Summary
在这里，我们描述了一种从成年肌肉组织中获得纯种人成肌细胞的方法。这些细胞用于研究体外骨骼肌分化，特别是研究参与Ca 2+信号传导的蛋白质。
Abstract
卫星细胞（SC）是位于肌纤维质膜与周围基底层之间的肌肉干细胞。它们对于肌肉再生至关重要。在骨骼肌经常发生的损伤中，SC被激活。它们作为成肌细胞增殖并分化以修复肌肉损伤。在肌肉分化过程中发生的许多事件中，胞质Ca 2+信号是非常重要的。这些Ca 2+信号来自内部Ca 2+储存物的Ca 2+释放，以及来自细胞外空间的Ca 2+进入，特别是存储操作的Ca 2+进入（SOCE）。本文介绍了一种用于从矫形外科手术后收集的肌肉样品中获得纯人类成肌细胞群体的方法。机械和酶消化组织，扩增细胞，然后根据特异性的存在通过流式细胞术分选fic膜标记。一旦获得，通过从培养基中除去生长因子，使人成肌细胞扩大并致力于分化。特异性转录因子和体外免疫荧光的表达水平用于评估控制条件下和沉默参与Ca 2+信号传导的蛋白质后的肌原性分化过程。最后，我们详细介绍了使用Fura-2作为比较的Ca 2+探针，提供可靠和可重复的SOCE测量。
Introduction
人骨骼肌由肌原纤维前体细胞融合产生的收缩性多核肌肉纤维组成。由于肌肉纤维（肌膜）和基底层之间的骨骼肌干细胞存在于骨骼肌干细胞之间，骨骼肌具有在损伤后再生的能力。在未受伤的肌肉中，SC主要存在于静止状态。响应于机械应力或损伤，雪旺成为激活（成肌细胞），增殖，和经历或者分化以形成新的肌纤维或自我更新来补充SC池1，2。多年来，开发了几种技术来分离SCs及其后代，成肌细胞，从骨骼肌活组织检查。对这些细胞上表达的细胞表面标志物的更多了解和荧光激活细胞分选（FACS）的方法3，4，5，现在有可能对人成肌细胞的纯群体从肌肉样品隔离。
钙信号调节骨骼肌发育，体内平衡和再生。尤其是钙条目是继细胞内储存消耗激活，叫SOCE，是这些过程很重要6。在细胞刺激后，内/肌质网（ER / SR）中的Ca 2+水平降低，这反过来激活允许Ca 2+进入以重新填充ER / SR 7的质膜Ca 2+通道。 SOCE中的两种主要蛋白质是ER / SR Ca 2+ -感染基质相互作用分子1（STIM1）蛋白和质膜Ca 2+通道Orai1。骨骼肌丰富地表达了这两种蛋白质，以及同一家族的其他蛋白质（STIM2 aND Orai2-Orai3）8,9和几个的Ca 2+瞬时受体电位规范（TRPC）家族10，11，12，13的可透过的通道。通过SOCE通路的Ca 2+进入对肌肉形成/再生十分重要14 。 STIM1或Orai1蛋白的突变对肌肉功能的有害影响，主要导致肌肉张力减退15。与SOCE障碍动物模型也具有增强的易疲劳6，16，17显示降低的肌肉质量和力量，在一起。如上所述，其他STIM和Orai蛋白以及许多TRPC通道在骨骼肌中表达，并且它们各自的作用迄今尚未确定。敲门拥有自己的表达水平，因此可以调查他们对SOCE及其在人类骨骼肌分化过程中的作用的影响。
可以使用两种不同的方法进行SOCE测量：电生理电流记录和Ca 2+测量。电生理学肯定是一种更直接的方法，因为它测量了目前的兴趣及其相关的电生理特征。然而，这种技术很难应用于肌肉细胞，主要是因为肌肉细胞的大尺寸和内源性SOCE电流的小尺寸。细胞溶质Ca 2+成像在技术上是非常易于使用的，但测量更为间接，因为细胞质中测量的Ca 2+水平反映了Ca 2+的进入和再次抽出细胞或内部商店。
一种方法，包括从肌肉的小块分离成肌细胞本文解释了酶消化，扩增和FACS后的等信号。肌肉分化和免疫荧光协议遵循分化标志物的表达随时间的过程中描述18。最后，解释了SOCE的测量和不同离子通道在Ca 2+信号和骨骼肌分化中的作用。
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Protocol
在矫形外科手术中收集人体肌肉样本（从半神经肌肉获得的组织）作为外科手术废物。与人类研究有关的所有方法都是按照瑞士监管机构的指导方针和条例进行的，并经瑞士日内瓦省政府批准的瑞士法典委员会批准（议定书CER号12-259） 。从参与研究的所有成年受试者获得知情和书面同意。
1.从人类骨骼肌分离成肌细胞
- 在所有程序中，通过在II级组织培养罩下工作并使用无菌培养基和无菌缓冲液来维持无菌条件。
注意：此过程可应用于许多人类骨骼肌肉。
解离协议
- 将肌肉样品（2-3克）转移到无菌6厘米盘子。
- 用5-10毫升磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤肌肉样品。重复洗涤。
- 使用弯曲的剪刀和夹具去除结缔组织和脂肪组织。
- 称重肌肉样品（参见步骤2.13），并将其转移到新的无菌6厘米平板上。
- 加入5 mL的0.05％胰蛋白酶-EDTA。
- 使用剪刀，将肌肉组织切成小块（小于2毫米）。
- 使用10mL血清移液管将切碎的肌肉转移到含有磁条的200mL解离瓶中。重复此步骤，直到将90mL的0.05％胰蛋白酶-EDTA与所有切碎的肌肉一起转移至解离盒。关闭解离瓶，并在温和搅拌下在37℃下孵育60分钟。
- 从加热浴中取出解离瓶，并通过向解离瓶中加入10mL胎牛血清（FCS; 10％最终体积）停止酶反应。用移液管均质化混合物。
- 预备是两个50 mL管，每个具有70μm的细胞过滤器。通过在过滤器上上下移液直到悬浮液通过，将每个管上的细胞过滤器的一半通过细胞过滤器。
- 将管子在200xg和20℃下离心5分钟;吸出并丢弃上清液。
- 用10ml生长培养基（GM; 表1 ）重悬细胞，并将细胞通过置于一个50mL管上的40-μm细胞过滤器。将管子在200xg和20℃下离心5分钟;吸出并丢弃上清液。
- 用10 mL GM悬浮细胞，并以200 xg和20℃离心管5 min;吸出并丢弃上清液。
- 用1mL GM重悬细胞，并使用Neubauer室计数细胞。
注意：通常，每克肌肉的产量应为3×10 5个细胞。通过将细胞数除以肌肉生物体的重量来计算产量sy（步骤2.4）。 - 将2×10 5个细胞置于含有4mL GM的无菌6cm平板中，并在37℃和7％CO 2下孵育。根据需要准备尽可能多的板材。
- 3天后更改GM。
注意：新鲜分离的细胞需要时间粘附到培养板上。此外，第一次造血细胞倍增时间约为50-60小时。第一师后，倍增时间约为20小时。 - 5 - 7天后，当细胞达到70-80％融合（约1.5×10 6个细胞/每6cm平板）时，开始抗体染色和细胞分选（步骤3）。
3.抗体染色和细胞分选
- 用PBS冲洗一次后，用37℃和7％CO 2的 1mL 0.05％胰蛋白酶-EDTA将贴壁细胞（6cm平板）孵育3分钟（或以5％CO 2孵育）。通过加入2mL GM停止反应，并将细胞收集在15mL管中。离心（200×g 5分钟）后，在1 mL的GM中通入细胞。
- 使用Neubauer室计数细胞。
- 在冰上执行以下步骤。
注意：在细胞计数器上设置正确的荧光补偿的程序是必不可少的，任何细胞仪都应该相似。管1和管2用作阴性对照。管3-7用于在第一次实验期间在血细胞仪上设置补偿（ 表2 ）。用于每种抗体及其相应同种型的最终浓度应相同（约1μg/ 10 6个细胞）。 - 对于管1-7，分配1×10 5个细胞/管（5-mL管）（ 表2 ）。将剩余的细胞悬浮液放在管8中进行细胞分选。
- 用1 mL冷FACS缓冲液（PBS-5％FCS）清洗细胞。关闭并在200 xg和4℃离心管5分钟;吸出并丢弃上清液。
- 每管加入200μLFACS缓冲液。加入抗体e管根据表2 。在冰上孵育30分钟。
- 洗涤细胞：向每个管中加入1 mL FACS缓冲液。关闭并以200 xg和4℃离心管5 min。吸出并丢弃上清液。再一次重复这一步。
- 将细胞重悬在500μL的FACS缓冲液中。关闭管子并将其保持在冰上直到细胞分选。准备4管1.5 mL，每个管含有500μL的GM，在细胞分选过程中收集细胞是必需的。把它们放在冰上。
- 通过流式细胞术分析人类成肌细胞（ 图1 ）。排除CD45阳性造血细胞后，基于CD56表达分离CD45阴性细胞。然后，将CD34，CD144和CD146（人成肌细胞定义为CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-细胞）的CD56阳性细胞门。重新分析一小部分排序的细胞群以检查纯度。
- 将含有人类myobla的管放在一起sts在一个15-mL管中，并通过加入5mL GM洗涤一次。将管子在200xg和20℃下离心5分钟;吸出并丢弃上清液。
- 将细胞重悬于1mL GM中，并在含有4mL GM（2×10 5个细胞/平板）的未涂覆的6cm平板上平板培养细胞。在37℃和7％CO 2下孵育。
4.细胞维护
- 每2天更换一半的培养基。从培养皿中取出2 mL老GM，加入2 mL GM。
注意：成肌细胞产生有利于培养条件的生长因子。 - 当细胞达到70-80％汇合时，对细胞进行胰蛋白酶化，以避免预分化。用PBS冲洗一次后，用37℃和7％CO 2的 1mL 0.05％胰蛋白酶-EDTA将贴壁细胞（6cm平板）孵育3分钟。通过加入2mL GM停止反应并将细胞收集在15mL管中。离心（200×g，5分钟）后，将细胞悬浮在1 mL GM中。
- 计数细胞并准备6cm的平板，每个板2×10 5个细胞在4mL的GM中。
- 保持人类成肌细胞达6代，或在含有10％DMSO的GM中冷冻，每毫升1×10 6个细胞。在逐层冷冻箱中冷冻细胞（1°C / min）;为了长期储存，将细胞置于液氮中。
5.用siRNA转染人成肌细胞
注意：在诱导分化前两天，使用商业转染试剂转染成肌细胞。特定siRNA对基因的作用总是与对照siRNA的作用进行比较。 siRNA是双链RNA，必须保存在冰上并用手套操作。
- 在6厘米平板（约1.5×10 6个细胞）中获得70-80％汇合的人成肌细胞单层。
注意：每次转染需要5×10 5个细胞以获得一个对照GM中2天后转染成肌细胞的流动单层。 - 准备玻璃盖玻片（在步骤7中描述为钙成像）。
- 热GM，0.05％胰蛋白酶-EDTA，PBS至37℃。
- 在II级组织培养罩中执行以下所有步骤以维持无菌性。
- 在1.5 mL试管中，在20μM下调出500μL血清培养基，3μL转染试剂和1μLsiRNA。轻轻混合并保持在室温（RT）15 - 20分钟。
- 在孵育期间，准备成肌细胞进行转染。用PBS冲洗一次后，用37℃和7％CO 2的 1mL 0.05％胰蛋白酶-EDTA将贴壁细胞（6cm平板）孵育3分钟。通过加入2mL GM停止反应并将细胞收集在15mL管中。离心（200×g 5分钟）后，将细胞重悬于1mL的GM中。
- 使用Neubauer室计数细胞。
- 重悬5×10 5个细胞在每次转染的200μL的GM中（ 即，用于2次转染，重悬于400μL）。
- 向每个500μLsiRNA转染混合物中加入200μL细胞悬浮液。上下移动两次，在室温下孵育5分钟。
- 将700μL（细胞+ siRNA转染子）加入到含有玻璃盖玻片的3.5cm培养皿中。加入GM，终体积为2 mL。
- 在37℃和7％CO 2下24小时后，用2mL新鲜GM完全替代培养基。另外24小时后，通常存在转染细胞的汇合单层;如果是这样，通过用2mL分化培养基（DM; 表1 ）代替GM来诱导成肌细胞分化。
- 诱导分化后24 - 48 h或增殖成肌细胞进行钙成像实验。
注意：诱导分化后48 h通常进行免疫荧光。
Imm分化标记的非荧光染色
注意：在DM中48小时后进行免疫荧光染色，但也可以在其他分化时间进行。肌细胞生成素和MEF2是仅在分化细胞中表达的核蛋白（融合成肌管之前），其染色允许评估分化过程。肌球蛋白重链（MyHC）仅在肌管中表达，用于估计肌管大小和融合指数（肌管数量/核总数）。
- 在DM中48小时后，在室温下用1mL PBS洗涤分化细胞的汇合单层两次。仔细做这个，以避免分离肌管。
- 在室温下用1mL的4％多聚甲醛（PFA）将细胞固定15分钟。用PBS洗涤细胞两次，每次5分钟。
- 用含有0.25％Triton X-100的1mL PBS将细胞渗透45分钟，并用1mL PBS洗涤3次。
- 阻止不了通过在补充有0.2％Tween-10和2％山羊血清（阻滞溶液）的PBS中的细胞在室温下孵育30分钟来实现特异性结合位点。
- 制备在块溶液中稀释的一抗（600μL/ 3.5cm板）。
注意：使用以下一抗：小鼠抗肌钙蛋白（1:600），兔抗MEF2（1:300）和小鼠抗MyHC抗体（MF20,1：1,000）。可以将相同的阻断溶液，小鼠抗肌球蛋白重链或小鼠抗肌发生蛋白与兔抗MEF2混合。 - 去除阻滞溶液，每3.5厘米平板加入600μL一抗溶液，并在4℃下在加湿室中孵育过夜。
- 用1 mL PBS洗涤细胞3次。山羊抗小鼠Alexa 488（1：1,000），山羊抗兔亚型Alexa 546（1：1,000），山羊抗小鼠Alexa 488（1:1000），在室温下孵育1小时，在室内600μL二嵌段溶液中制备的二抗，和DAPI（1:50，15μM的储备溶液）。
CAUTION：DAPI是用手套处理的有毒化合物。 - 用1mL PBS吸出并洗涤细胞3次。
- 使用具有防紫外线溶液的聚乙烯醇安装介质安装玻璃盖玻片。将它们保持在4°C，防止光照直到成像细胞。
7.钙成像
- 预先培养，准备直径25毫米的玻璃盖玻片。将盖玻片放在70％乙醇中48小时，以清除表面上的任何油脂和污垢，从而减少细胞粘附在盖玻片上。
- 用水冲洗盖玻片几次后，将其放回水中并灭菌（高压灭菌）。
- 每3.5厘米培养板放一块盖玻片，让它们干燥。储存培养皿进行进一步实验或立即使用。
- 将转染的成肌细胞（5 - 6×10 5个细胞）加入到玻璃盖玻片中。
注意：诱导后24 - 48 h进行实验或在增殖成肌细胞上。 - 为了进行Ca 2+成像，用PBS或直接用实验培养基（含钙培养基; 表3 ）清洗细胞2次。用2μMFura-2 / AM加上1μMPluronic酸将细胞在室温下在黑暗中加载约30分钟。
注意：Pluronic acid有助于溶解Fura-2。 Fura-2 / AM和pluronic acid溶解在含钙培养基中。 - 在相同的培养基中洗涤细胞两次，但没有Fura-2 / AM和普朗尼克酸，并将其留在黑暗中另外10-15分钟以允许Fura-2 / AM的去酯化。
- 如果Fura-2的加载效率太低，可以添加更多的Fura-2（ 例如 4μM）和/或将细胞孵育较长时间（ 例如 40分钟）。
- 从培养皿中取出盖玻片并将其安装在实验室中。加入〜1 mL含钙培养基（取决于实验的体积精神室）。将其安装在显微镜舞台上并开始录制。
注意：荧光Ca 2+敏感探针Fura-2在340 nm和380 nm交替激发，发射光在510 nm处收集。随着Ca 2+浓度的波动相对较慢，每2秒获得1个比例。 - 为了激活SOCE，使用以下典型的沙星烟碱/ Ca 2+再添加方案：在含钙培养基中将细胞离开2-3分钟。用无钙培养基更换培养基1-2分钟。
- 加入1μP毒胡萝卜素消耗内部钙储存。
注意：Thapsigargin是肌质内质网Ca 2+ ATP酶（SERCA）泵活性的不可逆阻断剂.8-10分钟后，用含钙培养基快速置换培养基。 Ca 2+将通过SOCE通道进入细胞。等待约5分钟，然后终止实验。
小心：Thapsigargin是一种有毒的化合物，应用手套处理。
- 加入1μP毒胡萝卜素消耗内部钙储存。
8. Ca 2+测量分析
注意：使用采集软件进行分析。
- 打开实验。在没有细胞（背景区域）的区域中绘制区域1，并绘制要分析的细胞的细胞质中的其他区域（该区域可以在任何图像上绘制：340nm，380nm，或比例图像）。转到“运行实验”>“参考图像”。在340和380频道下，选择“区域1”，然后点击“减去背景”。
- 运行整个实验（F4：向前），以确保没有干扰背景区域，例如穿过背景区域的荧光灰尘斑点，并且在实验期间细胞不移动。
注意：所选择的兴趣区域不应包括黑暗地区;否则，比率值将显得嘈杂，因为背景的一部分将被包括在测量中。 - 点击“日志数据”，再次播放整个实验。
注意：这将打开一个电子表格，其中记录时间和比率。还可以节省340 nm和380 nm的波长。 - 要获得关于SOCE的信息，从实验中提取两个重要参数：Ca 2+再加入的幅度和Ca 2+进入阶段的斜率（ 图3 ）。
- 通过从Ca 2+升高的最大幅度减去Ca 2+再添加之前的比值获得振幅。通过拟合Ca 2+重添加后第一秒的线性回归获得最大斜率。
注意：毒胡萝卜素反应曲线下的面积也是提取物的参考参数t，因为它反映了存储在SR中的游离钙的量。
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Representative Results
在人肌肉样品的酶解后，在GM中扩增细胞。在FACS后获得定义为CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-细胞的人成肌细胞。成肌细胞占分析人口的60％以上（ 图1 ）。将原代人成肌细胞复制，生长至汇合，并在DM中培养48小时。免疫染色用于转录因子MEF2和肌肉特异性蛋白质肌球蛋白重链（MyHC）的表达，我们观察到大部分细胞在体外形成肌管（MyHC阳性细胞），融合指数为60.9±1.3％ （n = 5; 图2 ）。我们还观察到，大约40％的称为储备细胞的人类成肌细胞逃脱了这种终末分化，并保持未分化的单核细胞。对于功能研究，我们分析了起始后48小时成肌细胞或肌管的Ca 2+反应分化。 图3示出了用于诱导SOCE的代表性协议以及从这种记录中提取的关键参数。为了辨别与SOCE相关的分子相关的信息，用感兴趣的分子的siRNA转染细胞。 图4显示了TRPC家族沉默Ca 2+透明通道对成肌细胞中SOCE的影响。
图1 ：人成肌细胞的FACS。用以下细胞表面标志物：CD45，CD56，CD34，CD144和CD146的抗体免疫分离的人细胞。排除CD45阳性造血细胞后，CD45阴性细胞基于CD56表达分离。然后将CD56阳性人群门控用于CD34，CD144和CD146。人成肌细胞定义为CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-细胞，如先前所描述19，4。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2 ：人成肌细胞分化。 （ A ）将人成肌细胞的汇合单层暴露于DM中48小时;固定;并用针对MEF2（红色），MyHC（绿色）和DAPI（蓝色）的抗体染色以鉴定核。刻度棒=50μm。 （ B ）融合指数代表融合在肌管中的细胞核数量除以一定场域的总核数。数据是5次独立实验的平均值±SEM。请点击此处查看此图的较大版本。
图3 ：烟arg蛋白诱导的SOCE的代表性钙测量。肌管装载Fura-2，测定胞质Ca 2+浓度。 （ A ）细胞在含钙培养基中静置数分钟，然后在无钙培养基中静置2分钟。然后使用1μM毒胡萝卜素8分钟，然后再加钙。从这种记录中提取的3个重要参数是：烟in素反应曲线下的面积，SOCE的斜率和SOCE的幅度。 （ B ）3个参数的量化。曲线下方的区域提供了有关存储在ER / SR中的Ca 2+量的信息，另外两个参数允许定量SOCE的成立。 请点击此处查看此图的较大版本。
图4 ：TRPC1和TRPC4在SOCE中的参与。 （ A ）使用Fura-2在用siTRPC1或siTRPC1和siTRPC4转染的增殖成肌细胞中评价胞质Ca 2+浓度。在不存在外部Ca 2+ （Ca 2+游离）的情况下，在内部储存物消耗1μM毒胡萝卜素引发SOCE，并在再加入2mM外部Ca 2+时测量 。每个痕迹代表代表性盖玻片的平均值。 （ B ）siRNA对SOCE幅度的影响的定量。该图已经从参考12修改，经许可。酒吧 e平均值±SEM，* p <0.05。 请点击此处查看此图的较大版本。
| 生长培养基（GM）： | 浓度 | 分化培养基（DM）： | 浓度 | |||||
| 火腿的F10 | DMEM | |||||||
| FCS | 15％ | 牛血清白蛋白 | 0.5 mg / ml | |||||
| 牛血清白蛋白 | 0.5 mg / ml | 表皮生长因子 | “> 10 ng / ml||||||
| 胎球蛋白 | 0.5 mg / ml | 胰岛素 | 0.01mg / ml | |||||
| 表皮生长因子 | 10 ng / ml | 肌酸 | 1mM | |||||
| 地塞米松 | 0.39μg/ ml | 丙酮酸 | 100μg/ ml | |||||
| 胰岛素 | 0.04 mg / ml | 尿苷 | 50μg/ ml | |||||
| 肌酸 | 1mM | 庆大霉素 | 10μg/ ml | |||||
| 丙酮酸 | 100μg/ ml | <td colspan =“2”> | ||||||
| 尿苷 | 50μg/ ml | |||||||
| 庆大霉素 | 5μg/ ml | |||||||
表1：成肌细胞培养物的培养基组成。
| 管 | 抗体 | |||||
| 1 | 没有 | |||||
| 2 | 同种型AlexaFluor 488-，同种型PE-CF594，同种型PE，同种型PECy7I型APC | |||||
| 3 | 小鼠抗人CD56-AlexaFluor 488 | |||||
| 4 | 鼠标反- 人类CD45 PE-CF594 | |||||
| 五 | 小鼠抗人CD144-PE | |||||
| 6 | 小鼠抗人CD146-PECy7 | |||||
| 7 | 小鼠抗人CD34-APC | |||||
| 8 | 小鼠抗人CD56-AlexaFluor 488-，小鼠抗人CD45 PE-CF594，小鼠抗人CD144-PE，小鼠抗人CD34-APC，小鼠抗人CD146-PECy7 | |||||
表2：用于细胞分选的抗体。
| 含钙介质 | 浓度 | 无钙介质 | 浓度 | |||||
| 氯化钠 | 氯化钠 | 135 mM | ||||||
| 氯化钾 | 5 mM | 氯化钾 | 5 mM | |||||
| 氯化镁 | 1mM | 氯化镁 | 1mM | |||||
| 氯化钙 | 2mM | EGTA | 1mM | |||||
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM | |||||
| 葡萄糖 | 10 mM | 葡萄糖 | 10 mM | |||||
| 用NaOH调节pH 7.45 | 用NaOH调节pH 7.45 | |||||||
表3：钙成像实验的中等成分。
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Discussion
来自成年骨骼肌的人成肌细胞的分离和培养提供了体外模型来研究肌肉分化和肌肉再生。在本文中，我们提供了一种协议，允许以简单且成本有限的方式纯化高产量的人类成肌细胞。此外，该技术在分离的成肌细胞的百分比及其肌原性分化效率方面提供了可靠和可重现的结果。事实上，我们在细胞分选后获得约60％的人类成肌细胞。这些细胞可保持培养多达6代（约30倍），并保持其分化能力。此外，在将培养基从GM改变为DM后，肌原性分化发生迅速，如DM中2至3天，成肌细胞融合最大。在这个模型中，大约60％的成肌细胞在DM中2天后融合成肌管。另一个优点是这些主要的人体细胞l培养物易于用siRNA转染。我们实验室使用的GM和DM介质是自制的。或者，可以使用商业媒体，但是我们从未尝试过在人类原始文化中的效率。
所述方法的一个缺点是在组织酶消化过程中使用胰蛋白酶。该过程除去大部分细胞表面标志物，并意味着我们在进行FACS之前将细胞留在培养物中几天。可以使用胶原酶代替胰蛋白酶以更好地保留膜蛋白质并且允许在组织解离之后立即分选人成肌细胞。然而，胶原酶的成本显着高于胰蛋白酶，并且在细胞分选之后仍然需要扩增步骤以获得足够的细胞数用于随后的实验。该技术的另一个限制是从矫形器获得的肌肉样品的“质量”ic手术。实际上，由于手术，获得的组织块可能或多或少受损，并且实验室中的手术与细胞解离之间的时间可以每天变化。然而，对于成肌细胞分离，纯化和分化成肌管，我们通常获得满意的结果。最后，患者的年龄可能是一个问题，因为卫星细胞的数量和再生能力随着20岁而下降。因此，我们将实验限于年轻患者（40岁以下）。
如上所述，成肌细胞快速有效地区分，这是研究骨骼肌分化的初始事件的一个很大的优点。然而，随着肌管快速形成，它们也具有自发收缩和从培养板分离的倾向。这排除了后续融合事件的分析。研究这些后来的事件，需要用细胞外基质涂覆培养板以改善细胞粘附并减少肌管脱离21 。
使用荧光探针Fura-2的钙成像是广泛使用的，可重现的技术，易于执行。 Fura-2的加载是有效的，并且使用诸如Fura-2的比例探针比单波长染料具有几个优点。它使焦点的变化或细胞之间和细胞内的负载（ 例如细胞核与胞质溶胶）的正常化。我们描述的引入和测量SOCE的协议经常用于许多不同的蜂窝系统。不同通道或钙调节剂的沉默允许澄清SOCE的分子组成以及不同成员在肌成肌细胞和肌管中的相对重要性。使用Fura-2和Ca 2+成像的另一种方法是应用Mn 2+淬火技术。 Mn 2+通过Ca 2+渗透通道进入细胞，并淬灭fura-2荧光。淬火率的措施给出了SOCE 22，23的更直接的测量。然而，这需要使用稍微不同的设备。也可以使用遗传编码的Ca 2+指示剂进行Ca 2+信号传导，其具有精确定位在不同细胞室中的巨大优点。缺点是细胞转染的需求和信号的动力学，其通常小于化学染料24 。为了测量细胞器如线粒体或SR中的Ca 2+ ，基因探针是金标准。然而，对于胞质Ca 2+测量，使用Fura-2与遗传探针的益处依然存在。
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Disclosures
作者没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了瑞士国家科学基金会（拨款号310030-166313），“基金会马塞尔·莱瓦兰特基金会”以及“基金会报告”的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham’s F10 | ThermoFisher Scientific | 31550-023 | |
| FCS | ThermoFisher Scientific | 10270-106 | Lot 41G5532K |
| BSA | Sigma | O5482 | |
| fetuin | Sigma | F3385 | |
| EGF | Corning | 354001 | |
| Dexamethansone | Sigma | D1756 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Creatine | Sigma | 27900 | |
| Pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Falcon 50 mL tube | Falcon | 352070 | |
| Falcon 15 mL tube | Falcon | 352096 | |
| Falcon 5 mL tube (FACS) | Falcon | 352058 | |
| Culture medium: OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985-047 | |
| Transfectant reagnt: RNAiMax | ThermoFisher Scientific | 1756064 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190-094 | |
| Mounting medium | Fluka | 10981 | |
| Mouse anti-MyHC * | DSHB | MF20 | concentrate |
| Mouse anti-myogenin | BD Pharmigen | 556358 | |
| Rabbit anti-MEF2 | Santa Cruz Biotech | C-21 | |
| Goat anti-mouse Alexa488 | ThermoFisher Scientific | A11029 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 546 | ThermoFisher Scientific | A11035 | |
| Mouse anti human CD56-Alexa488 | BD Pharmingen | 557699 | |
| Mouse anti human CD146-PECy7 | BD Pharmingen | 562135 | |
| Mouse anti human CD45-PE-CF594 | BD Pharmingen | 562279 | |
| Mouse anti human CD34-APC | BD Pharmingen | 345804 | |
| Mouse anti human CD144-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
| Alexa Fluor 488 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557702 | |
| PECy7 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557872 | |
| PE-CF594 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 562292 | |
| APC mouse IgG1k | BD Pharmingen | 550854 | |
| PE mouse IgG1k | BD Pharmingen | 556650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | CAUTION: toxic compound |
| Paraformaldehyde | Fluka | 762400 | |
| Fura-2 AM | ThermoFisher Scientific | F1201 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher Scientific | P3000MP | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | CAUTION : toxic compound |
| Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3 | Molecular Device | ||
| * : MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A. |
References
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