Abstract
Tarmarna - som innehåller det största antalet immunceller av alla organ i kroppen - utsätts ständigt för främmande antigener, både mikrobiella och kost. Med tanke på en ökande förståelse för att dessa luminala antigener hjälpa till att forma immunsvaret och att utbildning av immunceller i tarmen är avgörande för ett antal systemiska sjukdomar, har det funnits ett ökat intresse för att karaktärisera tarmimmunsystemet. Men många publicerade protokoll är mödosam och tidskrävande. Vi presenterar här ett förenklat protokoll för isolering av lymfocyter från den lilla-tarm lamina propria, intraepitelial skiktet och Peyers plack, som är snabb, reproducerbar, och inte kräver mödosamma Percoll-gradienter. Även om protokollet fokuserar på tunntarmen, är det också lämpligt för analys av tjocktarmen. Dessutom, vi belysa några aspekter som kan behöva ytterligare optimering beroende på den specifika vetenskapliga question. Detta tillvägagångssätt resulterar i isolering av ett stort antal viabla lymfocyter som sedan kan användas för flödescytometrisk analys eller alternativt sätt att karakterisering.
Introduction
Den huvudsakliga uppgiften för tunntarmen anses ofta vara matsmältningen och absorptionen av näringsämnen 1. Även om detta metabolisk funktion är absolut nödvändigt, har tunntarmen en lika viktig roll för att skydda värden från den ständiga störtflod av miljö antigener inom lumen 2. Tarmkanalen separerar omvärlden (t.ex.., Luminala antigener) från den inre miljön hos värden med en epitelial skikt som är endast ett enda cellskikt tjock. Som sådan har den lilla tarmimmunsystemet formidabel uppgift att balansera sin tröskel för reaktivitet, vilket gör att främmande antigener från kosten och kommen mikrober att komma in i slemhinnan med minimal, om någon, immunsvar medan montering av en robust svar mot invaderande patogener och andra "skadliga" antigener. Överdrivna eller olämpliga immunsvar mot dessa antigener kan leda till patologisk sjukdom (t ex., Inflammatory tarmsjukdom, typ I-diabetes, multipel skleros) och måste undvikas 3-6.
Sammantaget är mag-tarmkanalen tros representera den största immun organ i kroppen, som innehåller över 70% av alla antikroppsutsöndrande celler 7. Den lilla-tarmimmunsystemet består av 3 huvudfack - lamina propria (LP), den intraepitelial skiktet, och Peyers plack (PPS) - att var och en innehåller en distinkt grupp av lymfocyter 2. LP-lymfocyter (LPLs) är främst TCRαβ + T-celler med ~ 20% B-celler; intraepitelial lymfocyter (IELs) innehåller mycket få B-celler med fler TCRγδ + T-celler än TCRαβ + T-celler; och PP, som är sekundära lymfoida organ inbäddade i den lilla tarmväggen, innehåller ~ 80% B-celler. Även om vart och ett av dessa anatomiska regioner har något olika funktioner och ontologiska grunder, fungerar de i Aharmonized sätt för att skydda värden från patogena förolämpningar.
Dessutom finns en växande förståelse att mikroorganismer är en avgörande faktor för utvecklingen av tarmimmunsystemet, med ökande erkännandet av det besläktade förhållandet mellan specifika mikrober och ontogeni av särskilda cellinjer 8,9. Med tanke på att utbildning av tarmimmunsystemet påverkar immunsvar i anatomiskt avlägsna platser (t.ex.., Artrit, multipel skleros, lunginflammation), har det blivit tydligt att utvecklingen av tarmimmunsystemet är relevant för fler sjukdomsprocesser än tidigare redovisade 10 -12. Som sådan, har intresset för kvantitativ bedömning av tarmimmunsystemet utvidgas utöver värd-patogen interaktioner nu inkludera värdkommen interaktioner och patogenesen av många systemiska sjukdomar liksom.
Med tanke på variationen av nuvarande metoder iisolering av tarm lymfocyter, en metod som är optimerad för avkastning, livskraft och konsekvens samtidigt balansera den tid som krävs är alltmer kritisk. Protokoll som involverar Percoll gradienter är tids- och arbetskrävande och potentiellt mer benägna att mänskliga fel, vilket leder till variabel avkastning och bärkraft 13. Häri ger vi en optimerad protokoll för isolering och karakterisering av lymfocyter från alla 3 små intestinala immun fack. Dessutom, med tanke på ökat intresse för mikrob-inducerade förändringar i slemhinnans immunsystemet, inkluderar vi åtgärder som kan användas för att möjliggöra horisontell överföring av mikroorganismer mellan möss för att bedöma hur dessa förändringar kvantitativt påverkar tarmimmunsystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla studier genomfördes under noggrann granskning och riktlinjer enligt Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Harvard Medical School, som uppfyller de veterinära normer som fastställts av American Association för försöksdjursvetenskap (AALAS).
1. Horisontell Överföring av bakterier via Co-huset (tillval)
- För att minimera exogena föroreningar (i synnerhet om du använder gnotobiotisk möss), öva aseptisk teknik medan montering sterila engångs burar, med hjälp av mat och vatten som har både autoklaverats.
- Använd öron slag eller taggar för att individuellt markera sex veckor gamla C57BL / 6 möss som hyser olika microbiotas och hus dem i samma bur. Med tanke på att möss är koprofag och äta fekal pellets från buren golvet, kommer mikrober naturligtvis överföras horisontellt mellan mössen.
- Co-hus möss för ≥1 vecka för att ge tid för mikrobiell överföring och immunologisk förändring före analys. 2. Beredning av en enda cell avstängning från små-tarm intraepitelial Layer och lamina propria
- Beredning av lösningar
- Förbereda utvinnings medier (per tunntarmen): 30 ml RPMI + 93 | il 5% (vikt / volym) ditiotreitol (DTT) + 60 | j, l 0,5 M EDTA + 500 pl fetalt bovint serum (FBS). Tillsätt DTT omedelbart före användning.
- Förbered matsmältningen media (per tunntarmen): 25 ml RPMI + 12,5 mg dispas + 37,5 mg kollagenas II + 300 pl FBS. Tillsätt dispas och kollagenas omedelbart före användning.
- För alla inkubationer utförs vid 37 ° C, Förvärm lösningar till 37 ° C.
- Euthanize musen genom CO 2 kvävning följt av halsdislokation.
- Placera musen ryggsidan nedåt och spraya buken med 70% etanol. Använd sax för att utföra en laparotomi genom att sekventiellt skära huden och sedan peritoneal fascia längs den ventrala mittlinjen tillbakam blygdbenssammanfogningen till xiphoid processen och därmed exponera bukhålan.
- Använd sax för att separera tunntarmen från magsäcken genom transecting pyloric sphincter. Försiktigt bort tunntarmen från bukhinnan, retas bort mesenteriska fett.
- Att helt ta bort tunntarmen, gör en andra snitt på ileo-cecal korsning. Placera isolerade tunntarmen i kallt (dvs., 4 ° C) RPMI innehållande 10% FBS för att maximera cellernas livsduglighet.
- Försiktigt bort stora bitar av fett med hjälp av böjda pincett. Var försiktig för att undvika att riva tarmvävnaden själv samtidigt som man försöker att avlägsna fett.
- För att ta bort tarminnehåll, försiktigt spola tarmarna med 15 - 20 ml kall PBS med hjälp av en 18 G matningsnål fäst till en spruta.
- Använd sax för att skära PP, och placera dem i kallt RPMI innehållande 5% FBS. PP är belägna på antimesenteric sidan av tunntarmen och visas som en multi-lobulated vitmassa. Beroende på den specifika stammen har en mus typiskt 8 - 12 PP.
- Klipp tunntarmen i 3 - 4 tum segment.
- Avlägsna kvarvarande fett genom att rulla varje litet-tarmsegmentet på en pappershandduk fuktad med RPMI, med användning av en slö skalpell för att retas fettet bort från vävnaden.
- Vänd vävnaden ut och in genom kanyletarmsegment med böjda pincett och ta tag i bortre änden av vävnaden. Använd sedan ett par raka pincett för att försiktigt ta bort mjukpapper från de krökta pincett (börjar vid den proximala änden), vilket resulterar i den vävnad som inverteras.
- Placera vävnadssegment i en kopp som innehåller 30 ml utvinnings media och en omrörare. Säkra locket på koppen, och rör om vid 500 rpm i 15 min vid 37 ° C; omrörning bör vara kraftig men inte turbulent.
- Efter inkubation, använder en stål sil för att separera vävnadsbitar från epitel innehållande supernatanten, som ska visas grumlig. Denna supernatant innehåller intraepithelial lymfocyter som kan analyseras ytterligare, om så önskas, genom att gå vidare till att filtrera provet i steg 2,18 - 2,23.
- Manuellt agitera vävnaden bitar i RPMI för att tvätta bort kvarvarande utvinnings media.
- Placera vävnad på en torr pappershandduk och vända den ände över ände flera gånger för att underlätta avlägsnande av kvarvarande slem som inte befriades av extraktionsmediet.
- Placera vävnadsfragment i ett 1,5 ml rör med 600 l av matsmältningen medium.
- Använd sax för att mala vävnaden tills bitarna inte längre hålla sig till saxen och lösningen verkar homogen. Detta steg är avgörande för att säkerställa fullständig enzymatisk digestion av vävnaden.
- Lägga det malda tunntarmen till en kopp som innehöll 25 ml uppslutningsmediet. Rör om vid 500 rpm i 30 min vid 37 ° C. Halvvägs genom rötning (dvs., Vid 15 min), pipettera upp och ned med en serologisk pipett för att hjälpa till att bryta upp några stora bitar av vävnad.
- Filter digererad vävnad (eller epithelial skiktet från steg 2,12 om bearbetnings IELs) genom en 100 | im cellfilter in i ett 50 ml rör. Skölj silen med 20 ml RPMI innehållande 10% FBS.
- Centrifugera den filtrerade lösningen vid 500 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Dekantera försiktigt supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml RPMI innehållande 10% FBS.
- Filtret återsuspenderades cellerna genom en 40 | im cellfilter in i ett 50 ml rör. Skölj sil med 20 ml RPMI innehållande 10% FBS.
- Centrifug filtrerade lösningen vid 500 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Dekantera försiktigt supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml RPMI innehållande 2% FBS.
- Överföring exciderades PP till en kopp med 25 ml uppslutningsmedia och en omrörarstav. Säker lock, och centrifugering vid 500 rpm i 10 min vid 37 ° C.
- Filter digererad PP genom ett 40 | im cellfilter in i ett 50 ml rör. Om någon klumpar remai, pressa dem genom silen med hjälp av den platta änden av kolven från en 1 ml spruta.
- Skölj sil med 10 ml RPMI innehållande 10% FBS.
- Centrifug filtrerade lösningen vid 500 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Dekantera försiktigt supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml RPMI innehållande 2% FBS.
- Alikvot lämplig volym av celler (t ex., 200 pl LPLs) i en 96-brunnars rundbottnad platta.
- Centrifugera vid 500 xg under 5 min vid 4 ° C. Dekantera supernatanten genom att vända plattan.
- Resuspendera cellerna i 90 | il av RPMI innehållande 2% FBS och en 1: 100 spädning av anti-CD16 / 32 (Fc-block). Inkubera i 10 min vid 4 ° C.
- Tillsätt 10 | il PBS. Centrifugera vid 500 xg under 5 min vid 4 ° C. Dekantera supernatanten genom att vända plattan.
- Resuspendera cellerna i 250 pl PBS. Centrifugera vid 500 xg under 5 min vid 4 ° C. Dekantera supernatanten genomvända plattan.
- (tillval) Fläcken celler med livskraft färgämne, om så önskas, genom att följa tillverkarens protokoll.
- Resuspendera cellerna i 100 ^ 1% formalin för att fixera cellerna. Inkubera under 1 timme i mörker vid 4 ° C.
- Tillsätt 200 pl PBS. Centrifugera vid 500 xg under 5 min vid 4 ° C. Dekantera supernatanten genom att vända plattan.
- Resuspendera cellerna i 250 pl PBS. Centrifugera vid 500 xg under 5 min vid 4 ° C. Dekantera supernatanten genom att vända plattan.
- Resuspendera cellerna i 200 | il PBS. Analysera celler med användning av en flödescytometer.
3. Beredning av en enda cell avstängning från Peyers plack
4. ytfärgning för flödescytometri
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flödescytometrisk analys av enstaka cellsuspensioner av små-tarm lymfocyter bör ge en diskret population av celler som har liknande framåt- och sidospridningsegenskaper som splenocyter (figurerna 1A och 1B). Lymfocyterna kan börjar dö om vävnaden inte hålls vid 4 ° C under de inledande stegen av isolering, vilket resulterar i lymfocytpopulationen har en lägre framåtspridning och är svårare att separera från andra epiteliala och döda celler (Figur 1C) . Dessutom, om den lilla-tarmvävnaden inte är fullständigt rengjord från sin mesenterica fett, det finns praktiskt taget en fullständig förlust av lymfocyter (Figur 1D). Dessa funktioner visar hur arbetar snabbt (dvs., Inte låta vävnaden för att värma upp) och uppmärksamma på detaljer (dvs., Ta bort även små mängder av mesenteriala fett) är nödvändig för att säkerställa prov kvalitet. typically, erhåller vi ~ 80% viabilitet för små-tarm LPLs (figur 1E).
Figur 2A visar hur sammansättningen av mikrobiota hög grad kan påverka antalet specifika cellpopulationer. Som vi tidigare har visat bakteriefria (GF) möss, som är helt i avsaknad av några mikroorganismer, har en liten tarm immunförsvar som är markant omogen jämfört med specifika patogenfria (SPF) möss, och koloniseringen av GF möss med en vanlig mus floran (MMB) resulterar i återställande av den lilla tarmimmunsystemet 14. Däremot gnotobiotiska möss som härbärgerar en normal normalflora (HMB) - och som har ett liknande antal och mångfald av fekala bakterier som MMB möss - har en liten tarm immunförsvar som är omöjlig att skilja sig från GF möss 14.
Med utnyttjande avden koprofag karaktär möss, co-bostäder möss representerar tillsammans en enkel men kraftfull metod för att tillåta horisontell överföring av organismer mellan möss. Detta tillvägagångssätt gör att man kan testa om den resulterande ändringen i mikrobiota påverkar små-tarmimmunsystemet. Som ett exempel, visade vi att co-bostäder HMB möss med MMB möss under 4 veckor resulterade i normaliseringen av antalet CD3 + CD8 + T-celler i SI LP (Figur 2B) 14. Detta resultat bekräftar att skillnaderna mellan MMB och HMB-möss observerades i figur 2A är beroende på variationer i mikrobiota mellan dessa möss - variationer som övervinns genom sam-bostäder mössen tillsammans.
Figur 1. Intestinal Lymfocyter har FSC och SSC egenskaper liknande Splenocyter A -. D. Dot tomter föreställande SSC och FSC för optimalt förberedda splenocyter (A) och små-intestinal lamina propria (SI LP) celler (B - D). B. SI LP prov framställdes enligt det beskrivna protokollet. C. tarmvävnad var avsiktligt värmas till visa att SI LP celler börjar ha en lägre FSC. D. mesenteriska fett inte avlägsnas från tunntarmen innan förbereda enstaka celler, vilket resulterar i förlusten av en urskiljbar SI LP lymfocytpopulationen. E. Provet som visas i panel B var färgas i steg 4,7 med fastställbara livskraft färgämne (t ex., EFluor 780) enligt tillverkarens anvisningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. mikrobiota Effekter Mognad av Small-intestInal immunsystemet. A. CD3 + CD8 + T-celler räknades i SI LP av SPF, MMB, HMB, och GF möss. B. Hmb möss var co-inrymt med MMB möss under 4 veckor före räkna CD3 + CD8 + T-celler i SI LP. MMB och HMB möss som inte samar inrymt analyserades för jämförelse. Varje datapunkt representerar en enskild mus, och de horisontella stängerna återspeglar medelvärdet. NS, inte signifikant; *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001. Figurerna återges-med tillstånd-från 14 referens, med lätt modifiering av B. klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterar ett protokoll för isoleringen och flödescytometrisk karakterisering av små-tarm lymfocyter, däribland LPLs, IELs och lymfocyter i PPS. För dem som är intresserade av att utvärdera hur förändringar i mikrobiota påverkar små tarmimmunsystemet, vi detalj enkla stegen i horisontell överföring av organismer mellan möss som härbärgerar olika microbiotas. Även om detta protokoll är inriktat på tunntarmen, är förfarandet detsamma för analys av tjocktarmen, med den enda skillnaden är att det inte finns några PP för att ta bort (även om colonic plåster är närvarande, dessa är oftast inte är grovt synlig).
Det finns flera viktiga steg för att uppnå optimal isolering av lymfocyter från små-tarmvävnad. Noggrann borttagning av fettvävnad är helt avgörande för att säkerställa lymfocytviabiliteten och optimalt utbyte. Dessutom är DTT en avgörande mukolytiskt användas vid extraktionenav epitelceller. Med tanke på dess instabila natur, föreslår vi att lagra engångs portioner av en 5% lösning vid ≤-20 ° C och inte återfrysning oanvänd volym. Även EDTA används i extraktionsmediet för att underlätta avlägsnande av epitelceller 15, sin närvaro - liksom överskott FBS eller slem - kan under rötningsprocessen hämma kollagenas. Koncentrationen av kollagenas som används har visat sig differentiellt påverka ytmarkör expression och cellviabilitet 13,16,17. Dessutom, beroende på ytan markör för intresse, kan det vara så att en annan formulering av kollagenas (eg., Kollagenas typ I, II, VI, eller VIII) är optimal 13,17. Vissa empiriska optimering kan krävas beroende på den specifika experimentella frågan och på grund av mycket till-lot variation, den specifika partiet och relativ aktivitetsnivå kollagenas. Vidare kan ytterligare optimering krävas beroende på specific stam och ålder mus används. Till exempel har de tider som anges här är optimerade för en ~ 6 veckor gamla C57BL / 6-mus; för en ~ 8 veckor gamla schweiziska Webster-mus, kan uppslutningstiden ökas till 40 minuter.
Sammanfattningsvis har vi en detaljerad protokoll för isolering av små tarm lymfocyter från lamina propria, intraepitelial skiktet och PP. När behärskar, kan man rimligen bearbeta 4 möss och har enkelcellsuspensioner redo för färgning i ~ 4 timmar. Även om vi beskriva den omedelbara färgning av dessa celler för flödescytometrisk karakterisering, kan ett alternativt stimulera dessa celler att bedöma cytokinproduktion, sortera celler för transkriptionell och / eller proteomik analyser, eller odla cellerna för att titta på interaktioner in vitro med andra celltyper. Dessutom, även om vi fokuserat på lymfocytpopulationen, detta protokoll kan också användas för att undersöka myeloidceller. Sammantaget denna rationaliserad strategi för att isolera enstaka cell populationer från olika tarm fack gör att man kan förhöra båda hur olika faktorer (t.ex.., mikroorganismer, kost antigener) påverkar ontogenin av tarmimmunsystemet och även hur dessa celler kan vara relevant i extra-tarmsjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Gloves | Kimberly-Clark | 555092 | |
| sterile mouse cage | Innovive | MS2-AD | contains lid, cage bottom, and alpha-dri bedding |
| Metal feeder | Innovive | M-FEED | |
| Water bottle | Innovive | M-WB-300 | |
| Card holder | Innovive | CRD-HLD-H | |
| Autoclavable rodent chow (NIH-31M) | Zeigler | 4131207530 | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | 11875-119 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Ambion | AM9262 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GemBio | 100-510 | |
| Dispase II | Invitrogen | 17105-041 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 1.878 U/mg |
| Collagenase, type II | Invitrogen | 17101-015 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 245 U/mg |
| Dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Feeding needle (18 G, 2" length) | Roboz | FN-7905 | |
| 10 ml Syringe | BD | 305482 | |
| PBS | Gibco | 14190-250 | |
| Disposable Scalpel (15 blade) | Miltex | 4-415 | |
| Curved forceps | Roboz | RS-5211 | |
| Straight forceps | Roboz | RS-5132 | |
| Multi-purpose cups, 120 ml | VWR | 89009-662 | |
| Stir bar | VWR | 58949-062 | |
| Multi-position stir plate, 9-position | VWR | 12621-048 | |
| Stainless steel conical strainer, 3 inch | RSVP | ||
| 1.5 ml Tube | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 100 μm Cell strainer | Falcon | 08-771-19 | |
| 40 μm Cell strainer | Falcon | 08-771-1 | |
| 50 ml Conical tube | Falcon | 352098 | |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 96-well Plate, round-bottom | Corning | 3799 | |
| Anti-mouse CD16/32 (Fc block) | Biolegend | 101320 | |
| (Optional) Fixable viability dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-18 | |
| 10% Formalin, neutral buffered | Thermo Scientific | 5725 |
References
- Cummings, D. E., Overduin, J.
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14 (10), 667-685 (2014).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (5), 313-323 (2009).
- Sartor, R. B. Microbial influences in inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 134 (2), 577-594 (2008).
- Tlaskalova-Hogenova, H., et al. Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases. Immunol Lett. 93 (2-3), 97-108 (2004).
- Wen, L., et al. Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes. Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue distribution of lymphocytes and plasma cells and the role of the gut. Trends Immunol. 29 (5), author reply 209-210 206-208 (2008).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. The yin yang of bacterial polysaccharides: lessons learned from B. fragilis PSA. Immunol Rev. 245 (1), 13-26 (2012).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. Deciphering the tete-a-tete between the microbiota and the immune system. J Clin Invest. 124 (10), 4197-4203 (2014).
- Gauguet, S., et al. Intestinal microbiota of mice influences resistance to Staphylococcus aureus pneumonia. Infect Immun. , (2015).
- Ochoa-Reparaz, J., et al. A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease. Mucosal Immunol. 3 (5), 487-495 (2010).
- Wu, H. J., et al. Gut-residing segmented filamentous bacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17 cells. Immunity. 32 (6), 815-827 (2010).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Chung, H., et al. Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota. Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).
- Resendiz-Albor, A. A., Esquivel, R., Lopez-Revilla, R., Verdin, L., Moreno-Fierros, L. Striking phenotypic and functional differences in lamina propria lymphocytes from the large and small intestine of mice. Life Sci. 76 (24), 2783-2803 (2005).
- Carrasco, A., et al. Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa. J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
