| Dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Feeding needle (18 G, 2" length) | Roboz | FN-7905 | |
| 10 ml Syringe | BD | 305482 | |
| PBS | Gibco | 14190-250 | |
| Disposable Scalpel (15 blade) | Miltex | 4-415 | |
| Curved forceps | Roboz | RS-5211 | |
| Straight forceps | Roboz | RS-5132 | |
| Multi-purpose cups, 120 ml | VWR | 89009-662 | |
| Stir bar | VWR | 58949-062 | |
| Multi-position stir plate, 9-position | VWR | 12621-048 | |
| Stainless steel conical strainer, 3 inch | RSVP | ||
| 1.5 ml Tube | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 100 μm Cell strainer | Falcon | 08-771-19 | |
| 40 μm Cell strainer | Falcon | 08-771-1 | |
| 50 ml Conical tube | Falcon | 352098 | |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 96-well Plate, round-bottom | Corning | 3799 | |
| Anti-mouse CD16/32 (Fc block) | Biolegend | 101320 | |
| (Optional) Fixable viability dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-18 | |
| 10% Formalin, neutral buffered | Thermo Scientific | 5725 |
References
- Cummings, D. E., Overduin, J.
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14 (10), 667-685 (2014).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (5), 313-323 (2009).
- Sartor, R. B. Microbial influences in inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 134 (2), 577-594 (2008).
- Tlaskalova-Hogenova, H., et al. Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases. Immunol Lett. 93 (2-3), 97-108 (2004).
- Wen, L., et al. Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes. Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue distribution of lymphocytes and plasma cells and the role of the gut. Trends Immunol. 29 (5), author reply 209-210 206-208 (2008).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. The yin yang of bacterial polysaccharides: lessons learned from B. fragilis PSA. Immunol Rev. 245 (1), 13-26 (2012).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. Deciphering the tete-a-tete between the microbiota and the immune system. J Clin Invest. 124 (10), 4197-4203 (2014).
- Gauguet, S., et al. Intestinal microbiota of mice influences resistance to Staphylococcus aureus pneumonia. Infect Immun. , (2015).
- Ochoa-Reparaz, J., et al. A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease. Mucosal Immunol. 3 (5), 487-495 (2010).
- Wu, H. J., et al. Gut-residing segmented filamentous bacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17 cells. Immunity. 32 (6), 815-827 (2010).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Chung, H., et al. Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota. Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).
- Resendiz-Albor, A. A., Esquivel, R., Lopez-Revilla, R., Verdin, L., Moreno-Fierros, L. Striking phenotypic and functional differences in lamina propria lymphocytes from the large and small intestine of mice. Life Sci. 76 (24), 2783-2803 (2005).
- Carrasco, A., et al. Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa. J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
