Abstract
الأمعاء - والتي تحتوي على أكبر عدد من الخلايا المناعية من أي جهاز في الجسم - تتعرض باستمرار لمستضدات أجنبية، سواء الميكروبية والغذائية. نظرا فهم متزايد بأن هذه المضادات اللمعية تساعد في تشكيل استجابة مناعية وأن التعليم من الخلايا المناعية داخل الأمعاء أمر بالغ الأهمية لعدد من الأمراض الجهازية، هناك اهتمام متزايد في وصف نظام المناعة في الأمعاء. ومع ذلك، العديد من البروتوكولات المنشورة شاقة وتستغرق وقتا طويلا. نقدم هنا بروتوكول مبسط لعزل الخلايا الليمفاوية من المخصوصة صغيرة في الأمعاء الصفيحة، طبقة داخل الظهاري، وبقع باير، على أن يكون سريع ومفيد، ولا يتطلب التدرجات Percoll شاقة. على الرغم من أن البروتوكول يركز على الأمعاء الدقيقة، بل هو أيضا مناسبة لتحليل القولون. وعلاوة على ذلك، فإننا نسلط الضوء على بعض الجوانب التي قد تحتاج إلى التحسين إضافية تبعا لسؤال كان علمي محددنشوئها. وقد أدى هذا النهج في عزل أعداد كبيرة من الخلايا الليمفاوية قابلة للحياة التي يمكن بعد ذلك أن تستخدم لتحليل تدفق cytometric أو وسائل بديلة لالتوصيف.
Introduction
وغالبا ما تعتبر المهمة الرئيسية من الأمعاء الدقيقة لتكون عملية الهضم وامتصاص المواد الغذائية 1. في حين أن هذا ظيفة التمثيل الغذائي أمر ضروري بشكل واضح، والأمعاء الدقيقة لديه دورا هاما على قدم المساواة في حماية المضيف من وابل متواصل من المضادات البيئية الموجودة داخل التجويف 2. الأمعاء يفصل بين العالم الخارجي (على سبيل المثال، المضادات اللمعية) من البيئة الداخلية للمضيف مع طبقة الظهارية التي ليست سوى طبقة خلية واحدة سميكة. على هذا النحو، والجهاز المناعي الصغيرة الأمعاء لديه مهمة هائلة من موازنة عتبته للتفاعل، مما يسمح المستضدات الأجنبية من النظام الغذائي والمتعايشة الميكروبات لدخول الغشاء المخاطي مع الحد الأدنى، إن وجدت، استجابة مناعية بينما تصاعد ردا قويا ضد غزو الجراثيم و غيرها من مستضدات "الضارة". الاستجابات المناعية المفرطة أو غير لائقة لهذه المستضدات يمكن أن يؤدي إلى مرض مرضية (على سبيل المثال، inflammaمرض المحافظين الأمعاء، نوع الأول من مرض السكري، والتصلب المتعدد) ويجب تجنب 3-6.
وبشكل عام، يعتقد أن الجهاز الهضمي لتمثيل أكبر جهاز المناعة في الجسم، وتحتوي على أكثر من 70٪ من جميع الخلايا المفرزة للأجسام المضادة 7. ويتكون الجهاز المناعي الصغيرة الأمعاء من 3 المقصورات الرئيسية - الصفيحة المخصوصة (LP)، وطبقة داخل الظهاري، وبقع باير ل(PPS) - أن كل يحتوي على مجموعة مميزة من الخلايا الليمفاوية 2. الخلايا اللمفية ليرة لبنانية (LPLs) هي في المقام الأول خلايا TCRαβ + T مع ~ الخلايا البائية 20٪. الخلايا الليمفاوية داخل الظهاري (IELs) تحتوي على عدد قليل جدا من الخلايا البائية مع المزيد من الخلايا TCRγδ + T من الخلايا TCRαβ + T. وذكر المكتب الصحفى، وهما جهازان اللمفاوية الثانوية جزءا لا يتجزأ من جدار الأمعاء الصغيرة، تحتوي على حوالي 80٪ الخلايا البائية. على الرغم من أن كل من هذه المناطق التشريحية وظائف متميزة قليلا والقواعد وجودي، أنها تعمل في آهالأزياء armonized لحماية المضيف من الشتائم المسببة للأمراض.
وعلاوة على ذلك، هناك إدراك متزايد بأن الجراثيم عامل حاسم لتطوير نظام المناعة في الأمعاء، مع زيادة الاعتراف علاقة المشابهة بين الميكروبات محددة وتطور الجنين معينة الأنساب الخلية 8،9. وعلاوة على ذلك، بالنظر إلى أن التعليم من نظام المناعة في الأمعاء يؤثر على الاستجابات المناعية في مواقع بعيدة تشريحيا (على سبيل المثال، التهاب المفاصل، والتصلب المتعدد، والتهاب رئوي)، أصبح من الواضح أن تطوير نظام المناعة المعوية هي ذات الصلة لمزيد من عمليات المرض مما هو معروف في السابق 10 -12. على هذا النحو، وقد امتد الاهتمام تقييم كمي لجهاز المناعة المعوية وراء التفاعلات المضيف الممرض لتشمل الآن التفاعلات المضيف المتعايشة والتسبب في العديد من الأمراض الجهازية كذلك.
ونظرا لتنوع الأساليب المتبعة حاليا فيعزل الخلايا الليمفاوية المعوية، وهو الأسلوب الذي هو الأمثل لالعائد، والسلامة، والاتساق حين تحقيق التوازن بين الوقت المطلوب أمر بالغ الأهمية على نحو متزايد. البروتوكولات التي تنطوي على التدرجات Percoll هي الوقت والعمل المكثف ويحتمل أن تكون أكثر عرضة للخطأ البشري، مما أدى إلى العائد المتغير وقدرتها على البقاء 13. هنا، ونحن نقدم بروتوكول الأمثل لعزل وتوصيف الخلايا الليمفاوية من جميع المقصورات المناعة الصغيرة المعوية 3. بالإضافة إلى ذلك، نظرا لتزايد الاهتمام في التعديلات التي يسببها ميكروب في الجهاز المناعي المخاطي، ندرج الخطوات التي يمكن أن تستخدم للسماح لنقل أفقي من الكائنات الحية الدقيقة بين الفئران لتقييم مدى تؤثر هذه التغييرات على الكمية جهاز المناعة المعوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت جميع الدراسات تحت المراجعة الدقيقة والمبادئ التوجيهية وفقا للجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في كلية الطب بجامعة هارفارد، والذي يلبي المعايير البيطرية التي وضعتها الجمعية الأمريكية لمختبر علم الحيوان (AALAS).
1. أفقي انتقال البكتيريا عبر شركة الإسكان (اختياري)
- للحد من التلوث الخارجية (خاصة إذا باستخدام الفئران معروف المعايشات)، وممارسة تقنية العقيم في حين تجميع أقفاص القابل للتصرف العقيمة، وذلك باستخدام المواد الغذائية والمياه التي على حد سواء تم تعقيمها.
- استخدام اللكمات الأذن أو علامات للاحتفال بشكل فردي 6 أسابيع من العمر C57BL / 6 الفئران التي تأوي microbiotas مختلفة وإيوائهم في نفس القفص. وبالنظر إلى أن الفئران هي اكل البراز وتأكل الكريات البرازية من الطابق القفص، ومن الطبيعي أن تنتقل الميكروبات أفقيا بين الفئران.
- الفئران منزل المشارك ل≥1 الأسبوع لإتاحة الوقت لنقل الجراثيم والتغيير المناعية قبل التحليل. 2. إعداد تعليق خلية واحدة من طبقة داخل الظهاري الصغيرة المعوية والصفيحة المخصوصة
- إعداد حلول
- إعداد وسائل الاعلام استخراج (في الأمعاء الدقيقة): 30 مل RPMI + 93 ميكرولتر 5٪ (ث / ت) dithiothreitol (DTT) + 60 ميكرولتر 0.5 M EDTA + 500 ميكرولتر الجنين مصل بقري (FBS). إضافة DTT مباشرة قبل الاستعمال.
- إعداد وسائل الاعلام الهضم (في الأمعاء الدقيقة): 25 مل RPMI + 12.5 ملغ dispase + 37.5 ملغ كولاجيناز الثاني + 300 ميكرولتر FBS. إضافة dispase وكولاجيناز مباشرة قبل الاستعمال.
- لجميع حضانات أجريت في 37 درجة مئوية، والحلول prewarm إلى 37 درجة مئوية.
- الموت ببطء الماوس عن طريق CO 2 الخنق تليها خلع عنق الرحم.
- وضع الجانب الظهري الماوس إلى أسفل ورش البطن مع الايثانول 70٪. استخدام المقص لإجراء عملية فتح البطن عن طريق خفض بالتتابع الجلد واللفافة ثم البريتوني على طول خط الوسط بطني جيئة وذهابام والارتفاق العانة لعملية الخنجري، مما يعرض التجويف البريتوني.
- استخدام المقص لفصل الأمعاء الدقيقة من المعدة عن طريق transecting العضلة العاصرة البوابية. إزالة بلطف الأمعاء الدقيقة من الصفاق، إغاظة بعيدا الدهون المساريقي.
- لإزالة تماما الأمعاء الدقيقة، وجعل قطع الثاني عند تقاطع اللفائفي الأعور. ضع الأمعاء الدقيقة المعزولة في البرد (أي، 4 ° C) RPMI تحتوي على 10٪ FBS لتعظيم بقاء الخلية.
- إزالة بلطف قطع كبيرة من الدهون باستخدام ملقط المنحنية. توخي الحذر لتجنب تمزق الأنسجة المعوية نفسها أثناء محاولة إزالة الدهون.
- لإزالة محتويات الأمعاء، والأمعاء تدفق بلطف مع 15-20 مل من برنامج تلفزيوني الباردة باستخدام إبرة التغذية 18 G الملصقة على حقنة.
- استخدام مقص لاستئصال ذكر المكتب الصحفى، ووضعها في RPMI الباردة تحتوي على 5٪ FBS. وتقع ذكر المكتب الصحفى على الجانب مقابل المساريق للأمعاء الدقيقة وتبدو وكأنها متعددة مفصص الأبيضكتلة. اعتمادا على سلالة معينة، والفأر لديه عادة 8-12 ذكر المكتب الصحفى.
- قطع الأمعاء الدقيقة 3-4 شرائح بوصة.
- إزالة الدهون المتبقية من قبل المتداول كل جزء صغير الأمعاء على منشفة ورقية مبللة مع RPMI، باستخدام مشرط مملة لندف الدهون بعيدا عن الأنسجة.
- تحويل الأنسجة داخل من قبل cannulating قطاعات المعوية مع ملقط المنحنية واستيعاب نهاية البعيدة للأنسجة. ثم استخدام زوج من ملقط على التوالي لإزالة بلطف قطاع النسيج من ملقط المنحنية (ابتداء من نهاية الداني)، مما أدى إلى الأنسجة التي مقلوب.
- وضع شرائح الأنسجة في كوب تحتوي على 30 مل من وسائل الاعلام استخراج وبقضيب. تأمين غطاء على الكأس، ويقلب في 500 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. وينبغي أن يكون التحريك قوي ولكن ليس المضطرب.
- بعد الحضانة، واستخدام مصفاة الصلب لفصل قطعة نسيج من طاف التي تحتوي على ظهارة، والتي يجب أن تظهر غائم. هذا طاف يحتوي طالخلايا الليمفاوية ntraepithelial التي يمكن تحليلها، إذا رغبت في ذلك، من خلال الشروع في تصفية عينة في الخطوات 2،18-2،23.
- تستنهض الهمم يدويا قطعة نسيج في RPMI ليغسل وسائل الاعلام استخراج المتبقية.
- وضع النسيج على منشفة ورقية جافة والوجه أن تنتهي خلال نهاية عدة مرات لتسهيل إزالة المخاط المتبقية التي لم تتحرر من قبل متوسطة الاستخراج.
- وضع شظايا الأنسجة في أنبوب 1.5 مل مع 600 ميكرولتر من المتوسطة الهضم.
- استخدام المقص لتخطر على الأنسجة حتى قطع لم يعد التمسك مقص والحل يبدو متجانسا. هذه الخطوة مهمة لضمان الهضم الأنزيمي كاملة من الأنسجة.
- إضافة الأمعاء الدقيقة المفروم إلى كوب تحتوي على 25 مل من وسائل الاعلام الهضم. إثارة في 500 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. في منتصف الطريق من خلال عملية الهضم (أي، في 15 دقيقة)، الماصة صعودا ونزولا مع الماصة المصلية للمساعدة في تفريق أي أجزاء كبيرة من الأنسجة.
- مرشح النسيج هضمها (أو epithطبقة elial من الخطوة 2.12 إذا IELs التجهيز) من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرومتر في أنبوب 50 مل. شطف مصفاة مع 20 مل من RPMI تحتوي على 10٪ FBS.
- أجهزة الطرد المركزي الحل تصفيتها في 500 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- بعناية صب طاف و resuspend بيليه في 1 مل من RPMI تحتوي على 10٪ FBS.
- مرشح معلق الخلايا من خلال مصفاة 40 ميكرومتر الخلية في أنبوب 50 مل. شطف مصفاة مع 20 مل من RPMI تحتوي على 10٪ FBS.
- أجهزة الطرد المركزي تصفية حل في 500 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- بعناية صب طاف، وبيليه resuspend في 1 مل من RPMI تحتوي على 2٪ FBS.
- نقل يستأصل ذكر المكتب الصحفى للكوب مع 25 مل من وسائل الاعلام الهضم وبقضيب. غطاء آمن، وتدور في 500 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- هضمها مرشح ذكر المكتب الصحفى من خلال مصفاة 40 ميكرومتر الخلية في أنبوب 50 مل. إن وجدت ريما كتلفي، الضغط عليها من خلال مصفاة باستخدام نهاية شقة من المكبس من حقنة 1 مل.
- شطف مصفاة مع 10 مل من RPMI تحتوي على 10٪ FBS.
- أجهزة الطرد المركزي تصفية حل في 500 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- بعناية صب طاف، وبيليه resuspend في 1 مل من RPMI تحتوي على 2٪ FBS.
- قسامة حجم مناسب من الخلايا (على سبيل المثال، 200 ميكرولتر من LPLs) في لوحة ذهابا والقاع 96-جيدا.
- أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. صب طاف بواسطة قلب اللوحة.
- Resuspend الخلايا في 90 ميكرولتر من RPMI تحتوي على 2٪ FBS والتخفيف 1: 100 CD16 المضادة لل/ 32 (كتلة بورتو). احتضان لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- إضافة 10 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. صب طاف بواسطة قلب اللوحة.
- Resuspend الخلايا في 250 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. طاف صب من قبلقلب اللوحة.
- (اختياري) خلايا وصمة عار مع صبغة الجدوى، إذا رغبت في ذلك، باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
- Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر 1٪ من الفورمالين لإصلاح الخلايا. احتضان لمدة 1 ساعة في الظلام في 4 درجات مئوية.
- إضافة 200 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. صب طاف بواسطة قلب اللوحة.
- Resuspend الخلايا في 250 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. صب طاف بواسطة قلب اللوحة.
- Resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. تحليل الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي.
3. إعداد تعليق خلية واحدة من بقع باير ل
4. تلطيخ السطح لالتدفق الخلوي
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تحليل تدفق cytometric من تعليق خلية واحدة من الخلايا الليمفاوية الصغيرة الأمعاء يجب أن تسفر عن السكان منفصلة من الخلايا التي لها خصائص مماثلة إلى الأمام والجانب مبعثر كما splenocytes (الشكلان 1A و 1B). قد تبدأ الخلايا الليمفاوية للموت إذا لم يتم الحفاظ على الأنسجة عند 4 درجات مئوية خلال المراحل الأولى من العزلة، مما أدى إلى السكان لمفاوية وجود مبعثر إلى الأمام أقل ويكون أكثر صعوبة في فصل من الخلايا الظهارية والميتة الأخرى (الشكل 1C) . وعلاوة على ذلك، إذا لم يتم تنظيف الأنسجة الصغيرة الأمعاء تماما من الدهون المساريقي لها، تكاد تكون هناك خسارة كاملة من الخلايا الليمفاوية (1D الشكل). توضح هذه الميزات كيف تعمل بسرعة (أي، وعدم السماح الأنسجة في عملية الاحماء) والاهتمام بالتفاصيل (أي، وإزالة حتى كميات صغيرة من الدهون المساريقي) هو ضروري لضمان جودة العينة. TypicaLLY، نحصل ~ بقاء 80٪ للLPLs الصغيرة المعوية (الشكل 1E).
يوضح الشكل 2A كيفية تكوين الجراثيم يمكن أن تؤثر بشكل كبير على أعداد السكان خلية معينة. كما أننا أثبتنا سابقا، (GF) الفئران خالية من الجراثيم، التي تخلو تماما من أي الكائنات الحية الدقيقة، لديها نظام المناعة الصغيرة المعوية التي هي غير ناضجة بشكل ملحوظ بالمقارنة مع (SPF) الفئران محددة خالية من مسببات الأمراض، والاستعمار من الفئران GF مع العادية الجراثيم الماوس (MMB) النتائج في استعادة النظام المناعي صغيرة في الأمعاء 14. في المقابل، الفئران معروف المعايشات إيواء الميكروبات البشرية العادية (HMB) - والتي لديها عدد وتنوع البكتيريا البرازية، الفئران MMB مماثل - لديها نظام المناعة الصغيرة المعوية التي لا يمكن تمييزها عن تلك التي GF الفئران 14.
الاستفادة منطبيعة اكل البراز من الفئران، الفئران زملاء السكن يمثل معا، طريقة بسيطة لكنها قوية للسماح نقل الأفقي للكائنات الحية بين الفئران. هذا النهج يسمح احد لاختبار ما إذا كان التغير الناتج في الجراثيم يؤثر على الجهاز المناعي الصغيرة الأمعاء. وكمثال على ذلك، أثبتنا أن الفئران HMB زملاء السكن مع الفئران MMB لمدة 4 أسابيع أدى إلى تطبيع عدد الخلايا CD3 + CD8 + T في SI ليرة لبنانية (الشكل 2B) 14. هذه النتيجة تؤكد أن الخلافات بين MMB وHMB الفئران التي لوحظت في الشكل 2A ومن المقرر أن الاختلافات في الجراثيم بين هذه الفئران - الاختلافات التي يتم التغلب عليها من قبل زملاء السكن الفئران معا.
الشكل 1. المعوية الخلايا اللمفاوية يكون FSC والتعاون بين بلدان الجنوب خصائص مشابهة لSplenocytes أ - دال Dقطع بعد التمديد تصور SSC وFSC لsplenocytes أعد أمثل (A) والصغيرة الأمعاء الصفيحة المخصوصة (SI ليرة لبنانية) خلايا (B - D). تم إعداد نموذج B. الاشتراكية ليرة لبنانية وفقا لبروتوكول صفها. وسمح جيم الأنسجة المعوية عمدا لتدفئة لإثبات أن الخلايا SI ليرة لبنانية تبدأ في الحصول على FSC أقل. D. لم يكن تنظيف الدهون المساريقي من الأمعاء الدقيقة قبل إعداد الخلايا واحد، مما أدى إلى فقدان ملحوظ SI ليرة لبنانية السكان لمفاوية. E. كانت ملطخة نموذج يصور في لوحة B في الخطوة 4.7 مع صبغة الجدوى قابل للتثبيت (على سبيل المثال، eFluor 780) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. الجراثيم الآثار النضج للintest الصغيرةإينال الجهاز المناعي. أ. وعددت خلايا CD3 + CD8 + T في SI ليرة لبنانية من SPF، MMB، HMB، والفئران GF. وكانت الفئران ب HMB شارك في مقرها مع الفئران MMB لمدة 4 أسابيع قبل تعداد خلايا CD3 + CD8 + T في SI ليرة لبنانية. وقد تم تحليل MMB وHMB الفئران التي لم تشارك في إيواء للمقارنة. تمثل كل نقطة بيانات الماوس الفردية، وقضبان أفقية تعكس المتوسط. م، لم تكن كبيرة. *، ف <0.05. **، ف <0.01. ***، ف <0.001. وترد مع الأرقام إذن، من إشارة 14، مع تعديل طفيف من B. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نقدم بروتوكول لعزل وتوصيف تدفق cytometric من الخلايا الليمفاوية الصغيرة الأمعاء، بما في ذلك LPLs، IELs، والخلايا الليمفاوية في ذكر المكتب الصحفى. للراغبين في تقييم كيف يمكن للتغييرات في الجراثيم التي تؤثر على نظام المناعة الصغيرة الأمعاء، ونحن بالتفصيل الخطوات واضحة المشاركة في نقل الأفقي للكائنات الحية بين الفئران إيواء microbiotas مختلفة. على الرغم من أن هذا البروتوكول يركز على الأمعاء الدقيقة، والإجراء هو نفسه لتحليل الأمعاء الغليظة، مع الفارق الوحيد هو أنه لا توجد ذكر المكتب الصحفى لإزالة (على الرغم من بقع القولون موجودة، وهذه عادة ما تكون غير مرئية بشكل فاضح).
هناك العديد من الخطوات الرئيسية في تحقيق العزلة المثلى من الخلايا الليمفاوية من الأنسجة الصغيرة المعوية. إزالة الدقيق من الأنسجة الدهنية هي في غاية الأهمية لضمان بقاء الخلايا اللمفاوية والعائد الأمثل. بالإضافة إلى ذلك، DTT هو حال للبلغم حاسما المستخدمة في استخراجمن الخلايا الظهارية. نظرا لطبيعتها غير مستقرة، نقترح تخزين قسامات تستخدم مرة واحدة من محلول 5٪ في ≤ 20 درجة مئوية، وعدم إعادة تجميد أي حجم غير المستخدمة. على الرغم من أن يستخدم EDTA في المتوسط استخراج للمساعدة في إزالة الخلايا الظهارية 15، وجودها - وكذلك الزائد FBS أو مخاط - أثناء عملية الهضم يمكن أن تمنع كولاجيناز. وقد تجلى تركيز كولاجيناز تستخدم لتؤثر بشكل مختلف التعبير سطح علامة و13،16،17 بقاء الخلية. وعلاوة على ذلك، اعتمادا على علامة السطح من الفائدة، قد يكون من أن صيغة مختلفة من كولاجيناز (على سبيل المثال، نوع كولاجيناز الأول والثاني والسادس، والثامن) هو الأمثل 13،17. قد تكون هناك حاجة بعض التحسين المجرب اعتمادا على مسألة تجريبية محددة، ونظرا لاختلاف الكثير إلى الكثير، والكثير محددة ومستوى النشاط النسبي للكولاجيناز. وعلاوة على ذلك، قد تكون هناك حاجة الأمثل إضافية اعتمادا على specifجيم سلالة وعمر الفأر استخدامها. على سبيل المثال، وقد تم تحسين الأوقات المذكورة هنا ل~ 6 أسابيع من العمر C57BL / 6 الماوس؛ ل~ 8 أسابيع من العمر الماوس بستر السويسرية، ويمكن زيادة الوقت الهضم إلى 40 دقيقة.
باختصار، لقد قدمنا بروتوكول مفصلة لعزل الخلايا الليمفاوية الصغيرة الأمعاء من الصفيحة المخصوصة، طبقة داخل الظهاري، وذكر المكتب الصحفى. مرة واحدة يتقن، يمكن للمرء أن معالجة معقول 4 الفئران وديك تعليق خلية واحدة جاهزة للتلوين في ~ 4 ساعات. على الرغم من أننا وصف تلطيخ الفوري لهذه الخلايا لتوصيف تدفق cytometric، يمكن للمرء أن تحفز بدلا من هذه الخلايا لتقييم إنتاج السيتوكينات، فرز الخلايا للالنسخي و / أو التحليلات البروتين، أو ثقافة الخلايا لننظر في المختبر التفاعل مع أنواع أخرى من الخلايا. وعلاوة على ذلك، في حين ركزنا على السكان لمفاوية، وهذا البروتوكول يمكن أن تستخدم أيضا لفحص خلايا الدم النخاعي. أخذت معا، وهذا نهج مبسط لعزل م واحدالسكان ليرة لبنانية من مختلف الأجزاء المعوية يسمح احد لاستجواب كلا كيف عوامل مختلفة (على سبيل المثال، الجراثيم، المستضدات الغذائية) تؤثر على تطور الجنين من الجهاز المناعي في الأمعاء وأيضا كيف يمكن أن تكون هذه الخلايا ذات الصلة في أمراض خارج الأمعاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Gloves | Kimberly-Clark | 555092 | |
| sterile mouse cage | Innovive | MS2-AD | contains lid, cage bottom, and alpha-dri bedding |
| Metal feeder | Innovive | M-FEED | |
| Water bottle | Innovive | M-WB-300 | |
| Card holder | Innovive | CRD-HLD-H | |
| Autoclavable rodent chow (NIH-31M) | Zeigler | 4131207530 | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | 11875-119 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Ambion | AM9262 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GemBio | 100-510 | |
| Dispase II | Invitrogen | 17105-041 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 1.878 U/mg |
| Collagenase, type II | Invitrogen | 17101-015 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 245 U/mg |
| Dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Feeding needle (18 G, 2" length) | Roboz | FN-7905 | |
| 10 ml Syringe | BD | 305482 | |
| PBS | Gibco | 14190-250 | |
| Disposable Scalpel (15 blade) | Miltex | 4-415 | |
| Curved forceps | Roboz | RS-5211 | |
| Straight forceps | Roboz | RS-5132 | |
| Multi-purpose cups, 120 ml | VWR | 89009-662 | |
| Stir bar | VWR | 58949-062 | |
| Multi-position stir plate, 9-position | VWR | 12621-048 | |
| Stainless steel conical strainer, 3 inch | RSVP | ||
| 1.5 ml Tube | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 100 μm Cell strainer | Falcon | 08-771-19 | |
| 40 μm Cell strainer | Falcon | 08-771-1 | |
| 50 ml Conical tube | Falcon | 352098 | |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 96-well Plate, round-bottom | Corning | 3799 | |
| Anti-mouse CD16/32 (Fc block) | Biolegend | 101320 | |
| (Optional) Fixable viability dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-18 | |
| 10% Formalin, neutral buffered | Thermo Scientific | 5725 |
References
- Cummings, D. E., Overduin, J.
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14 (10), 667-685 (2014).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (5), 313-323 (2009).
- Sartor, R. B. Microbial influences in inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 134 (2), 577-594 (2008).
- Tlaskalova-Hogenova, H., et al. Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases. Immunol Lett. 93 (2-3), 97-108 (2004).
- Wen, L., et al. Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes. Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue distribution of lymphocytes and plasma cells and the role of the gut. Trends Immunol. 29 (5), author reply 209-210 206-208 (2008).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. The yin yang of bacterial polysaccharides: lessons learned from B. fragilis PSA. Immunol Rev. 245 (1), 13-26 (2012).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. Deciphering the tete-a-tete between the microbiota and the immune system. J Clin Invest. 124 (10), 4197-4203 (2014).
- Gauguet, S., et al. Intestinal microbiota of mice influences resistance to Staphylococcus aureus pneumonia. Infect Immun. , (2015).
- Ochoa-Reparaz, J., et al. A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease. Mucosal Immunol. 3 (5), 487-495 (2010).
- Wu, H. J., et al. Gut-residing segmented filamentous bacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17 cells. Immunity. 32 (6), 815-827 (2010).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Chung, H., et al. Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota. Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).
- Resendiz-Albor, A. A., Esquivel, R., Lopez-Revilla, R., Verdin, L., Moreno-Fierros, L. Striking phenotypic and functional differences in lamina propria lymphocytes from the large and small intestine of mice. Life Sci. 76 (24), 2783-2803 (2005).
- Carrasco, A., et al. Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa. J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
