Abstract
腸 - 体内のあらゆる器官の免疫細胞の最大数が含まれている - 常に外来抗原、微生物および栄養の両方にさらされています。これらの管腔の抗原は、免疫応答を形作る助け、腸内の免疫細胞の教育が全身性疾患の数のために重要であることを増加理解を考えると、腸管免疫系を特徴付ける関心が高まっています。しかし、多くの公開されたプロトコルは、困難かつ時間がかかります。我々は、迅速な再現性があり、かつ面倒なパーコール勾配を必要としない小腸粘膜固有層、上皮内層、およびパイエル板からのリンパ球の単離のためにここに簡略化されたプロトコルを提示します。プロトコルは、小腸に焦点を当てているが、それはまた、結腸の分析に適しています。さらに、我々は特定の科学的QUESに応じて追加の最適化を必要とするかもしれないいくつかの側面を強調表示しましたる。このアプローチは、その後、フローサイトメトリー分析または特徴付けの代替手段を使用することができる生存可能なリンパ球の大量の単離をもたらします。
Introduction
小腸の主なタスクは、しばしば、栄養素1の消化吸収であると考えられます。この代謝機能が明らかに必須であるが、小腸内腔2内に見られる環境抗原の継続的な弾幕からホストを保護するのに等しく重要な役割を担っています。腸管外の世界を分離する（ 例えば 、管腔抗原）のみの単一細胞層の厚さである上皮層を持つホストの内部環境から。このように、小腸免疫系は、病原体の侵入に対して強固な応答を実装しながら、食事や共生微生物からの外来抗原があれば、最小限の、免疫応答と粘膜を入力することができ、反応性についてそのしきい値をバランスの手ごわい課題を有しており、その他の「有害な」抗原。これらの抗原に対する過剰または不適切な免疫応答は、病理学的疾患（ 例えば 、inflammaにつながることができます保守党腸疾患、I型糖尿病、多発性硬化症）と3-6を避けなければなりません。
全体的に、消化管は、すべて抗体分泌細胞7 70％以上含有し、体内で最大の免疫器官を表すと考えられています。粘膜固有層（LP）、上皮内層、およびパイエル板（PPS） - -小腸免疫系は、主に3つの区画で構成され、それぞれが、リンパ球2の独特のグループが含まれていること。 LPリンパ球（LPLs）は、主〜20％のB細胞とTCRαβ+ T細胞です。上皮内リンパ球（IELs）はTCRαβ+ T細胞よりもTCRγδ+ T細胞と非常に少数のB細胞が含まれています。そして小腸壁に埋め込まれた二次リンパ器官であるPPSは、〜80％のB細胞を含みます。これらの解剖学的領域のそれぞれはわずかに異なる機能と存在論的基盤を有しているが、彼らはああで機能します病原性の侮辱からホストを保護するためにファッションをarmonized。
さらに、微生物は、特定の微生物および特定の細胞系譜8,9の個体発生の間の同族関係の増加の認識で、腸管免疫系の開発のための重要な決定因子であることが成長の感謝があります。また、腸管免疫系の教育は、解剖学的に離れた部位（ 例えば 、関節炎、多発性硬化症、肺炎）で免疫応答に影響を与えることを考えると、それは以前に10を認識よりも、腸の免疫システムの開発は、より疾患プロセスに関連していることが明らかになってきました-12。同様にそのようなものとして、定量的に腸管免疫系を評価する上での関心は今ホスト共生相互作用を含むように宿主 - 病原体相互作用を超えて拡張しており、多くの全身性疾患の病因。
で現在の方法の変動性を考えます腸管リンパ球の分離、必要な時間のバランスを取ることはますます重要である一方で、収率、生存性、および一貫性のために最適化された方法。パーコール勾配が可変収量と生存率を13につながる、時間と労働集約的でヒューマンエラーへの潜在的になりやすいです伴うプロトコル。ここで、我々はすべての3小腸免疫コンパートメントからのリンパ球の単離および特徴付けのために最適化されたプロトコルを提供します。さらに、粘膜免疫系における微生物誘発性の変化関心の高まりを考えると、我々はこれらの変化を定量的に腸管免疫系にどのように影響するかを評価するためのマウスとの間の微生物の水平方向の伝送を可能にするために使用することができるステップが含まれます。
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Protocol
すべての研究は、実験動物学のためのアメリカ協会（AALAS）によって設定された獣医の基準を満たしているハーバード・メディカルスクールの施設内動物管理使用委員会（IACUC）に従って厳格な審査とガイドライン下で行いました。
共同住宅（オプション）を介して細菌の1水平伝播
- 食品との両方がオートクレーブ処理された水を使用して、無菌の使い捨てケージを組み立てながら（ノトバイオートマウスを用いた場合は特に）外因性の汚染を最小限に抑えるために、無菌テクニックを練習。
- 異なるmicrobiotasを保有し、同じケージでそれらを収容する6週齢のC57BL / 6マウスを個別にマークするために、耳パンチまたはタグを使用してください。マウスは食糞であり、ケージの床から糞を食べることを考えると、微生物が自然にマウスの間で水平方向に送信されます。
- ≥1週の共同住宅マウスは、分析前に微生物の転送および免疫学的変化のための時間を可能にします。 小腸上皮内のレイヤおよび固有層からの単一細胞懸濁液の調製
- 溶液の調製
- （小腸あたり）抽出媒体の準備：30ミリリットルRPMI + 93μlの5％をジチオスレイトール（DTT）（w / v）の+ 60μlの0.5 M EDTA + 500μlのウシ胎児血清（FBS）。使用直前にDTTを追加します。
- （小腸あたり）消化メディアを準備：25ミリリットルRPMI + 12.5 mgのディスパーゼ+ 37.5 mgのコラゲナーゼII + 300μlのFBS。使用直前にディスパーゼおよびコラゲナーゼを追加します。
- 37°C、37°Cにprewarmソリューションで行うすべてのインキュベーションのために。
- 頸椎脱臼に続いてCO 2窒息によりマウスを安楽死させます。
- ダウンマウスの背側に配置し、70％エタノールで腹部をスプレー。順次、あちこち腹側正中線に沿って皮膚、その後、腹膜筋膜を切断することにより開腹術を実行するためにハサミを使用して、このようにして腹腔を露出させ、剣状突起に恥骨結合をメートル。
- 幽門括約筋を横断することにより、胃から小腸を分離するためにハサミを使用してください。ゆっくり腸間膜脂肪を離れてからかって、腹膜から小腸を削除します。
- 完全に小腸を削除するには、回盲接合部で第二切断してください。寒冷に分離小腸を配置し（ すなわち 、4℃）、10％FBSを含むRPMIに細胞生存率を最大にするために。
- 緩やかに湾曲鉗子を使用して、脂肪の大部分を削除します。脂肪を除去しようとしたときに、腸組織自体を引き裂くないように注意してください。
- 注射器に取り付けられた18 G送り針を使用して冷PBSの20ミリリットル - 15で腸内容、優しくフラッシュ腸を削除します。
- PPを切除するためにハサミを使用し、5％FBSを含む冷RPMIに入れます。 PPSは、小腸のantimesenteric側に位置し、多分葉白として表示されます質量。 12のPP - 特定の菌株に応じて、マウスは、通常は8を持っています。
- 4インチのセグメント - 3に小腸をカット。
- 離れて組織から脂肪をいじめるために鈍いメスを用いて、RPMIで湿らせたペーパータオル上の各小腸セグメントを圧延することにより、残留脂肪を取り除きます。
- 湾曲した鉗子で腸セグメントをカニューレを挿入し、組織の遠位端をつかんで裏返し組織を回します。そして、そっと反転されている組織で、その結果、湾曲した鉗子（近位端で始まる）から組織セグメントを削除するには、ストレートピンセットを使用しています。
- 30抽出媒体のmlおよび撹拌棒を含むカップに組織セグメントを配置します。カップの蓋を固定し、そして37℃で15分間500rpmで攪拌。攪拌を激しくなく、乱流ではないでなければなりません。
- インキュベーション後、曇って表示されます上皮含有上清から組織片を分離するために鋼製のストレーナーを使用します。この上清は、私が含まれています2.23 - 2.18手順でサンプルを濾過するに進むことにより、所望の場合、さらに、分析することができるntraepithelialリンパ。
- 手動での残留抽出媒体を洗い流すためにRPMIで組織片を攪拌します。
- 乾いたペーパータオルで組織を置き、抽出媒体によって遊離されなかった残余の粘液の除去を容易にするために、端部の上に数回を終了フリップ。
- 消化培地600μlの1.5 mlチューブに組織片を置きます。
- 作品はもはやハサミに固執せず、溶液が均一表示されるまで、組織をミンチするはさみを使用してください。このステップでは、組織の完全な酵素消化を確保することが重要です。
- 消化メディアの25ミリリットルを含むカップにみじん切り小腸を追加します。 37℃で30分間、500rpmで攪拌します。途中で消化（ すなわち 、15分で）を介して、アップピペットおよびダウン血清学的ピペットで組織の任意の大きな塊を破壊するために役立ちます。
- フィルタ消化された組織（またはepith50ミリリットルチューブに100μmのセルストレーナーを介して処理IELs場合はステップ2.12からelial層）。 10％FBSを含むRPMI 20mlでストレーナーを洗浄します。
- 4℃で10分間、500×gでろ過した溶液を遠心。
- 慎重に10％FBSを含むRPMIの1ミリリットルで上清と再懸濁ペレットをデカント。
- フィルターを50mlチューブに40μmのセルストレーナーを介して細胞を再懸濁しました。 10％FBSを含むRPMI 20mlでストレーナーを洗浄します。
- 遠心分離機は、4℃で10分間500×gで解決策を濾過しました。
- 慎重に、2％FBSを含むRPMIの1ミリリットルで上清、およびペレットを再懸濁しデカント。
- 転送は25消化メディアのmlおよび撹拌棒をカップにのPPを切除しました。セキュアな蓋、および37℃で10分間、500 rpmでスピン。
- フィルターを50mlチューブに40μmのセルストレーナーを通してのPPを消化しました。任意の塊のREMA場合で、1mlシリンジからプランジャの平らな端を使用して、ストレーナを介してそれらを押してください。
- 10％FBSを含むRPMI 10mlでストレーナーを洗浄します。
- 遠心分離機は、4℃で10分間500×gで解決策を濾過しました。
- 慎重に、2％FBSを含むRPMIの1ミリリットルで上清、およびペレットを再懸濁しデカント。
- 細胞のアリコート適切な量（ 例えば 、LPLsの200μl）を96ウェル丸底プレートに。
- 4℃で5分間、500×gで遠心分離します。プレートを反転させて上清を除去。
- RPMI、2％FBSを含む90μlの再懸濁細胞と1：抗CD16 / 32（FCブロック）の100倍希釈。 4℃で10分間インキュベートします。
- 10μlのPBSを追加します。 4℃で5分間、500×gで遠心分離します。プレートを反転させて上清を除去。
- 250μlのPBSで細胞を再懸濁し。 4℃で5分間、500×gで遠心分離します。により上清を除去プレートを反転します。
- 生存性染料と（オプション）ステイン細胞、必要に応じて、製造業者のプロトコルに従うことによって。
- 細胞を固定するために、100μlの1％ホルマリンで細胞を再懸濁します。 4℃の暗所で1時間インキュベートします。
- 200μlのPBSを追加します。 4℃で5分間、500×gで遠心分離します。プレートを反転させて上清を除去。
- 250μlのPBSで細胞を再懸濁し。 4℃で5分間、500×gで遠心分離します。プレートを反転させて上清を除去。
- 200μlのPBSで細胞を再懸濁し。フローサイトメーターを用いて細胞を分析します。
パイエル板からの単一細胞懸濁液の調製
フローサイトメトリー用4.表面染色
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Representative Results
小腸リンパ球の単一細胞懸濁液のフローサイトメトリー分析は、脾臓細胞（ 図1Aおよび図1B）のような前方類似した側方散乱特性を有する細胞の個別の集団をもたらすべきです。リンパ球は組織が 低い前方散乱を有し、他の上皮細胞および死細胞（ 図1C）から分離するのがより困難であるリンパ球集団を生じる、分離の初期段階の間4℃に維持されていない場合に死ぬことを開始することができます。小腸組織が 完全にその腸間膜脂肪を清掃されていない場合はまた、リンパ球（ 図1D）の完全な損失が事実上存在します。これらの機能は、（ すなわち 、組織が ウォームアップすることができない）すぐに作業方法を説明し、細部に注意を払って（ すなわち 、腸間膜脂肪の少量でもの除去）サンプルの品質を確保する必要があります。 TypicaLLY、我々は小腸LPLs（ 図1E）のための〜80％ の生存率を得ます。
図2Aは、細菌叢の組成が大幅に特定の細胞集団の数に影響を与えることができる方法を示しています。我々は以前に実証されているように、任意の微生物を完全に欠いている無菌（GF）マウスは、特定病原体フリー（SPF）マウスと比較して顕著に未熟である小腸の免疫系を有し、GFマウスのコロニー形成正常マウス微生物叢（MMB）と小腸の免疫システム14の回復につながります。これとは対照的に、ノトバイオートマウスは、正常なヒトの微生物叢（HMB）を保有する-それは同様の番号とMMBのマウスのような糞便細菌の多様性を持っている- GFマウス14のものと区別がつかない小腸の免疫システムを持っています。
を生かして一緒にマウスの食糞の性質上、共同住宅マウスは、マウスとの間の生物の水平方向の伝送を可能にするための、シンプルでありながら強力な方法を表しています。このアプローチは、1は、微生物中の得られた変化は、小腸の免疫系に影響を与えるかどうかをテストすることができます。例として、SI LP（ 図2B）14におけるCD3 + CD8 + T細胞の数の正常化をもたらした4週間MMBマウスと共ハウジングHMBマウスを示しました。マウスを一緒に共ハウジングによって克服されるバリエーション-この結果は、 図2Aに観察MMBとHMBマウス間の差異は、これらのマウスの間の微生物叢の変化によるものであることを確認します。
。D. D - 図1.腸リンパ球は、脾細胞 A と同様に、FSCとSSCの特性を持っています最適に準備された脾細胞（A）及び小腸粘膜固有層（SI LP）細胞（ - D B）のためのSSCおよびFSCを描いオトプロット。 B.ザSI LP試料を記載のプロトコルに従って調製しました。 C.は、腸組織を意図的にSI LP細胞が低いFSCを持ち始めることを実証するために温めました。 D.腸間膜脂肪は、識別可能なSIのLPリンパ球集団の損失で、その結果、単一の細胞を調製する前に小腸をオフに洗浄されませんでした。パネルBに示されているE.サンプルは、製造元の指示に従って固定可能な生存性色素（ 例えば 、eFluor 780）とステップ4.7で染色した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.スモールINTESTの細菌叢への影響成熟inal免疫システム。A. CD3 + CD8 + T細胞は、SPF、MMB、HMB、及びGFマウスのSI LPに列挙しました。 B. HMBマウス前SI LPにおけるCD3 + CD8 + T細胞を列挙するに4週間MMBマウスと同時飼育しました。共に収容されていなかったMMB及びHMBマウスを比較のために分析しました。各データ点は個々のマウスを表し、水平バーは平均を反映します。 NS、有意ではありません。 *、P <0.05。 **、P <0.01。 ***はp <0.001。図を再現-とされている許可-からの参照14、Bのわずかな変更で、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
我々はLPLs、IELs、およびPP内のリンパ球を含む小腸リンパ球の単離およびフローサイトメトリーの特性評価のためのプロトコルを提示します。微生物叢の変化が小腸管免疫系にどのように影響するかを評価することに興味のある方のために、私たちの詳細異なるmicrobiotasを保有するマウスとの間の生物の水平伝達に関与する簡単な手順。このプロトコルは、小腸に焦点を当てているが、手順が唯一の違いは削除する一切のPPが（結腸パッチが存在するが、これらは通常、肉眼では見えない）が存在しないことであることで、大腸の分析のために同じです。
小腸組織からのリンパ球の最適な分離を達成するためのいくつかの重要なステップがあります。脂肪組織の細心の除去は、リンパ球の生存率と最適な収量を確保するために絶対的に重要です。また、DTTは、抽出に使用される重要な粘液溶解薬であります上皮細胞。その不安定な性質を考えると、我々は≤-20℃で5％溶液の単一使用のアリコートを貯蔵し、未使用のボリュームを再凍結はない示唆しています。 EDTAは、上皮細胞15の除去を助けるために抽出媒体で使用されているが、その存在-ならびに過剰FBSまたは粘液-消化プロセス中には、コラゲナーゼを阻害することができます。使用されるコラゲナーゼの濃度は、示差表面マーカー発現および細胞生存率13,16,17に影響を与えることが実証されています。また、関心の表面マーカーに応じて、それはコラーゲナーゼの異なる製剤であってもよい（ 例えば 、コラゲナーゼタイプI、II、VIまたはVIII）が最適である13,17。いくつかの経験的最適化は、ロット間変動、特定のロットおよびコラゲナーゼの相対的な活動レベルのために、具体的な実験の質問に応じて、必要とすることができます。さらに、追加の最適化がspecifに応じて必要になることがありますIC株およびマウスの年齢を使用します。例えば、ここに記載されている時間は〜6週齢のC57BL / 6マウスに最適化されています。 〜8週齢のスイスウェブスターマウスについて、蒸解時間は40分に増加させることができます。
要約すると、我々は小腸粘膜固有層由来のリンパ球、上皮内層、とPPSの単離のための詳細なプロトコルを提供してきました。一度習得し、1は、合理的に4匹のマウスを処理し、約4時間での染色のための準備ができて単一細胞懸濁液を持つことができます。我々は、フローサイトメトリーの特徴付けのために、これらの細胞の直接染色を説明するが、一つあるいはサイトカイン産生を評価するために、これらの細胞を刺激することができ、細胞は他の細胞型とのインビトロ相互作用を見るために転写および/ またはプロテオーム解析、または培養細胞を選別。我々は、リンパ球集団に焦点を当てながら、さらに、このプロトコルは、骨髄細胞を検査するために使用することができます。単一のCEを分離するために、一緒にこの合理化されたアプローチを取っ様々な腸の区画からLL集団は1つが両方の方法を様々な要因（ 例えば 、微生物、食物抗原）を調べることができますこれらの細胞は腸管外の疾患において関連している可能性があるか、また腸の免疫系の個体発生に影響を与えると。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Gloves | Kimberly-Clark | 555092 | |
| sterile mouse cage | Innovive | MS2-AD | contains lid, cage bottom, and alpha-dri bedding |
| Metal feeder | Innovive | M-FEED | |
| Water bottle | Innovive | M-WB-300 | |
| Card holder | Innovive | CRD-HLD-H | |
| Autoclavable rodent chow (NIH-31M) | Zeigler | 4131207530 | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | 11875-119 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Ambion | AM9262 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GemBio | 100-510 | |
| Dispase II | Invitrogen | 17105-041 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 1.878 U/mg |
| Collagenase, type II | Invitrogen | 17101-015 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 245 U/mg |
| Dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Feeding needle (18 G, 2" length) | Roboz | FN-7905 | |
| 10 ml Syringe | BD | 305482 | |
| PBS | Gibco | 14190-250 | |
| Disposable Scalpel (15 blade) | Miltex | 4-415 | |
| Curved forceps | Roboz | RS-5211 | |
| Straight forceps | Roboz | RS-5132 | |
| Multi-purpose cups, 120 ml | VWR | 89009-662 | |
| Stir bar | VWR | 58949-062 | |
| Multi-position stir plate, 9-position | VWR | 12621-048 | |
| Stainless steel conical strainer, 3 inch | RSVP | ||
| 1.5 ml Tube | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 100 μm Cell strainer | Falcon | 08-771-19 | |
| 40 μm Cell strainer | Falcon | 08-771-1 | |
| 50 ml Conical tube | Falcon | 352098 | |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 96-well Plate, round-bottom | Corning | 3799 | |
| Anti-mouse CD16/32 (Fc block) | Biolegend | 101320 | |
| (Optional) Fixable viability dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-18 | |
| 10% Formalin, neutral buffered | Thermo Scientific | 5725 |
References
- Cummings, D. E., Overduin, J.
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14 (10), 667-685 (2014).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (5), 313-323 (2009).
- Sartor, R. B. Microbial influences in inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 134 (2), 577-594 (2008).
- Tlaskalova-Hogenova, H., et al. Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases. Immunol Lett. 93 (2-3), 97-108 (2004).
- Wen, L., et al. Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes. Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue distribution of lymphocytes and plasma cells and the role of the gut. Trends Immunol. 29 (5), author reply 209-210 206-208 (2008).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. The yin yang of bacterial polysaccharides: lessons learned from B. fragilis PSA. Immunol Rev. 245 (1), 13-26 (2012).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. Deciphering the tete-a-tete between the microbiota and the immune system. J Clin Invest. 124 (10), 4197-4203 (2014).
- Gauguet, S., et al. Intestinal microbiota of mice influences resistance to Staphylococcus aureus pneumonia. Infect Immun. , (2015).
- Ochoa-Reparaz, J., et al. A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease. Mucosal Immunol. 3 (5), 487-495 (2010).
- Wu, H. J., et al. Gut-residing segmented filamentous bacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17 cells. Immunity. 32 (6), 815-827 (2010).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Chung, H., et al. Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota. Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).
- Resendiz-Albor, A. A., Esquivel, R., Lopez-Revilla, R., Verdin, L., Moreno-Fierros, L. Striking phenotypic and functional differences in lamina propria lymphocytes from the large and small intestine of mice. Life Sci. 76 (24), 2783-2803 (2005).
- Carrasco, A., et al. Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa. J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
