Summary

Protocolos para a visualização de esteroidogênicas Órgãos e seus órgãos interativa com imunocoloração na mosca da fruta<em> Drosophila melanogaster</em

Published: April 14, 2017
doi:

Summary

Nós descrevemos um protocolo para dissecação, fixação e imunocoloração de órgãos esteroidogênicas em Drosophila larvas e adultos do sexo feminino para estudar a biossíntese de hormônios esteróides e seu mecanismo de regulação. Em adição aos órgãos esteroidogênicas, podemos visualizar a inervação dos órgãos esteroidogênicas, bem como células alvo esteroidogênicas, tais como células estaminais da linha germinal.

Abstract

Em organismos multicelulares, um pequeno grupo de células é dotado com uma função especializada na sua actividade biogénico, induzir uma resposta sistémica para o crescimento e reprodução. Em insetos, a glândula larval prothoracic (PG) e as fêmeas adultas de reprodução ovário papéis essenciais no biosynthesizing os principais hormônios esteróides chamados ecdisteroides. Estes órgãos ecdysteroidogenic são inervados do sistema nervoso, através do qual o momento da biossíntese é afetado por estímulos ambientais. Aqui nós descrevemos um protocolo para a visualização de órgãos ecdysteroidogenic e seus órgãos interativos em larvas e adultos de mosca da fruta Drosophila melanogaster, que fornece um sistema modelo adequado para estudar a biossíntese de hormônios esteróides e seu mecanismo de regulação. dissecção Hábil nos permite manter as posições dos órgãos ecdysteroidogenic e seus órgãos interativas, incluindo o cérebro, a medula nervosa ventral, e outros tecidos. Imunomarcação com umntibodies contra enzimas ecdysteroidogenic, juntamente com proteínas de fluorescência transgénicos accionados por promotores específicos de tecido, estão disponíveis para marcar células ecdysteroidogenic. Além disso, os inervação dos órgãos ecdysteroidogenic podem também ser marcados por anticorpos específicos ou um conjunto de controladores de GAL4 em vários tipos de neurónios. Portanto, os órgãos ecdysteroidogenic e as suas ligações neuronais possa ser visualizado simultaneamente por imunocoloração e técnicas transgénicas. Finalmente, descrevemos como visualizar as células-tronco germinativas, cuja proliferação e manutenção são controlados por ecdisteroides. Este método contribui para a compreensão abrangente da biossíntese de hormônios esteróides e seu mecanismo de regulação neuronal.

Introduction

Em organismos multicelulares, um grupo de células é dotado com uma função especializada na sua actividade biogénico que é essencial para o corpo inteiro. Para desempenhar a sua missão, cada tecido ou órgão expressa uma série de genes relacionados com as suas funções e comunica com outros tecidos para orquestrar a sua actividade no âmbito do desenvolvimento. Para caracterizar tais funções celulares especializadas e interacções inter-órgãos, é preciso especificar um grupo de células, juntamente com outros tipos de células a ser mantida intacta na arquitectura multicelular.

Um exemplo de tais órgãos especializados é um órgão esteroidogénica, onde muitas enzimas biossintéticas mediar as etapas de conversão de colesterol para hormonas esteróides activas 1. A maioria destes genes da enzima são especificamente expressos em órgãos esteroidogênicas, e a via de biossíntese é fortemente regulada por diversos estímulos externos através de entradas humorais e entradas neuronais. Uma vezsintetizados, hormonas esteróides são segregados para o hemolinfa e são direccionadas para vários tecidos e órgãos para a regulação da expressão de uma variedade de genes 2. Portanto, a acção de uma hormona esteróide induz uma resposta sistémica para manter a homeostase, crescimento e reprodução.

Para investigar as funções de esteróide biossíntese hormônio e as ações pleiotrópicas de hormônios esteróides, Drosophila melanogaster pode ser utilizado como um sistema modelo adequado. Durante os estágios larvais, a hormona esteróide de insectos, ecdiesteróide, é biossintetizado em um órgão endócrino especializada chamada a glândula prothoracic (PG) 3. Nas PG, várias enzimas ecdysteroidogenic catalisar especificamente os passos de conversão múltiplos a partir do colesterol para ecdisona, que controla a muda e metamorfose nas fases de desenvolvimento apropriadas 4. Portanto, uma mudança dinâmica no título ecdiesteróide é reguladapor muitas vias de sinalização em resposta a estímulos ambientais. Por outro lado, na fase adulta, ecdiesteróide desempenha papéis essenciais na fisiologia, incluindo reprodução, sono, memória, e tempo de vida 5, 6, 7, 8. Sabe-se que ecdiesteróide é biosintetizada activamente no ovário, regulando a progressão da oogese 6, 7, 8, 9, 10, 11. Recentemente, relataram que o número de células estaminais da linha germinal (GSCS) é afectada pela sinalização péptido ecdiesteróide e sexo em resposta a estímulos de acoplamento 12.

Poderosas ferramentas de D. melanogaster genética e biologia celular, incluindo a informação do genoma bem anotada, gene binárioOs sistemas de express, e as técnicas de ARNi transgénicos, permitiram-nos identificar os genes essenciais para a biossíntese de ecdiesteróide no PG e do ovário 13, 14, 15. Uma vez que os genes ecdysteroidogenic são identificadas, a regulação da transcrição destes genes e as localizações dinâmicas de produtos de genes pode ser examinado na via de biossíntese de 16. Para esta finalidade, quantitativa-transcrição reversa-PCR, o RNA de hibridação in situ e a análise imuno-histológica são conduzidos. A aplicação destas técnicas inclui uma tarefa difícil; a dissecção elaborada do PG ou do ovário. Em particular, a PG da mosca da fruta é relativamente mais pequena do que a de outros insectos (por exemplo, o bicho da seda e a mosca varejeira), de modo que é necessário para praticar a habilidade vital da mosca da fruta dissecção para amostragem. Além disso, ambos os órgãos ecdysteroidogenic recebem inervaçãos a partir do sistema nervoso central (SNC), 17, 18, 19, 20. Assim, para análises anatômicas precisas, os órgãos ecdysteroidogenic deve ser mantida intacta, juntamente com o sistema nervoso central e outros órgãos, para não perturbar as suas conexões neuronais.

Aqui nós fornecemos protocolos para a dissecção e visualização de órgãos esteroidogênicas em D. melanogaster. Aprender a técnica de dissecção é o ponto de partida fundamental para essas experiências. Além disso, pode-se com sucesso rotular os órgãos esteroidogênicas, bem como seus órgãos interativos com vários anticorpos e linhas de driver GAL4. Aproveitando estas técnicas, materiais e genética, pode-se estudar os mecanismos abrangentes de esteróide biossíntese da hormona.

Protocol

NOTA: O esquema geral de protocolos é mostrado na Figura 1. 1. A dissecção do Anel Glândula larval (RG) NOTA: Em D. melanogaster, que pertence ao Diptera cyclorrhaphous, por o PG estar dentro de um órgão endócrino composto chamado a glândula anel (RG, Figura 2D). Uma vez que é inviável que o PG é cirurgicamente separado a partir de outros tipos de células (discutido mais tarde…

Representative Results

Foram utilizados os protocolos acima para visualizar os órgãos esteroidogênicas e seus órgãos interativos em D. melanogaster larvas e adultos do sexo feminino. O esquema geral de protocolos é mostrado na Figura 1. O RG, incluindo a PG (Figura 2D), é menor e mais transparente do que o cérebro e situa-se no lado dorsal anterior do cérebro (Figura 2A-C e 3A-E). Para marcar as células PG, vários grupos têm gerado vários tipos de anticorpos contra e…

Discussion

Foram estudados biossíntese ecdiesteróide e o seu mecanismo de regulação em D. melanogaster, e concebido um protocolo para a dissecção e imunocoloração. A temporização da biossíntese de ecdiesteróide é afectada por sinais ambientais através das entradas 33 neuronais, por isso, é essencial para a manutenção da inervação dos órgãos ecdysteroidogenic juntamente com o cérebro, VNC, e outros tecidos durante a dissecção.

Como descrito acima,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos Reiko Kise e Tomotsune Ameku por seu apoio técnico para este trabalho. Também somos gratos a Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, o Bloomington Drosophila da Center, Kyoto Stock Center (DGRC), e os estudos de desenvolvimento Hibridoma Bank for stocks e reagentes. Este trabalho foi apoiado por subsídios para YSN de JSPS KAKENHI Grant Número 16K20945, a Fundação Naito, e Inoue Research Award Ciência; e por uma doação para RN de MEXT KAKENHI Grant Número 16H04792.

Materials

egg collection
tissue culture dish (55 mm) AS ONE 1-8549-02  for grape-juice agar plates
collection cup HIKARI KAGAKU
yeast paste Oriental dry yeast, Tokyo
100% grape juice Welch Food Inc.
rearing larvae
small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) SARSTEDT 58.487
disposable loop AS ONE 6-488-01
standard fly food  the recepi us on the website of Blooington stock center.
dissection
dissecting microscope Carl Zeiss Stemi 2000-C
dissecting microscope Leica S8 AP0
tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) IWAKI 1000-035
Sylgard TORAY coarting silicon inside dishes
Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm)  TERUMO NN-2719S A "knife" to cut the tissue
Terumo syringe, 1ml TERUMO SS-01T
forceps, Inox, #5 Dumont, Switzerland
insect pin (0.18 mm in diameter) Shiga Brand for fillet dissection
micro scissors NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.  MB-50-10
fixation
ultrapure water Merck Millipore
phosphate buffered saline (PBS)
Formaldehyde Nacalai tesque 16222-65
Paraformaldehyde Nacalai tesque 02890-45
Triton-X100 Nacalai tesque 35501-15
microtubes (1.5 ml) INA OPTIKA CF-0150
Incubation
As one swist mixer TM-300 (rocker) As one TM-300 rocker
Bovine Serum Albumin SIGMA 9048-46-8
primary antibody
anti-Sro (guinea pig), 1:1000
anti-GFP (rabbit), 1:1000 Molecular Probes A6455 Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 Nakarai tesque 04363-66
anti-5HT (rabbit), 1:500 SIGMA S5545
anti-Hts 1B1 (mouse) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) 1B1
anti-DE-cadherin (rat), 1:20 DSHB DCAD2
anti-nc82 (mouse), 1:50 DSHB nc82
secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A-11008
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A-11001
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate Life Technologies A-11081
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life Technologies A-21435
Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin Life Technologies A-22283
Mounting reagents
Micro slide glass Matsunami Glass Ind.,Ltd. SS7213
Square microscope cover glass Matsunami Glass Ind.,Ltd. C218181
FluorSave reagent (Mounting reagent) Calbiochem 345789
Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) WATSON 5660-222-1S
imaging
LSM700 laser scanning microscope system Carl Zeiss inverted Axio Observer. Z1 SP left
image processing
LSM700 ZEN Carl Zeiss It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system
ImageJ
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP gifts from K. Ito, The University of Tokyo.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010)
w; UAS-mCD8::GFP  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)

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Imura, E., Yoshinari, Y., Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (122), e55519, doi:10.3791/55519 (2017).

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