Abstract
Tarmene - der indeholder det største antal af immune celler i alle organer i kroppen - er konstant udsat for fremmede antigener, både mikrobiel og kosten. Givet en stigende forståelse af, at disse luminale antigener at forme immunresponset og at uddannelse af immune celler i tarmen er kritisk for en række systemiske sygdomme, har der været en stigende interesse for at karakterisere den intestinale immunsystem. Men mange publicerede protokoller er besværlig og tidskrævende. Vi præsenterer her en forenklet protokol til isolering af lymfocytter fra den lille-tarm lamina propria, intraepithelial lag, og Peyerske plaques, som er hurtig, reproducerbar, og kræver ikke møjsommelige Percoll-gradienter. Selvom protokollen fokuserer på tyndtarmen, er det også egnet til analyse af tyktarmen. Desuden fremhæver vi nogle aspekter, der kan have brug for yderligere optimering afhængigt af den specifikke videnskabelige spørgstion. Denne fremgangsmåde resulterer i isoleringen af et stort antal levedygtige lymfocytter, som efterfølgende kan anvendes til flowcytometrisk analyse eller alternative midler til karakterisering.
Introduction
Den vigtigste opgave af tyndtarmen er ofte anset for at være den fordøjelse og optagelse af næringsstoffer 1. Mens dette metaboliske funktion er klart nødvendigt, tyndtarmen har en lige så vigtig rolle i at beskytte værten fra den stadige spærreild af miljømæssige antigener findes inden i hulrummet 2. Tarmkanalen adskiller omverdenen (f.eks., Luminale antigener) fra det indre miljø i værten med et epitel lag, er kun et enkelt cellelag tykt. Som sådan er den lille-tarm immunsystem har den formidable opgave at afbalancere dens tærskel for reaktivitet, hvilket tillader fremmede antigener fra kosten og kommensale mikrober at indtaste slimhinden med minimal, om nogen, immunrespons under montering en robust respons mod invaderende patogener og andre "skadelige" antigener. Overdreven eller upassende immunreaktioner på disse antigener kan føre til patologisk sygdom (f.eks., Inflammatory tarmsygdom, type I-diabetes, dissemineret sklerose) og skal undgås 3-6.
Samlet set mavetarmkanalen menes at repræsentere den største immun organ i kroppen, der indeholder over 70% af alle antistof-secernerende celler 7. Den lille-tarm immunsystem består af 3 hovedrum - lamina propria (LP), den intraepithelial lag og Peyerske plaques (PPS) - at hver indeholder en karakteristisk gruppe af lymfocytter 2. LP-lymfocytter (LPLs) er primært TCRαβ + -T-celler med ~ 20% B-celler; intraepithelial lymfocytter (IELs) indeholder meget få B-celler med flere TCRγδ + T-celler end TCRαβ + T-celler; og PPS, som er sekundære lymfoide organer indlejret i mellem-tarmvæggen, indeholder ~ 80% B-celler. Selv om hver af disse anatomiske regioner har lidt forskellige funktioner og ontologiske baser, de fungerer i aharmonized mode at beskytte værten patogene fornærmelser.
Endvidere er der voksende forståelse, at mikrobiota er en kritisk determinant for udviklingen af tarmens immunsystem, med stigende anerkendelse af den beslægtede forhold mellem specifikke mikrober og ontogenese af bestemte celleslægter 8,9. Og eftersom uddannelse af tarmens immunsystem påvirker immunresponser i anatomisk fjerne steder (f.eks. Arthritis, dissemineret sklerose, lungebetændelse), er det blevet klart, at udviklingen af det intestinale immunsystem er relevant for flere sygdomsprocesser end tidligere indregnet 10 -12. Som sådan har interesse i kvantitativt at vurdere den intestinale immunsystem forlænges ud værtspatogene interaktioner nu inkluderer værts-kommensal interaktioner og patogenesen af mange systemiske sygdomme samt.
Omfatter variationer nuværende metoder iisolering af intestinale lymfocytter, en metode, der er optimeret til udbytte, levedygtighed, og konsistens samtidig med at balancere den nødvendige tid i stigende grad kritisk. Protokoller, der involverer Percoll gradienter er tids- og arbejdskrævende og potentielt mere tilbøjelige til menneskelige fejl, der fører til variabel rente og levedygtighed 13. Heri giver vi en optimeret protokol til isolering og karakterisering af lymfocytter fra alle 3 små-tarm immune rum. Derudover gives stigende interesse for mikrobe-inducerede ændringer i det mucosale immunsystem, inkluderer vi trin, der kan anvendes til at give mulighed for horisontal overførsel af mikroorganismer mellem mus til at vurdere, hvordan disse ændringer kvantitativt påvirker intestinale immunsystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle undersøgelser blev udført under streng revision og retningslinjer i henhold til Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved Harvard Medical School, som opfylder de veterinære standarder fastsat af American Association for Laboratory Animal Science (AALAS).
1. Vandret Transmission Bacteria via Co-hus (valgfri)
- For at minimere eksogen forurening (især hvis du bruger gnotobiotiske mus), praktiserer aseptisk teknik, mens samle sterile engangssprøjter bure, hjælp mad og vand, der begge er blevet autoklaveres.
- Brug øre slag eller tags individuelt markere 6 uger gamle C57BL / 6 mus, der huser forskellige microbiotas og huse dem i samme bur. Eftersom mus er coprophagic og spise fækalpellets fra buret sal, vil mikrober naturligt transmitteres vandret mellem musene.
- Co-husmus for ≥1 uge at give tid til mikrobiel overførsel og immunologiske forandringer inden analyse. 2. Udarbejdelse af en enkelt celle Suspension fra Small-tarm intraepitelial Layer og lamina propria
- Fremstilling af opløsninger
- Forbered ekstraktionsmedier (pr tyndtarmen): 30 ml RPMI + 93 pi 5% (w / v) dithiothreitol (DTT) + 60 pi 0,5 M EDTA + 500 pi føtalt bovint serum (FBS). Tilsæt DTT umiddelbart før brug.
- Forbered fordøjelsen medier (per tyndtarmen): 25 ml RPMI + 12,5 mg dispase + 37,5 mg collagenase II + 300 pi FBS. Tilsæt dispase og collagenase umiddelbart før brug.
- For alle inkubationer udført ved 37 ° C, Forvarm løsninger til 37 ° C.
- Aflive musen ved CO 2 kvælning efterfulgt af cervikal dislokation.
- Placer musens dorsale nedad og spray maven med 70% ethanol. Bruge en saks til at udføre en laparotomi ved sekventiel skære i huden og derefter peritoneal fascia langs den ventrale midterlinie from skambenssammenføjning til xiphoid proces, og derved udsatte peritonealhulen.
- Brug en saks til at adskille tyndtarmen fra maven ved transecting pylorus lukkemuskel. Fjern forsigtigt tyndtarmen fra bughinden, drilleri væk mesenteriske fedt.
- For fuldt ud at fjerne tyndtarmen, foretages et nyt snit på ileo-cecal krydset. Placer isoleret tyndtarmen i koldt (dvs.., 4 ° C) RPMI indeholdende 10% FBS for at maksimere cellernes levedygtighed.
- Fjern forsigtigt store stykker fedt ved hjælp af buede pincet. Vær forsigtig for at undgå at rive tarmvævet selv mens du prøver at fjerne fedt.
- For at fjerne tarmindhold, blidt flush tarme med 15 - 20 ml kold PBS ved hjælp af en 18 G fodring nål fastgjort til en sprøjte.
- Brug en saks til at udskære PPs, og placere dem i koldt RPMI indeholdende 5% FBS. PP er placeret på antimesenteric side af tyndtarmen og fremstå som en multi-lobulerede hvidmasse. Afhængigt af den specifikke stamme, en mus har typisk 8 - 12 PPs.
- Skær tyndtarmen i 3 - 4 tommer segmenter.
- Fjerne resterende fedt ved at rulle hver lille-tarm segment på en papirserviet fugtet med RPMI under anvendelse af en kedelig skalpel at drille fedtet væk fra vævet.
- Vend væv inde ved kanylering intestinale segmenter med buet pincet og gribe den distale ende af vævet. Brug derefter en par lige pincet til forsigtigt at fjerne det væv segment fra de buede pincet (begyndende ved den proksimale ende), hvilket resulterer i væv, der omvendt.
- Placer væv segmenter i en kop, der indeholder 30 ml udsugning medier og en omrører. Fastgør låget på bægeret, og der omrøres ved 500 rpm i 15 minutter ved 37 ° C; omrøring bør være kraftig, men ikke turbulent.
- Efter inkubation bruge en stål si at adskille væv stykker fra epitel-holdige supernatant, som skal vises uklar. Denne supernatant indeholder intraepithelial lymfocytter, der kan analyseres yderligere, om ønsket, ved at foretage filtrering af prøven i trin 2.18 - 2.23.
- Manuelt agitere vævsstykkerne i RPMI at vaske væk resterende ekstraktionsmedier.
- Placer væv på et tørt stykke køkkenrulle og vend det ende over ende flere gange for at lette fjernelse af resterende slim, der ikke blev befriet af ekstraktionsmediet.
- Placer vævsfragmenter i et 1,5 ml rør med 600 pi fordøjelse medium.
- Brug en saks til at hakke vævet indtil stykker ikke længere holde sig til saksen og løsningen synes homogen. Dette trin er afgørende for at sikre fuldstændig enzymatisk fordøjelse af vævet.
- Tilsæt det hakkede tyndtarmen til en kop indeholdende 25 ml fordøjelse medier. Der omrøres ved 500 rpm i 30 min ved 37 ° C. Halvvejs gennem fordøjelsen (dvs.., Ved 15 min), pipetteres op og ned med en serologisk pipette til hjælpe med at bryde op nogen store klumper af væv.
- Filter spaltet væv (eller epithelial lag fra trin 2.12, hvis behandling IELs) gennem en 100 um celle si i en 50 ml rør. Skyl filteret med 20 ml RPMI indeholdende 10% FBS.
- Centrifugeres den filtrerede opløsning ved 500 xg i 10 min ved 4 ° C.
- dekanteres omhyggeligt supernatanten og resuspender pellet i 1 ml RPMI indeholdende 10% FBS.
- Filter resuspenderes celler gennem en 40 um cellefilter i et 50 ml rør. Skyl si med 20 ml RPMI indeholdende 10% FBS.
- Centrifuge filtrerede opløsning ved 500 xg i 10 min ved 4 ° C.
- dekanteres omhyggeligt supernatanten, og resuspender pellet i 1 ml RPMI indeholdende 2% FBS.
- Overførsel udskåret PPs til en kop med 25 ml fordøjelse medier og en omrører. Sikker låg, og centrifugering ved 500 rpm i 10 min ved 37 ° C.
- Filter spaltet PPs gennem et 40 um cellefilter i et 50 ml rør. Hvis nogen klumper remai, trykke dem igennem sien hjælp den flade ende af stemplet fra en 1 ml sprøjte.
- Skyl si med 10 ml RPMI indeholdende 10% FBS.
- Centrifuge filtrerede opløsning ved 500 xg i 10 min ved 4 ° C.
- dekanteres omhyggeligt supernatanten, og resuspender pellet i 1 ml RPMI indeholdende 2% FBS.
- Alikvot passende volumen af celler (f.eks., 200 pi LPLs) i en 96-brønds rundbundet plade.
- Centrifuger ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanter supernatanten ved at vende pladen.
- Resuspender celler i 90 pi RPMI indeholdende 2% FBS og 1: 100 fortynding af anti-CD16 / 32 (Fc-blok). Inkuber i 10 minutter ved 4 ° C.
- Tilsæt 10 pi PBS. Centrifuger ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanter supernatanten ved at vende pladen.
- Resuspender celler i 250 pi PBS. Centrifuger ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanter supernatanten vedinverterende pladen.
- (Valgfrit) Stain celler med viabilitetsfarvestoffet om ønsket, ved at følge fabrikantens protokol.
- Resuspender celler i 100 pi 1% formalin for at fikseres cellerne. Der inkuberes i 1 time i mørke ved 4 ° C.
- Tilsæt 200 pi PBS. Centrifuger ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanter supernatanten ved at vende pladen.
- Resuspender celler i 250 pi PBS. Centrifuger ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanter supernatanten ved at vende pladen.
- Resuspender celler i 200 pi PBS. Analyser celler under anvendelse af et flowcytometer.
3. Udarbejdelse af en enkelt celle Suspension fra Peyerske plaques
4. Overflade Farvning for flowcytometri
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flow-cytometri af enkeltcellesuspensioner af små-tarm lymfocytter skulle give en diskret population af celler, der har lignende fremad og sidespredning egenskaber som splenocytter (figur 1A og 1B). Lymfocytterne kan begynde at dø, hvis vævet ikke holdes ved 4 ° C under de indledende stadier af isolering, hvilket resulterer i lymfocytpopulationen har en nedre forward scatter og være mere vanskeligt at adskille fra andre epitel- og døde celler (figur 1C) . Desuden, hvis lille-tarm væv ikke er fuldstændigt renset for sin mesenterisk fedt, der er næsten et fuldstændigt tab af lymfocytter (figur 1D). Disse funktioner illustrerer, hvordan arbejder hurtigt (dvs.., Ikke at tillade vævet at varme op) og opmærksomhed på detaljer (dvs.., Fjerner selv små mængder af mesenterisk fedt) er nødvendigt at sikre prøven kvalitet. typically, får vi ~ 80% levedygtighed for små-tarm LPLs (figur 1E).
Figur 2A viser, hvordan sammensætningen af mikrobiota kan i høj grad påvirke antallet af specifikke cellepopulationer. Som vi tidligere har vist, kimfri (GF) mus, som er helt blottet for enhver mikroorganisme, har en lille-tarm immunsystem, der er markant umodne sammenlignet med specifikke patogenfrie (SPF) mus, og kolonisering af GF mus med en normal mus mikrobiota (MMB) resulterer i genoprettelse af den lille-tarm immunsystem 14. I modsætning hertil gnotobiotiske mus huser et normalt menneske mikrobiota (HMB) - og som har et tilsvarende antal og mangfoldighed af fækale bakterier som MMB mus - har en lille-tarm-immunsystem, der ikke kan skelnes fra den af GF mus 14.
Ved at udnytteden coprophagic karakter af mus, co-boliger mus sammen repræsenterer en enkel, men kraftfuld metode til at tillade horisontal overførsel af organismer mellem mus. Denne fremgangsmåde gør det muligt at teste, om den resulterende ændring i mikrobiota påvirker små-tarm immunsystem. Som et eksempel, demonstrerede vi, at co-indkapsling HMB mus med MMB mus i 4 uger resulterede i normalisering af antallet af CD3 + CD8 + T-celler i SI LP (figur 2B) 14. Dette resultat bekræfter, at forskellene mellem MMB og HMB mus observeret i figur 2A skyldes variationer i mikrobiota mellem disse mus - variationer, som overvindes ved co-indkapsling musene sammen.
Figur 1. Intestinal Lymfocytter har FSC og SSC egenskaber svarende til Spienocytter A -. D. DOT plots afbilder SSC og FSC for optimalt forberedt splenocytter (A) og små-tarm lamina propria (SI LP) celler (B - D). B. SI LP prøve blev fremstillet ifølge fremgangsmåden beskrevet protokol. C. tarmvæv bevidst blev tilladt at varme til at demonstrere, at SI LP celler begynder at have en lavere FSC. D. mesenteriske fedt blev ikke renset fra tyndtarmen, før de udarbejder enkelte celler, hvilket resulterer i tab af en mærkbar SI LP lymfocytpopulation. E. Prøven afbildet i panel B blev farvet i trin 4.7 med fixable levedygtighed farvestof (f.eks., EFluor 780) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. mikrobiota Impacts Modning af Small-INTESTINAL immunforsvar. A. CD3 + CD8 + T-celler blev optalt i SI LP af SPF, MMB, HMB, og GF mus. B. HMB-mus blev co-huse med MMB mus i 4 uger før optælling CD3 + CD8 + T-celler i SI LP. MMB og HMB mus, som blev ikke co-huses blev analyseret til sammenligning. Hvert datapunkt repræsenterer en individuel mus, og de vandrette bjælker afspejler middelværdien. NS, ikke signifikant; *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001. Tallene er gengivet-med tilladelse-fra henvisning 14, med mindre ændring af B. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi præsenterer en protokol til isolering og flowcytometrisk karakterisering af små-tarm lymfocytter, herunder LPLs, IELs, og lymfocytter i PPs. For dem interesseret i at vurdere, hvordan ændringer i mikrobiota påvirker små-tarm immunsystem, vi detaljer de enkle trin i horisontal overførsel af organismer mellem mus huser forskellige microbiotas. Skønt denne protokol fokuserer på tyndtarmen, er proceduren den samme for analyse af tyktarmen, med den eneste forskel er, at der ikke PPs at fjerne (selvom colon patches er til stede, er disse typisk ikke groft synlig).
Der er flere vigtige skridt i at opnå en optimal isolering af lymfocytter fra små-tarm væv. Omhyggelig fjernelse af fedtvæv er helt afgørende for at sikre lymfocyt levedygtighed og optimal udbytte. Derudover DTT er en afgørende mucolytisk anvendes ved ekstraktionenaf epitelceller. I betragtning af dets ustabile natur, foreslår vi at opbevare engangsbrug portioner af en 5% opløsning ved ≤-20 ° C og ikke re-frysning ubrugt volumen. Selvom EDTA anvendes i ekstraktionsmediet for at hjælpe til fjernelse af epitelceller 15, dets tilstedeværelse - såvel som overskydende FBS eller slim - kan under fordøjelsesprocessen inhibere collagenase. Koncentrationen af collagenase anvendes, er blevet påvist at differentielt påvirker overflademarkør ekspression og cellernes levedygtighed 13,16,17. Endvidere, afhængigt af overflademarkør af interesse, kan det være, at en anden formulering af collagenase (f.eks., Collagenase type I, II, VI eller VIII) er optimal 13,17. Nogle empirisk optimering kan være påkrævet afhængig af den specifikke eksperimentelle spørgsmål og på grund af parti-til-parti variation af den specifikke masse og relative aktivitetsniveau collagenase. Endvidere kan der være behov yderligere optimering afhængigt af specific stamme og alder mus anvendes. For eksempel har de tidspunkter, der er anført her blevet optimeret til en ~ 6 uger gamle C57BL / 6 mus; for en ~ 8 uger gamle Swiss Webster mus, kan fordøjelsen tid øges til 40 minutter.
Sammenfattende har vi givet en detaljeret protokol til isolering af små-tarm lymfocytter fra lamina propria, intraepithelial lag, og PPS. Når mestrer, kan man med rimelighed behandle 4 mus og har enkelt-suspensioner klar til farvning i ~ 4 timer. Selvom vi beskriver den umiddelbare farvning af disse celler til flowcytometrisk karakterisering, kan man alternativt stimulere disse celler til at vurdere cytokinproduktion, sortere celler for transkriptionelle og / eller proteomikanalyser eller dyrke cellerne til at se på in vitro interaktioner med andre celletyper. Endvidere mens vi fokuseret på lymfocytpopulationen, denne protokol kan også anvendes til at undersøge myeloide celler. Tilsammen har dette strømlinet tilgang til at isolere enkelt cell mod de forskellige intestinale rum tillader en at forespørge både hvordan forskellige faktorer (f.eks., mikroflora, diætetiske antigener) påvirke ontogeni af tarmens immunsystem og også hvordan disse celler kan være relevant i ekstra-intestinale sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Gloves | Kimberly-Clark | 555092 | |
| sterile mouse cage | Innovive | MS2-AD | contains lid, cage bottom, and alpha-dri bedding |
| Metal feeder | Innovive | M-FEED | |
| Water bottle | Innovive | M-WB-300 | |
| Card holder | Innovive | CRD-HLD-H | |
| Autoclavable rodent chow (NIH-31M) | Zeigler | 4131207530 | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | 11875-119 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Ambion | AM9262 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GemBio | 100-510 | |
| Dispase II | Invitrogen | 17105-041 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 1.878 U/mg |
| Collagenase, type II | Invitrogen | 17101-015 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 245 U/mg |
| Dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Feeding needle (18 G, 2" length) | Roboz | FN-7905 | |
| 10 ml Syringe | BD | 305482 | |
| PBS | Gibco | 14190-250 | |
| Disposable Scalpel (15 blade) | Miltex | 4-415 | |
| Curved forceps | Roboz | RS-5211 | |
| Straight forceps | Roboz | RS-5132 | |
| Multi-purpose cups, 120 ml | VWR | 89009-662 | |
| Stir bar | VWR | 58949-062 | |
| Multi-position stir plate, 9-position | VWR | 12621-048 | |
| Stainless steel conical strainer, 3 inch | RSVP | ||
| 1.5 ml Tube | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 100 μm Cell strainer | Falcon | 08-771-19 | |
| 40 μm Cell strainer | Falcon | 08-771-1 | |
| 50 ml Conical tube | Falcon | 352098 | |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 96-well Plate, round-bottom | Corning | 3799 | |
| Anti-mouse CD16/32 (Fc block) | Biolegend | 101320 | |
| (Optional) Fixable viability dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-18 | |
| 10% Formalin, neutral buffered | Thermo Scientific | 5725 |
References
- Cummings, D. E., Overduin, J.
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14 (10), 667-685 (2014).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (5), 313-323 (2009).
- Sartor, R. B. Microbial influences in inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 134 (2), 577-594 (2008).
- Tlaskalova-Hogenova, H., et al. Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases. Immunol Lett. 93 (2-3), 97-108 (2004).
- Wen, L., et al. Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes. Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue distribution of lymphocytes and plasma cells and the role of the gut. Trends Immunol. 29 (5), author reply 209-210 206-208 (2008).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. The yin yang of bacterial polysaccharides: lessons learned from B. fragilis PSA. Immunol Rev. 245 (1), 13-26 (2012).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. Deciphering the tete-a-tete between the microbiota and the immune system. J Clin Invest. 124 (10), 4197-4203 (2014).
- Gauguet, S., et al. Intestinal microbiota of mice influences resistance to Staphylococcus aureus pneumonia. Infect Immun. , (2015).
- Ochoa-Reparaz, J., et al. A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease. Mucosal Immunol. 3 (5), 487-495 (2010).
- Wu, H. J., et al. Gut-residing segmented filamentous bacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17 cells. Immunity. 32 (6), 815-827 (2010).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Chung, H., et al. Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota. Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).
- Resendiz-Albor, A. A., Esquivel, R., Lopez-Revilla, R., Verdin, L., Moreno-Fierros, L. Striking phenotypic and functional differences in lamina propria lymphocytes from the large and small intestine of mice. Life Sci. 76 (24), 2783-2803 (2005).
- Carrasco, A., et al. Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa. J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
