Summary

Протоколы Визуальное стероидогенных органов и их интерактивные Органов с иммунным окрашиванием плодовой мушки<em> Дрозофилы</em

Published: April 14, 2017
doi:

Summary

Мы опишем протокол для рассечения, фиксации и иммунных стероидогенных органов у дрозофилы личинок и взрослые самок для изучения стероидного биосинтеза гормонов и его механизма регулирования. Помимо стероидогенеза органов, мы визуализируем иннервации стероидогенных органов, а также стероидогенеза клеток-мишеней, таких как зародышевые стволовые клетки.

Abstract

В многоклеточных организмах, небольшая группа клеток наделена специализированная функцией в их биогенной активности, вызывая системную реакцию на рост и размножение. У насекомых, личинок переднегрудная железа (PG) и взрослая женщина играют яичники существенной роль в биосинтезе основных стероидных гормонов, называемых Экдистероидами. Эти ecdysteroidogenic органы иннервируются от нервной системы, с помощью которой время биосинтеза пораженного сигналов окружающей среды. Здесь мы опишем протокол для визуализации ecdysteroidogenic органов и их интерактивных органов у личинок и взрослых плодовой мушки дрозофилы, которая обеспечивает подходящую модельную систему для изучения биосинтеза стероидных гормонов и его механизма регулирования. Умелое рассечение позволяет нам поддерживать позиции ecdysteroidogenic органов и их интерактивные органы, включая мозг, брюшную нервную цепочку, и другие ткани. Иммуноокрашивание сntibodies против ecdysteroidogenic ферментов, наряду с трансгенными белками флуоресценции, управляемых ткане-специфических промоторов, доступны для обозначения ecdysteroidogenic клеток. Кроме того, иннервации ecdysteroidogenic органов также могут быть помечены специфическими антителами или коллекцией GAL4 драйверов в различных типах нейронов. Таким образом, ecdysteroidogenic органы и их нейронные связи могут быть визуализированы одновременно иммунным окрашиванием и трансгенных методов. Наконец, мы опишем, как визуализировать зародышевые стволовые клетки, чье распространение и технические обслуживание контролируются экдистероидами. Этот метод способствует всестороннему пониманию стероидного биосинтеза гормонов и его нейронного механизма регулирования.

Introduction

У многоклеточных организмов, группа клеток обладают специализированной функцией в их биогенной деятельности, которая имеет важное значение для всего тела. Для выполнения своих задач, каждая ткань или орган выражает ряд генов, связанные с их функциями и взаимодействует с другими тканями, чтобы организовать свою деятельность в контексте развития. Для того, чтобы охарактеризовать такие специализированные клеточные функции и взаимодействие между органами, необходимо указать группу клеток, а также другие типы клеток быть сохранены в многоклеточных архитектурах.

Одним из примеров таких специализированных органов являются стероидогенным органом, где многие ферменты биосинтеза опосредуют стадию конверсии из холестерина в активные стероидных гормоны 1. Большинство из этих генов ферментов специфический экспрессируется в стероидогенных органах, а также путь биосинтеза жестко регулируются многими внешними стимулами через гуморальные входы и нейронные входы. однаждыСинтезированные, стероидные гормоны секретируются в гемолимфу и ориентированы на многие ткани и органы для регуляции экспрессии различных генов 2. Таким образом, действие стероидного гормона индуцирует системный ответ для поддержания гомеостаза, роста и размножения.

Для того, чтобы исследовать функции биосинтеза стероидных гормонов и плейотропных действия стероидных гормонов, дрозофилы могут быть использованы в качестве подходящей модельной системы. Во время личиночной стадии, насекомое стероидный гормон, экдистероидов, биосинтезируется в специализированном эндокринный орган называется проторакальной железы (PG) 3. В PG, несколько ecdysteroidogenic ферментов специфически катализировать несколько шагов преобразования из холестерина в экдизона, который управляет линьки и метаморфоза на соответствующих стадиях развития 4. Таким образом, динамическое изменение титра экдистероидов регулируетсямногие сигнальных пути в ответ на сигналы окружающей среды. С другой стороны, на стадии взрослого, экдистероидный играет существенную роль в физиологии, в то числе воспроизведения, сна, памяти, и продолжительностью жизни 5, 6, 7, 8. Известно , что экдистероиды активно синтезируются в яичниках, регулирующее прогрессирование оогенеза 6, 7, 8, 9, 10, 11. Недавно мы сообщали о том , что число зародышевых стволовых клеток (GSCs) зависит от экдистероидов и половой пептидной сигнализации в ответ на стимулы вязки 12.

Мощные инструменты дрозофилы генетики и клеточной биологии, в том числе хорошо аннотированной информации генома, двоичный генсистемы экспрессии и трансгенный RNAi метода, которые позволили нам идентифицировать гены , необходимые для экдистероидсодержащего биосинтеза в PG и яичник 13, 14, 15. После того , как ecdysteroidogenic гены идентифицированы, регуляция транскрипции этих генов и динамических локализации генных продуктов может быть исследована в пути биосинтеза 16. Для этой цели количественно-обратной транскрипции-ПЦР, РНК гибридизация и иммуногистохимического анализа проводятся в. Применение этих методов включает в себя сложную задачу; Сложное рассечение PG или яичника. В частности, PG из плодовой мушки относительно меньше , чем у других насекомых (например , шелкопряд и удар муха), поэтому нужно практиковать жизненно важный навык плодовой мушки рассечение для отбора проб. Кроме того, оба ecdysteroidogenic органы получают иннервациюы из центральной нервной системы (ЦНС) 17, 18, 19, 20. Таким образом, для точных анатомических анализов, ecdysteroidogenic органы должны быть сохранены вместе с ЦНС и другими органами, чтобы не нарушить их нейронные связи.

Здесь мы предлагаем протоколы вскрытия и визуализации стероидогенных органов в D. MELANOGASTER. Изучение техники рассечения является ключевой отправной точкой для этих экспериментов. Кроме того, можно успешно маркировать стероидогенные органы, а также их интерактивные органы с несколькими антителами и линиями драйвера GAL4. Пользуясь этими методы, материалов и генетики, можно изучать комплексные механизмы биосинтеза стероидных гормонов.

Protocol

Примечание: Общая схема протоколов показана на рисунке 1. 1. Препарирование личиночной кольца железы (РГ) Примечание: В D. MELANOGASTER, который принадлежит к cyclorrhaphous двукрылых, ПГ находится в пределах составной эндокринный орган называе?…

Representative Results

Мы использовали вышеупомянутые протоколы для визуализации стероидогенных органов и их интерактивных органов в D. личинок MELANOGASTER и взрослых самках. Общая схема протоколов показана на рисунке 1. РГ, в том числе PG (рис 2D), является меньшим и более прозрачной , чем мозг и …

Discussion

Мы изучали экдистероиды биосинтеза и его механизм регулирования в дрозофиле, и разработали протокол вскрытия и иммунное окрашивание. Сроки экдистероидов биосинтеза зависят от окружающей среды сигналов через нейронные входы 33, так что имеет важное значение для подде…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Рейко Кисы и Tomotsune Ameku за техническую поддержку этой работы. Мы также благодарны Кей Ито, Ольга Алексеенко, Акико Кото, Масаюки Миура, фондовый центр Блумингтона дрозофилы, КИОТСКАЯ Stock Center (DGRC), а также с развитием исследованиями гибрид банк запасов и реагентами. Эта работа была поддержана грантами на YSN из JSPS KAKENHI Грант Номер 16K20945, The Найто Foundation и премии Исследовательского Inoue науки; и грант в RN от МПКСНТА KAKENHI Гранта Номер 16H04792.

Materials

egg collection
tissue culture dish (55 mm) AS ONE 1-8549-02  for grape-juice agar plates
collection cup HIKARI KAGAKU
yeast paste Oriental dry yeast, Tokyo
100% grape juice Welch Food Inc.
rearing larvae
small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) SARSTEDT 58.487
disposable loop AS ONE 6-488-01
standard fly food  the recepi us on the website of Blooington stock center.
dissection
dissecting microscope Carl Zeiss Stemi 2000-C
dissecting microscope Leica S8 AP0
tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) IWAKI 1000-035
Sylgard TORAY coarting silicon inside dishes
Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm)  TERUMO NN-2719S A "knife" to cut the tissue
Terumo syringe, 1ml TERUMO SS-01T
forceps, Inox, #5 Dumont, Switzerland
insect pin (0.18 mm in diameter) Shiga Brand for fillet dissection
micro scissors NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.  MB-50-10
fixation
ultrapure water Merck Millipore
phosphate buffered saline (PBS)
Formaldehyde Nacalai tesque 16222-65
Paraformaldehyde Nacalai tesque 02890-45
Triton-X100 Nacalai tesque 35501-15
microtubes (1.5 ml) INA OPTIKA CF-0150
Incubation
As one swist mixer TM-300 (rocker) As one TM-300 rocker
Bovine Serum Albumin SIGMA 9048-46-8
primary antibody
anti-Sro (guinea pig), 1:1000
anti-GFP (rabbit), 1:1000 Molecular Probes A6455 Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 Nakarai tesque 04363-66
anti-5HT (rabbit), 1:500 SIGMA S5545
anti-Hts 1B1 (mouse) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) 1B1
anti-DE-cadherin (rat), 1:20 DSHB DCAD2
anti-nc82 (mouse), 1:50 DSHB nc82
secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A-11008
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A-11001
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate Life Technologies A-11081
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life Technologies A-21435
Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin Life Technologies A-22283
Mounting reagents
Micro slide glass Matsunami Glass Ind.,Ltd. SS7213
Square microscope cover glass Matsunami Glass Ind.,Ltd. C218181
FluorSave reagent (Mounting reagent) Calbiochem 345789
Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) WATSON 5660-222-1S
imaging
LSM700 laser scanning microscope system Carl Zeiss inverted Axio Observer. Z1 SP left
image processing
LSM700 ZEN Carl Zeiss It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system
ImageJ
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP gifts from K. Ito, The University of Tokyo.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010)
w; UAS-mCD8::GFP  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)

References

  1. Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
  2. Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell. Endocrinol. 375 (1), 10-13 (2013).
  3. Gilbert, L. I., Rybczynski, R., Warren, J. T. Control and biochemical nature of the ecdysteroidogenic pathway. Annu. Rev. Entomol. 47, 883-916 (2002).
  4. Niwa, R., Niwa, Y. S. Enzymes for ecdysteroid biosynthesis: their biological functions in insects and beyond. Biosci. Biotechnol. Biochem. 78 (8), 1283-1292 (2014).
  5. Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in drosophila. Trends Endocrinol. Metab. 11 (7), 276-280 (2000).
  6. Ishimoto, H., Kitamoto, T. Beyond molting-roles of the steroid molting hormone ecdysone in regulation of memory and sleep in adult Drosophila. Fly. 5 (3), 215-220 (2011).
  7. Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (15), 6381-6386 (2009).
  8. Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299 (5611), 1407-1410 (2003).
  9. Buszczak, M., Freeman, M. R., Carlson, J. R., Bender, M., Cooley, L., Segraves, W. a Ecdysone response genes govern egg chamber development during mid-oogenesis in Drosophila. Development. 126 (20), 4581-4589 (1999).
  10. Carney, G. E., Bender, M. The drosophila ecdysone receptor (EcR) gene is required maternally for normal oogenesis. Genetics. 154 (3), 1203-1211 (2000).
  11. Uryu, O., Ameku, T., Niwa, R. Recent progress in understanding the role of ecdysteroids in adult insects: Germline development and circadian clock in the fruit fly Drosophila melanogaster. Zoological Lett. 1, 32 (2015).
  12. Ameku, T., Niwa, R. Mating-Induced Increase in Germline Stem Cells via the Neuroendocrine System in Female Drosophila. PLOS Genet. 12 (6), e1006123 (2016).
  13. Danielsen, E. T., et al. A Drosophila Genome-Wide Screen Identifies Regulators of Steroid Hormone Production and Developmental Timing. Dev. Cell. 37 (6), 558-570 (2016).
  14. Ou, Q., Zeng, J., Yamanaka, N., Brakken-Thal, C., O’Connor, M. B., King-Jones, K. The Insect Prothoracic Gland as a Model for Steroid Hormone Biosynthesis and Regulation. Cell Rep. , (2016).
  15. Yamanaka, N., Rewitz, K. F., O’Connor, M. B. Ecdysone control of developmental transitions: lessons from Drosophila research. Annu. Rev. Entomol. 58, 497-516 (2013).
  16. Niwa, Y. S., Niwa, R. Transcriptional regulation of insect steroid hormone biosynthesis and its role in controlling timing of molting and metamorphosis. Dev. Growth Differ. 58, 94-105 (2015).
  17. Monastirioti, M. Distinct octopamine cell population residing in the CNS abdominal ganglion controls ovulation in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 264 (1), 38-49 (2003).
  18. Siegmund, T., Korge, G. Innervation of the ring gland of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 431 (4), 481-491 (2001).
  19. McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic Hormone Regulates Developmental Timing and Body Size in Drosophila. Dev. Cell. 13 (6), 857-871 (1979).
  20. Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Serotonergic neurons respond to nutrients and regulate the timing of steroid hormone biosynthesis in Drosophila. Nat. Commun. 5, 5778 (2014).
  21. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
  22. Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
  23. Ohhara, Y., et al. Autocrine regulation of ecdysone synthesis by β3-octopamine receptor in the prothoracic gland is essential for Drosophila metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (5), 1452-1457 (2015).
  24. Gibbens, Y. Y., Warren, J. T., Gilbert, L. I., O’Connor, M. B. Neuroendocrine regulation of Drosophila metamorphosis requires TGFbeta/Activin signaling. Development. 138 (13), 2693-2703 (2011).
  25. Parvy, J. P., et al. A role for βFTZ-F1 in regulating ecdysteroid titers during post-embryonic development in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 282 (1), 84-94 (2005).
  26. Parvy, J. -. P., et al. Forward and feedback regulation of cyclic steroid production in Drosophila melanogaster. Development. 141 (20), 3955-3965 (2014).
  27. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  28. Rewitz, K. F., Yamanaka, N., Gilbert, L. I., O’Connor, M. B. The Insect Neuropeptide PTTH Activates Receptor Tyrosine Kinase Torso to Initiate Metamorphosis. Science. 326 (5958), 1403-1405 (2009).
  29. Li, H. -. H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Rep. 8 (3), 897-908 (2014).
  30. Alekseyenko, O. V., Lee, C., Kravitz, E. A. Targeted manipulation of serotonergic neurotransmission affects the escalation of aggression in adult male Drosophila melanogaster. PLOS One. 5 (5), e10806 (2010).
  31. Domanitskaya, E., Anllo, L., Schüpbach, T. Phantom, a cytochrome P450 enzyme essential for ecdysone biosynthesis, plays a critical role in the control of border cell migration in in Drosophila. Dev. Biol. 386 (2), 408-418 (2014).
  32. Song, X., Zhu, C. -. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296 (5574), 1855-1857 (2002).
  33. Niwa, Y. S., Niwa, R. Neural control of steroid hormone biosynthesis during development in the fruit fly Drosophila melanogaster. Genes Genet. Syst. 89 (1), 27-34 (2014).
  34. Yoshiyama-Yanagawa, T., et al. The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme. J. Biol. Chem. 286 (29), 25756-25762 (2011).
  35. Niwa, R., et al. Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the "Black Box" of the ecdysteroid biosynthesis pathway. Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).
  36. Komura-Kawa, T., et al. The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier. PLOS Genet. 11 (12), e1005712 (2015).
  37. Yamanaka, N., Marqués, G., O’Connor, M. B. Vesicle-Mediated Steroid Hormone Secretion in Drosophila melanogaster. Cell. 163 (4), 907-919 (2015).
  38. Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. BBA-Gen. Subjects. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
  39. Owald, D., Lin, S., Waddell, S. Light, heat, action: neural control of fruit fly behavior. Phil. T. Roy. Soc. B. 370 (1677), 20140211 (2015).

Play Video

Cite This Article
Imura, E., Yoshinari, Y., Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (122), e55519, doi:10.3791/55519 (2017).

View Video