Abstract
L'intestino - che contengono il maggior numero di cellule immunitarie di qualsiasi organo del corpo - sono costantemente esposti ad antigeni estranei, sia microbica e dietetici. Dato una maggiore comprensione che questi antigeni luminali contribuiscono a formare la risposta immunitaria e che l'istruzione di cellule immunitarie all'interno dell'intestino è critica per un certo numero di malattie sistemiche, c'è stato un crescente interesse nel caratterizzare il sistema immunitario intestinale. Tuttavia, molti protocolli pubblicati sono arduo e richiede tempo. Presentiamo qui un protocollo semplificato per l'isolamento dei linfociti dalla propria nell'intestino tenue lamina strato intraepiteliale e placche di Peyer che è rapido, riproducibile e non richiede laboriose gradienti di Percoll. Sebbene il protocollo concentra sul piccolo intestino, è adatto anche per l'analisi del colon. Inoltre, si segnalano alcuni aspetti che possono avere bisogno di ulteriore ottimizzazione a seconda della specifica ques scientificozione. Questo approccio si traduce in l'isolamento di un gran numero di linfociti vitali che possono poi essere utilizzati per analisi di citometria di flusso o sistemi alternativi per la caratterizzazione.
Introduction
Il compito principale del piccolo intestino è spesso considerata la digestione e l'assorbimento dei nutrienti 1. Anche se questa funzione metabolica è chiaramente essenziale, il piccolo intestino ha un ruolo altrettanto significativo nel proteggere l'host dallo sbarramento continuo di antigeni ambientali presenti all'interno del lume 2. Il tratto intestinale separa il mondo esterno (ad es., Antigeni luminali) dall'ambiente interno dell'ospite con uno strato epiteliale che è soltanto un singolo strato di cellule di spessore. Come tale, il piccolo-intestinale sistema immunitario ha il compito arduo di bilanciare la soglia per la reattività, permettendo antigeni estranei dalla dieta e commensali microbi per immettere la mucosa con minima o nulla, la risposta immunitaria nel montare una risposta forte contro patogeni e altri antigeni "nocivi". Risposte immunitarie eccessive o inappropriate a questi antigeni possono portare a malattie patologiche (ad es., Infiammazionimalattia Tory intestinali, diabete di tipo I, la sclerosi multipla) e deve essere evitato 3-6.
Complessivamente, il tratto gastrointestinale è pensato per rappresentare il più grande organo immunitario del corpo, contenente più del 70% di tutte le cellule secernenti anticorpi 7. Il sistema immunitario del piccolo intestino è composto da 3 compartimenti principali - lamina propria (LP), lo strato intraepiteliale e placche di Peyer (PP) - che ogni contiene un particolare gruppo di linfociti 2. I linfociti LP (LPLS) sono principalmente cellule T TCRαβ con ~ cellule del 20% B; linfociti intraepiteliali (IELS) contengono pochissime cellule B con più cellule T TCRγδ di cellule T TCRαβ; e PP, che sono gli organi linfoidi secondari incorporati nel piccolo-intestinale muro, contengono cellule ~ 80% B. Anche se ciascuna di queste regioni anatomiche ha funzioni leggermente diverse e basi ontologiche, funzionano in ahmoda armonized per proteggere l'host da insulti patogeni.
Inoltre, vi è una crescente apprezzamento che il microbiota 'critico per lo sviluppo del sistema immunitario intestinale, con crescente riconoscimento del rapporto tra cognate microbi specifici e l'ontogenesi di particolari linee cellulari 8,9. Inoltre, dato che l'educazione del sistema immunitario intestinale colpisce risposte immunitarie nei siti anatomicamente distanti (ad es., L'artrite, la sclerosi multipla, la polmonite), è diventato chiaro che lo sviluppo del sistema immunitario intestinale è rilevante per più processi di malattia rispetto al passato riconosciuto 10 -12. Come tale, l'interesse per quantitativamente valutazione del sistema immunitario intestinale si è esteso al di là di interazioni ospite-patogeno per includere ora interazioni ospite-commensale e la patogenesi di molte malattie sistemiche come bene.
Data la variabilità dei metodi attuali nellaisolamento dei linfociti intestinali, un metodo che è ottimizzato per la resa, la vitalità e la coerenza bilanciando il tempo richiesto è sempre più critica. I protocolli che coinvolgono gradienti di Percoll sono tempo e lavoro e potenzialmente più inclini a errori umani, che porta a rendimento variabile e la vitalità 13. Qui, forniamo un protocollo ottimizzato per l'isolamento e la caratterizzazione dei linfociti da tutti e 3 i comparti del sistema immunitario del piccolo intestino. Inoltre, data crescente interesse alterazioni microbo indotte nel sistema immunitario mucosale, includiamo passi che possono essere utilizzati per consentire la trasmissione orizzontale di microrganismi tra i topi di valutare come questi cambiamenti influenzano quantitativamente il sistema immunitario intestinale.
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Protocol
Tutti gli studi sono stati condotti in esame rigoroso e linee guida secondo il Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) presso la Harvard Medical School, che risponde alle norme veterinarie stabilite dalla American Association for Laboratory Animal Science (AALAS).
1. orizzontale trasmissione di batteri attraverso Co-housing (opzionale)
- Per ridurre al minimo la contaminazione esogena (in particolare se si utilizza topi gnotobiotic), praticare la tecnica asettica, mentre l'assemblaggio gabbie sterili monouso, con cibo e acqua che sono stati entrambi in autoclave.
- Utilizzare i punzoni auricolari o tag per contrassegnare individualmente 6 settimane di età C57BL / 6 topi che porto diverse microbiotas e li ospitano nella stessa gabbia. Dato che i topi sono coprofagiche e mangiare pellet fecali dal pavimento della gabbia, i microbi saranno naturalmente trasmesse orizzontalmente tra i topi.
- topi Co-house per ≥1 settimana per dare il tempo per il trasferimento microbica e di cambiamento immunologico prima dell'analisi. 2. Preparazione di una cella singola sospensione dallo strato intraepiteliale piccola intestinale e lamina propria
- Preparazione delle soluzioni
- Preparare mezzi di estrazione (per tenue): 30 ml RPMI + 93 microlitri 5% (w / v) ditiotreitolo (DTT) + 60 ml di 0,5 M EDTA + 500 microlitri di siero fetale bovino (FBS). Aggiungere il DTT immediatamente prima dell'uso.
- Preparare supporti digestione (per intestino tenue): 25 ml RPMI + 12,5 mg dispasi + 37,5 mg di collagenasi II + 300 microlitri FBS. Aggiungere il dispasi e collagenasi immediatamente prima dell'uso.
- Per tutte le incubazioni eseguite a 37 ° C, le soluzioni Preriscaldate a 37 ° C.
- Eutanasia il mouse da CO 2 asfissia seguita da dislocazione cervicale.
- Posizionare il lato del mouse dorsale verso il basso e spruzzare l'addome con il 70% di etanolo. Utilizzare le forbici per eseguire una laparotomia dalla sequenza tagliare la pelle e la fascia poi peritoneale lungo la linea mediana ventrale from sinfisi pubica al processo xifoideo, esponendo così la cavità peritoneale.
- Usare le forbici per separare il piccolo intestino dallo stomaco da sezionare lo sfintere piloro. Rimuovere delicatamente l'intestino tenue dal peritoneo, prendere in giro il grasso mesenterico.
- Per rimuovere completamente l'intestino tenue, effettuare un secondo taglio alla giunzione ileo-cecale. Posizionare il piccolo intestino isolato in fredda (es., 4 ° C) RPMI contenente 10% FBS per massimizzare la vitalità cellulare.
- Rimuovere delicatamente grandi pezzi di grasso con pinze curve. Usare cautela per evitare di strappare il tessuto intestinale in sé durante il tentativo di rimuovere il grasso.
- Per rimuovere contenuto intestinale, intestino delicatamente a filo con 15 - 20 ml di PBS freddo utilizzando un ago di alimentazione 18 G apposto una siringa.
- Usare le forbici per recidere PP, e metterli in RPMI freddo contenente il 5% di FBS. PP si trovano sul lato antimesenterico dell'intestino tenue e appare come un bianco multi-lobulatimassa. A seconda del ceppo specifico, un mouse ha tipicamente 8 - 12 PP.
- Tagliare il piccolo intestino in 3 - 4 segmenti pollici.
- Rimuovere il grasso residuo da dolci ogni piccolo-intestinale segmento su un tovagliolo di carta inumidito con RPMI, utilizzando un bisturi noioso per prendere in giro il grasso dal tessuto.
- Ruotare il tessuto all'interno da cannulating segmenti intestinali con pinze curve e afferrando l'estremità distale del tessuto. Quindi utilizzare un paio di pinze diritte per rimuovere delicatamente il segmento di tessuto dalle pinze curve (a partire dalla fine prossimale), con conseguente tessuto che viene invertita.
- Posizionare i segmenti di tessuto in una tazza contenente 30 ml di mezzi di estrazione e un ancoretta. Fissare il coperchio sulla tazza, e mescolare a 500 rpm per 15 min a 37 ° C; agitazione dovrebbe essere vigoroso, ma non turbolenta.
- Dopo l'incubazione, utilizzare un filtro in acciaio per separare pezzi di tessuto dal surnatante dell'epitelio contenente, che dovrebbe apparire torbida. Questo surnatante contiene ilinfociti ntraepithelial che può essere ulteriormente analizzati, se desiderato, procedendo a filtrare il campione in passi 2.18 - 2.23.
- Agitare manualmente i pezzi di tessuto in RPMI per lavare via i media di estrazione residui.
- Posizionare il tessuto su un tovagliolo di carta asciutto e capovolgere su se stesso più volte per facilitare la rimozione del muco residui che non è stato liberato dal mezzo di estrazione.
- Posizionare frammenti di tessuto in una provetta da 1,5 ml con 600 ml di mezzo di digestione.
- Usare le forbici per tritare il tessuto fino a pezzi aderiscono più alle forbici e la soluzione appare omogenea. Questo passaggio è fondamentale per garantire la completa digestione enzimatica del tessuto.
- Aggiungere tenue macinata ad una tazza contenente 25 ml di mezzi di digestione. Mescolare a 500 rpm per 30 min a 37 ° C. A metà della digestione (cioè., A 15 min), pipettare su e giù con una pipetta sierologica per contribuire a spezzare eventuali grossi pezzi di tessuto.
- Filtro tessuto digerito (o epithstrato Elial dal punto 2.12 se IELS di elaborazione) attraverso un colino cella di 100 micron in un tubo da 50 ml. Risciacquare il filtro con 20 ml di RPMI contenente 10% FBS.
- Centrifugare la soluzione filtrata a 500 xg per 10 min a 4 ° C.
- decantare con cautela il surnatante e risospendere pellet in 1 ml di RPMI contenente 10% FBS.
- Filtro risospeso cellule attraverso un filtro 40 micron cellule in una provetta da 50 ml. Lavare il filtro con 20 ml di RPMI contenente 10% FBS.
- Centrifugare soluzione filtrata a 500 xg per 10 min a 4 ° C.
- decantare con attenzione il surnatante, e risospendere pellet in 1 ml di RPMI contenente il 2% FBS.
- Trasferimento asportato PP ad una tazza con 25 ml di mezzi di digestione e di un ancoretta. coperchio sicuro, e far girare a 500 giri al minuto per 10 minuti a 37 ° C.
- Filtro digerito PP attraverso un filtro 40 micron cellule in una provetta da 50 ml. Se una qualsiasi grumi remain, premerli attraverso il filtro utilizzando l'estremità piatta del pistone da una siringa da 1 ml.
- Risciacquare il filtro con 10 ml di RPMI contenente 10% FBS.
- Centrifugare soluzione filtrata a 500 xg per 10 min a 4 ° C.
- decantare con attenzione il surnatante, e risospendere pellet in 1 ml di RPMI contenente il 2% FBS.
- Aliquota adeguato volume delle cellule (ad es., 200 ml di LPLS) in un piatto fondo rotondo da 96 pozzetti.
- Centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il surnatante invertendo la piastra.
- Risospendere le cellule in 90 ml di RPMI contenente il 2% FBS e una diluizione 1: 100 di CD16 anti-/ 32 (blocco FC). Incubare per 10 minuti a 4 ° C.
- Aggiungere 10 ml di PBS. Centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il surnatante invertendo la piastra.
- Risospendere le cellule in 250 l di PBS. Centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. surnatante decantareinvertendo la piastra.
- cellule Stain (opzionale) con colorante vitalità, se lo si desidera, seguendo il protocollo del produttore.
- Risospendere le cellule in 100 l 1% di formalina per fissare le cellule. Incubare per 1 ora al buio a 4 ° C.
- Aggiungere 200 l di PBS. Centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il surnatante invertendo la piastra.
- Risospendere le cellule in 250 l di PBS. Centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il surnatante invertendo la piastra.
- Risospendere le cellule in 200 l di PBS. Analizzare le cellule utilizzando un citofluorimetro.
3. Preparazione di una cella sospensione singola da placche di Peyer
4. colorazione della superficie per citometria a flusso
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Representative Results
Flusso citometria di sospensioni singola cella di piccole-intestinale linfociti dovrebbe produrre una popolazione discreta di cellule che hanno caratteristiche simili in avanti e scatter laterale come splenociti (Figure 1A e 1B). I linfociti possono cominciare a morire se il tessuto non viene mantenuta a 4 ° C durante le fasi iniziali della isolamento, con conseguente popolazione linfocitaria avente un forward scatter inferiore ed essere più difficile da separare da altre cellule epiteliali e morti (Figura 1C) . Inoltre, se il tessuto del piccolo intestino non è completamente pulito del suo grasso mesenterico, vi è praticamente una completa perdita di linfociti (Figura 1D). Queste caratteristiche illustrano come lavorare rapidamente (es., Non permettendo il tessuto si riscaldi) e prestando attenzione ai dettagli (es., Eliminando anche piccole quantità di grasso mesenterico) è necessario per garantire la qualità del campione. typically, otteniamo ~ 80% la redditività per le piccole-intestinale LPLS (Figura 1E).
Figura 2A mostra come la composizione della flora batterica può influire notevolmente il numero di specifiche popolazioni cellulari. Come abbiamo già dimostrato, (GF) topi germ-free, che sono completamente prive di eventuali microrganismi, hanno un piccolo-intestinale sistema immunitario che è decisamente immaturo rispetto a specifiche topi esenti da organismi patogeni (SPF), e la colonizzazione di topi GF con un normale microbiota del mouse (MMB) risultati di recupero dei piccoli-intestinale sistema immunitario 14. Al contrario, i topi gnotobiotic ospitare un microbiota umano normale (HMB) - e che hanno un numero e la diversità dei batteri fecali come topi MMB simile - hanno un piccolo-intestinale sistema immunitario che è indistinguibile da quella dei topi GF 14.
Sfruttandola natura coprofagiche dei topi, i topi co-housing rappresenta insieme un metodo semplice ma potente per consentire la trasmissione orizzontale di organismi tra i topi. Questo approccio permette di verificare se il cambiamento conseguente microbiota colpisce il piccolo-intestinale sistema immunitario. Come esempio, abbiamo dimostrato che topi co-housing HMB con topi MMB per 4 settimane portato alla normalizzazione del numero di cellule T CD3 + CD8 + nel SI LP (Figura 2B) 14. Questo risultato conferma che le differenze tra topi MMB e HMB osservati nella Figura 2A è dovuta a variazioni nel microbiota tra questi topi - variazioni che sono superati dalla co-housing topi insieme.
Figura 1. intestinale linfociti hanno FSC e SSC caratteristiche simili splenociti A -. D. Dtrame ot raffiguranti SSC e FSC per splenociti preparati in modo ottimale (A) e le cellule del piccolo intestino lamina propria (SI LP) (B - D). campione B. Il SI LP è stato preparato secondo il protocollo descritto. C. Il tessuto intestinale è stata intenzionalmente lasciata riscaldare a dimostrare che le cellule SI LP iniziano ad avere un FSC inferiore. D. Il grasso mesenterico non veniva fuori tenue prima di preparare singole cellule, con conseguente perdita di una discernibile SI LP popolazione linfocitaria. E. Il campione raffigurato nel pannello B era macchiata al passo 4.7 con la tintura la vitalità risolvibile (ad es., EFluor 780) secondo le istruzioni del produttore. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Il microbiota impatti maturazione della piccola intestinale sistema immunitario. A. Cellule T CD3 + CD8 sono stati enumerati nella SI LP di SPF, MMB, HMB, e topi GF. Topi B. HMB sono stati co-ospitato con i topi MMB per 4 settimane prima di enumerare le cellule T CD3 + + CD8 nel SI LP. topi MMB e HMB che non sono stati co-ospitati sono stati analizzati per il confronto. Ciascun punto di dati rappresenta un mouse individuale, e le barre orizzontali riflettono la media. NS, non significativo; *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0.001. Le figure sono riprodotte-con il permesso-da di riferimento 14, con leggera modifica B. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Vi presentiamo un protocollo per l'isolamento e il flusso caratterizzazione mediante citometria di piccole-intestinale linfociti, tra cui il LPLS, IELS, e linfociti nel PP. Per chi è interessato a valutare come i cambiamenti nel microbiota influenzano la piccola-intestinale sistema immunitario, ci dettaglio i semplici passaggi coinvolti nella trasmissione orizzontale di organismi tra i topi che ospitano diverse microbiotas. Sebbene questo protocollo concentra sul piccolo intestino, la procedura è la stessa per l'analisi dell'intestino crasso, con la sola differenza che non vi PP rimuovere (sebbene patch colon sono presenti, questi non sono in genere grossolanamente visibile).
Ci sono diversi passaggi chiave nel raggiungimento di isolamento ottimale dei linfociti dal tessuto del piccolo intestino. rimozione meticolosa del tessuto adiposo è assolutamente fondamentale per garantire la vitalità dei linfociti e la resa ottimale. Inoltre, DTT è un mucolitico cruciale utilizzato nell'estrazionedi cellule epiteliali. Data la sua natura instabile, si consiglia di memorizzare monouso aliquote di una soluzione al 5% a ≤-20 ° C e non ri-congelamento qualsiasi volume inutilizzato. Sebbene EDTA è usato nel mezzo di estrazione per facilitare la rimozione delle cellule epiteliali 15, la sua presenza - nonché eccesso FBS o muco - durante il processo di digestione possono inibire la collagenasi. La concentrazione di collagenasi utilizzato è stato dimostrato di influenzare in modo differenziale espressione marcatore di superficie e vitalità cellulare 13,16,17. Inoltre, a seconda del marcatore di superficie di interesse, è possibile che una formulazione diversa di collagenasi (ad es., Collagenasi di tipo I, II, VI o VIII) è ottimale 13,17. Alcuni ottimizzazione empirica può essere richiesto in base alla specifica domanda sperimentale e, a causa di molti-a-molti variazione, il lotto specifico e relativo livello di attività della collagenasi. Inoltre, l'ottimizzazione aggiuntivo può essere richiesto a seconda della specific ceppo ed età di mouse utilizzato. Ad esempio, i tempi indicati qui sono stati ottimizzati per un ~ 6 settimane di età C57BL / 6 del mouse; per 8 settimane di età topo ~ Swiss Webster, il tempo di digestione può essere aumentato a 40 minuti.
In sintesi, abbiamo fornito un protocollo dettagliato per l'isolamento dei linfociti piccolo-intestinali dalla lamina propria, strato intraepiteliale, e PPS. Una volta masterizzato, si può ragionevolmente elaborare 4 topi e hanno sospensioni di cellule singole pronte per la colorazione in ~ 4 ore. Anche se si descrive la colorazione immediata di queste cellule per la caratterizzazione citometria a flusso, si può in alternativa stimolare queste cellule per valutare la produzione di citochine, ordinare celle per trascrizionale e / o di analisi proteomica, o la cultura le cellule a guardare le interazioni in vitro con altri tipi di cellule. Inoltre, mentre ci siamo concentrati sulla popolazione linfocitaria, questo protocollo può anche essere utilizzato per esaminare le cellule mieloidi. Nel loro insieme, questo approccio semplificato per isolare singola cepopolazioni ll da vari compartimenti intestinali permette di interrogare sia come vari fattori (ad es., microbioti, antigeni dietetici) influenzano l'ontogenesi del sistema immunitario intestinale e anche come queste cellule possono essere rilevanti in malattie extra-intestinali.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Gloves | Kimberly-Clark | 555092 | |
| sterile mouse cage | Innovive | MS2-AD | contains lid, cage bottom, and alpha-dri bedding |
| Metal feeder | Innovive | M-FEED | |
| Water bottle | Innovive | M-WB-300 | |
| Card holder | Innovive | CRD-HLD-H | |
| Autoclavable rodent chow (NIH-31M) | Zeigler | 4131207530 | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | 11875-119 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Ambion | AM9262 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GemBio | 100-510 | |
| Dispase II | Invitrogen | 17105-041 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 1.878 U/mg |
| Collagenase, type II | Invitrogen | 17101-015 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 245 U/mg |
| Dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Feeding needle (18 G, 2" length) | Roboz | FN-7905 | |
| 10 ml Syringe | BD | 305482 | |
| PBS | Gibco | 14190-250 | |
| Disposable Scalpel (15 blade) | Miltex | 4-415 | |
| Curved forceps | Roboz | RS-5211 | |
| Straight forceps | Roboz | RS-5132 | |
| Multi-purpose cups, 120 ml | VWR | 89009-662 | |
| Stir bar | VWR | 58949-062 | |
| Multi-position stir plate, 9-position | VWR | 12621-048 | |
| Stainless steel conical strainer, 3 inch | RSVP | ||
| 1.5 ml Tube | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 100 μm Cell strainer | Falcon | 08-771-19 | |
| 40 μm Cell strainer | Falcon | 08-771-1 | |
| 50 ml Conical tube | Falcon | 352098 | |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 96-well Plate, round-bottom | Corning | 3799 | |
| Anti-mouse CD16/32 (Fc block) | Biolegend | 101320 | |
| (Optional) Fixable viability dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-18 | |
| 10% Formalin, neutral buffered | Thermo Scientific | 5725 |
References
- Cummings, D. E., Overduin, J.
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14 (10), 667-685 (2014).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (5), 313-323 (2009).
- Sartor, R. B. Microbial influences in inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 134 (2), 577-594 (2008).
- Tlaskalova-Hogenova, H., et al. Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases. Immunol Lett. 93 (2-3), 97-108 (2004).
- Wen, L., et al. Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes. Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue distribution of lymphocytes and plasma cells and the role of the gut. Trends Immunol. 29 (5), author reply 209-210 206-208 (2008).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. The yin yang of bacterial polysaccharides: lessons learned from B. fragilis PSA. Immunol Rev. 245 (1), 13-26 (2012).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. Deciphering the tete-a-tete between the microbiota and the immune system. J Clin Invest. 124 (10), 4197-4203 (2014).
- Gauguet, S., et al. Intestinal microbiota of mice influences resistance to Staphylococcus aureus pneumonia. Infect Immun. , (2015).
- Ochoa-Reparaz, J., et al. A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease. Mucosal Immunol. 3 (5), 487-495 (2010).
- Wu, H. J., et al. Gut-residing segmented filamentous bacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17 cells. Immunity. 32 (6), 815-827 (2010).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Chung, H., et al. Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota. Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).
- Resendiz-Albor, A. A., Esquivel, R., Lopez-Revilla, R., Verdin, L., Moreno-Fierros, L. Striking phenotypic and functional differences in lamina propria lymphocytes from the large and small intestine of mice. Life Sci. 76 (24), 2783-2803 (2005).
- Carrasco, A., et al. Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa. J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
