Summary
ここでは、成人の筋肉組織からのヒト筋芽細胞の純粋な集団を得るための方法を説明する。これらの細胞は、in vitro骨格筋分化を研究するため、特にCa 2+シグナル伝達に関与するタンパク質を研究するために使用される。
Abstract
衛星細胞（SC）は、筋線維の原形質膜と周囲の基底層との間に位置する筋幹細胞である。彼らは筋肉の再生に不可欠です。骨格筋において頻繁に起こる傷害の際に、SCが活性化される。それらは筋芽細胞として増殖し、筋肉病変を修復するために分化する。筋肉分化の間に起こる多くの事象の中で、サイトゾルCa 2+シグナルは非常に重要である。これらのCa 2+シグナルは、細胞内空間、特に貯蔵操作Ca 2+エントリー（SOCE）からのCa 2+流入と同様に、内部Ca 2+貯蔵からのCa 2+放出から生じる。この論文では、整形外科手術後に収集された筋肉サンプルからヒト筋芽細胞の純粋な集団を得るために使用される方法論について説明する。組織を機械的および酵素的に消化し、細胞を増幅させ、次いで、細胞の特異的存在に基づいてフローサイトメトリーによって選別するfic膜マーカー。得られた後、ヒト筋芽細胞を増殖させ、培地から増殖因子を除去することによって分化することを約束する。特異的転写因子の発現レベルおよびin vitro免疫蛍光を用いて、対照条件下で、およびCa 2+シグナル伝達に関与するタンパク質をサイレンシングした後の筋形成分化プロセスを評価する。最後に、信頼できる再現性のあるSOCEの測定値を提供するレシオメトリックなCa 2+プローブとしてのFura-2の使用について詳しく説明します。
Introduction
ヒト骨格筋は、筋原性前駆細胞の融合から生じる収縮性多核筋繊維の群からなる。骨格筋は、筋繊維（筋帯）の原形質膜と基底板との間に位置する骨格筋幹細胞であるSCの存在により、損傷後に再生する能力を有する。損傷を受けていない筋肉では、SCはほとんどが静止状態にある。機械的ストレスまたは損傷に応答して、SCが活性化（筋芽細胞）となって増殖し、SCプール1、2を補充する新しい筋線維または自己複製を形成するために、どちらかの分化を受けます。長年にわたり、SCおよびその子孫、筋芽細胞を骨格筋生検から単離するためのいくつかの技術が開発された。これらの細胞上で発現される細胞表面マーカーおよび蛍光活性化細胞選別（FACS） 3の方法論のより深い理解により、4、5、筋肉サンプルからヒト筋芽細胞の純粋な集団を単離することが可能です。
カルシウムシグナリングは、骨格筋の発達、ホメオスタシス、および再生を調節する。特に、SOCEと呼ばれる細胞内貯蔵枯渇後に活性化されるCa 2+流入は、これらのプロセスにとって非常に重要である6 。細胞刺激により、エンドソー/筋小胞体（ER / SR）におけるCa 2+レベルが減少し、それにより、ER / SR 7を補充するためにCa 2+流入を可能にする原形質膜Ca 2+チャネルが活性化される。 SOCEに関与する2つの主なタンパク質は、ER / SR Ca 2+感知間質相互作用分子1（STIM1）タンパク質および原形質膜Ca 2+チャネルOrai1である。骨格筋は、これらの2つのタンパク質ならびに同じファミリーの他のタンパク質を豊富に発現する（STIM2 aND Orai2-ORAI3）8,9及び一過性受容体電位カノニカル（TRPC）ファミリー10、11、12、13のいくつかのCa 2+チャネル-permeable。 SOCE経路を通じたCa 2+流入は、筋形成/再生14にとって非常に重要である。 STIM1またはOrai1タンパク質の変異は、筋機能に有害な影響を与え、主に筋緊張低下につながる15 。 SOCE障害を有する動物モデルはまた、強化された疲労性6、16、17と一緒に、減少した筋肉量と力を表示します。前述したように、他のSTIMタンパク質およびOraiタンパク質ならびに多くのTRPCチャネルは、骨格筋において発現され、それらのそれぞれの役割はこれまで決定されていない。ノックすることでdそれらの発現レベルを所有しているので、ヒトの骨格筋分化中のSOCEおよびそれらの役割におけるそれらの影響を調べることが可能である。
SOCE測定は、電気生理学的電流記録およびCa 2+測定の2つの異なるアプローチを用いて行うことができる。電気生理学は、関心のある電流およびそれに関連する電気生理学的特徴を測定するので、確かに直接的な方法である。しかしながら、この技術は、主に筋肉細胞のサイズが大きく、内因性SOCE電流が小さいため、筋肉細胞に適用することは非常に困難である。サイトゾルCa 2+イメージングは技術的に非常にアクセス可能ですが、サイトゾルで測定されたCa 2+レベルはCa 2+の流入と細胞または内部貯蔵庫からの再ポンピングの両方を反映するので、測定はより間接的です。
ヒト骨格の小片から筋芽細胞を単離することを含む方法論この論文では、酵素消化、増幅、およびFACS後の筋肉を説明します。時間の経過に伴う分化マーカーの発現に続く筋肉分化および免疫蛍光プロトコールのプロセスが記載されている18 。最後に、SOCEの測定およびCa 2+シグナル伝達および骨格筋分化における異なるイオンチャネルの役割について説明する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
健康な患者の整形外科手術中に、手術用の廃棄物としてヒトの筋肉サンプル（半腱腱筋から採取した組織）を採取した。ヒト研究に関連するすべての方法は、スイスの規制当局のガイドラインと規制に従って実施され、スイスのジュネーブ条約当局（CER番号12-259プロトコル）からの欧州委員会Cantonale d'Ethique de la Recherche 。インフォームドコンセントと書面による同意は、研究に関わるすべての成人被験者から得られた。
ヒト骨格筋からの筋芽細胞の単離
- すべての手順の間、レベルII組織培養フードの下で作業し、滅菌培地および滅菌緩衝液を使用して滅菌状態を維持する。
注：この手順は、多くの人間の骨格筋に適用することができます。
2.解離プロトコル
- 筋肉サンプル（2〜3g）を滅菌6cmプレート。
- 5~10mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で筋肉サンプルを洗浄する。洗濯を繰り返します。
- 湾曲したはさみとクランプを使用して結合組織と脂肪組織を除去する。
- 筋肉サンプルを計量し（ステップ2.13参照）、新しい無菌6cmプレートに移す。
- 5mLの0.05％トリプシン-EDTAを添加する。
- はさみを使用して、筋肉組織を切断して小さな断片（2mm未満）にします。
- 10mLの血清学的ピペットを用いて、細かい筋肉を磁気棒を含む200mLの解離瓶に移す。 0.05mLのトリプシン-EDTA 90mLをすべての筋肉を切った状態で解離箱に移すまでこの手順を繰り返します。緩やかに攪拌しながら、解離瓶を閉じ、37℃で60分間インキュベートする。
- 加熱浴から解離瓶を取り出し、解離瓶に10mLのウシ胎児血清（FCS;最終体積10％）を添加して酵素反応を停止する。混合物をピペットでホモジナイズする。
- 準備それぞれに70μmセルストレーナを備えた2本の50mLチューブです。細胞懸濁液の半分を、懸濁液が通過するまでフィルター上を上下にピペッティングすることによって、各チューブ上の細胞ストレーナーに通す。
- チューブを200 xgおよび20°Cで5分間遠心分離する。吸引し、上清を捨てる。
- 10 mLの増殖培地（GM; 表1 ）で細胞を再懸濁し、1つの50 mLチューブに置かれた40μmセルストレーナーに細胞を通過させます。チューブを200 xgおよび20°Cで5分間遠心分離する。吸引し、上清を捨てる。
- 10mLのGMで細胞を再懸濁し、200×gおよび20℃で5分間遠心分離する。吸引し、上清を捨てる。
- 1mLのGMで細胞を再懸濁し、Neubauerチャンバーを用いて細胞を数えます。
注：通常、筋肉1gあたり3×10 5細胞の収量を収穫する必要があります。収量は、細胞の数を筋肉バイオプールの重量で割ることによって計算されるsy（ステップ2.4）。 - GMの4 mLを含む無菌の6 cmのプレートに2×10 5個の細胞を入れ、37℃、7％CO 2でインキュベートします。必要な数のプレートを準備します。
- 3日後にGMを変更してください。
注：新しく解離した細胞は培養プレートに接着する時間が必要です。さらに、最初の筋原性細胞倍化時間は約50〜60時間である。最初の分割後、倍加時間は約20時間です。 - 5〜7日後、細胞が70〜80％コンフルエンス（約1.5×10 6細胞/ 6cmプレートあたり）に達したら、抗体染色および細胞選別を開始する（ステップ3）。
3.抗体染色および細胞選別
- PBSで1回すすいだ後、付着細胞（6cmプレート中）を37℃、7％CO 2で1mLの0.05％トリプシン-EDTAと3分間インキュベートする（または5％CO 2でインキュベートする）。 2 mLのGMを加えて反応を停止させ、15 mLのチューブに細胞を集める。遠心分離（200×g、5分間）後、res細胞をGM1mLに移す。
- Neubauerチャンバーを使用して細胞を数えます。
- 氷上で以下の手順を実行します。
注：サイトメーターで正しい蛍光補正を設定する手順は必須であり、いずれのサイトメーターでも同様でなければなりません。チューブ1および2はネガティブコントロールとして使用されます。試験管3〜7を使用して、最初の実験中にサイトメーター上の補償を設定する（ 表2 ）。各抗体およびその対応するアイソタイプに使用される最終濃度は同じでなければならない（約1μg/ 10 6細胞）。 - チューブ1〜7（1〜7）について、1本のチューブ（5mLチューブ）あたり1×10 5個の細胞を送達する（ 表2 ）。残りの細胞懸濁液をチューブ8に入れて細胞分取する。
- 1mLの冷FACS緩衝液（PBS-5％FCS）で細胞を洗浄する。チューブを閉じ、200×gおよび4℃で5分間遠心分離する。吸引し、上清を捨てる。
- チューブあたり200μLのFACSバッファーを加える。 thに抗体を加える表2による。氷上で30分間インキュベートする。
- 細胞を洗浄する：1mLのFACS緩衝液を各チューブに加える。チューブを密閉し、200×gおよび4℃で5分間遠心する。上清を吸引して捨てる。もう一度このステップを繰り返します。
- 500μLのFACS緩衝液に細胞を再懸濁する。チューブを閉じ、細胞の選別まで氷上に置いてください。細胞分取の間に細胞を集めるために必要な、500μLのGMをそれぞれ含む1.5mLの4本のチューブを準備する。氷上に置いておいてください。
- フローサイトメトリーでヒト筋芽細胞をソートする（ 図1 ）。 CD45陽性造血細胞を排除した後、CD56発現に基づいてCD45陰性細胞を分離する。次に、CD34、CD144、およびCD146（ヒト筋芽細胞は、CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-細胞と定義される）のCD56陽性集団をゲートする。純度をチェックするために、選別された細胞集団の少数部分を再分析する。
- ヒトmyoblaを含むチューブをプールする1つの15 mLチューブに入れ、5 mLのGMを加えて1回洗浄する。チューブを200 xgおよび20°Cで5分間遠心分離する。吸引し、上清を捨てる。
- 1mLのGMに細胞を再懸濁し、4mLのGMを含むコーティングされていない6cmプレート（プレートあたり2×10 5細胞）に細胞をプレートする。 37℃、7％CO 2でインキュベートする。
セルのメンテナンス
- 培養培地の半分を2日ごとに交換する。培養皿から2mLの古いGMを取り出し、2mLのGMを加える。
注：筋芽細胞は、培養条件に有益な増殖因子を産生する。 - 前分化を避けるために細胞が70〜80％コンフルエンスに達すると細胞をトリプシン処理する。 PBSで1回すすいだ後、接着細胞（6cmプレート）を37℃、7％CO 2で0.05％トリプシン-EDTA 1mLと共に3分間インキュベートする。 2 mLのGMを加えて反応を停止させ、15 mLチューブに細胞を集める。遠心分離（200×g、5分間）後、レウス細胞をGM1mLに入れてください。
- 細胞を計数し、4mLのGM中に1プレートあたり2×10 5個の細胞を有する6cmプレートを調製する。
- ヒト筋芽細胞を6継代まで維持するか、または10％DMSO、mL当たり1×10 6細胞を含有するGMで凍結する。漸進的な凍結箱（1℃/分）で細胞を凍結する。長期保存のために、細胞を液体窒素中に置く。
siRNAによるヒト筋芽細胞のトランスフェクション
注：分化誘導の2日前に市販のトランスフェクション試薬を用いて筋芽細胞をトランスフェクションします。遺伝子に対する特定のsiRNAの効果は、対照siRNAの効果と常に比較されます。 siRNAは二本鎖RNAであり、氷上に保管し、手袋で操作する必要があります。
- 6cmプレート（およそ1.5×10 6細胞）中のヒト筋芽細胞の70〜80％コンフルエントな単層を得る。
注：トランスフェクションあたり5×10 5個の細胞が必要ですGMで2日後にトランスフェクトされた筋芽細胞の単層流暢単層である。 - ガラスカバースリップ（ステップ7のカルシウムイメージングで説明）を準備する。
- GMを温め、0.05％トリプシン-EDTA、およびPBSを37℃でインキュベートする。
- 無菌性を維持するためにレベルII組織培養フードで以下のすべてのステップを実行する。
- 1.5mLチューブで、500μLの還元血清培地、3μLのトランスフェクション試薬、および1μLのsiRNAを20μMで送達する。静かに混合し、室温（RT）で15〜20分間保持する。
- このインキュベーション時間中、トランスフェクションのために筋芽細胞を調製する。 PBSで1回すすいだ後、接着細胞（6cmプレート）を37℃、7％CO 2で0.05％トリプシン-EDTA 1mLと共に3分間インキュベートする。 2 mLのGMを加えて反応を停止させ、15 mLチューブに細胞を集める。遠心分離（200xg、5分間）後、細胞をGM 1mLに再懸濁する。
- Neubauerチャンバーを使用して細胞を数えます。
- 5×10 5個の細胞を再懸濁する各トランスフェクション（ すなわち、 2回のトランスフェクションについて、400μL中に再懸濁）のためのGM200μL中でインキュベートする。
- 各500μLのsiRNAトランスフェクタント混合物に200μLの細胞懸濁液を添加する。ピペットを2回上下に動かし、RTで5分間インキュベートする。
- ガラスカバースリップを含む3.5cmの培養皿に700μL（細胞+ siRNAトランスフェクタント）を加える。 2mLの最終容量を得るためにGMを添加する。
- 37℃および7％CO 2で24時間後、培地を新鮮なGM 2mLで完全に交換する。さらに24時間後、トランスフェクションされた細胞のコンフルエントな単層が通常存在する。そうであれば、GMを2mLの分化培地（DM; 表1 ）で置き換えることにより筋芽細胞分化を誘導する。
- 分化誘導後、または増殖している筋芽細胞の24〜48時間後にカルシウムイメージング実験を行う。
注：免疫蛍光は、通常、分化誘導の48時間後に行われます。
6.イム分化マーカーの非蛍光染色
注：免疫蛍光染色は、DM中で48時間後に行うが、他の分化時間で行うこともできる。ミオゲニンおよびMEF2は、（筋管への融合前の）分化した細胞においてのみ発現される核タンパク質であり、それらの染色は分化プロセスの評価を可能にする。ミオシン重鎖（MyHC）は、筋管でのみ発現され、筋管のサイズおよび融合指数（筋管における核の数/核の総数）を推定するために使用される。
- DM中で48時間後、分化した細胞のコンフルエントな単層を室温で1mLのPBSで2回洗浄する。筋管の取り外しを避けるために注意深く行ってください。
- 室温で15分間、1mLの4％パラホルムアルデヒド（PFA）で細胞を固定する。 PBSで2回、各回5分間細胞を洗浄する。
- 0.25％Triton X-100を含有する1mLのPBSで細胞を45分間浸透させ、1mLのPBSで3回洗浄する。
- unsをブロックする0.2％Tween-10および2％ヤギ血清（ブロック溶液）を補充したPBS中で室温で30分間インキュベートすることによって、非特異的結合部位を除去する。
- ブロック溶液（3.5cmプレートあたり600μL）で希釈した一次抗体を調製する。
注：マウス抗ミオゲニン（1：600）、ウサギ抗MEF2（1：300）およびマウス抗MyHC抗体（MF20,1：1,000）の一次抗体を使用する。同じブロッキング溶液、マウス抗ミオシン重鎖またはマウス抗ミオゲニンをウサギ抗MEF2と混合することが可能である。 - ブロック溶液を除去し、3.5cmプレートあたり600μLの一次抗体溶液を添加し、加湿チャンバー内で4℃で一晩インキュベートする。
- 1mLのPBSで細胞を3回洗浄する。ヤギ抗マウスAlexa 488（1：1,000）、ヤギ抗ウサギAlexa 546（1：1,000）、およびヤギ抗ウサギAlexa 546（1：1,000）のように、ブロック溶液中で調製した600μLの二次抗体を含む暗室中、室温で1時間インキュベートする。およびDAPI（1:50、15μMでのストック溶液）である。
カウチョN：DAPIは、手袋を用いて取り扱われるべき有毒な化合物です。 - 1mLのPBSで細胞を3回吸引洗浄する。
- ポリビニルアルコールを使用したマウントガラスカバーガラスには褪色防止剤が入っています。それらを4℃に保ち、細胞を画像化するまで光から保護する。
7.カルシウムイメージング
- 培養前に、直径25mmのカバーガラスを用意する。カバースリップを70％エタノールに48時間入れ、グリースと汚れを表面から除去し、カバースリップへの細胞接着を減少させる。
- カバースリップを水で数回すすいだ後、水に戻して滅菌（オートクレーブ）してください。
- 3.5cmの培養プレートごとにカバースリップを1つ入れ、乾燥させます。さらなる実験のためにペトリ皿を保管しておくか、すぐに使用してください。
- トランスフェクションされた筋芽細胞（5〜6×10 5細胞）をガラスカバースリップに加える。
注：実験は、差異の誘発から24〜48時間後に行われます増殖している筋芽細胞上に、または増殖する。 - Ca 2+イメージングを行うには、PBSで細胞を2回洗浄するか、または実験に使用した培地（カルシウム含有培地; 表3 ）で細胞を直接洗浄する。 2μMのFura-2 / AMと1μMのプルロニック酸を含む細胞を室温で暗所で約30分間ロードする。
注：プルロニック酸はFura-2を可溶化するのに役立ちます。 Fura-2 / AMおよびプルロニック酸は、カルシウム含有培地に溶解される。 - Fura-2 / AMおよびプルロニック酸を含まない同じ培地で細胞を2回洗浄し、暗所に10〜15分間放置してFura-2 / AMの脱エステル化を可能にする。
- Fura-2のローディング効率が低すぎる場合、より多くのFura-2（ 例えば、 4μM）を添加し、および/またはより長い時間（ 例えば、 40分間）細胞をインキュベートする。
- 培養プレートからカバーガラスを取り出し、実験室に設置する。 ~1mLのカルシウム含有培地を加える（実験の容量に応じて）メンタルチェンバー）。顕微鏡ステージに設置し、記録を開始します。
注：蛍光性Ca 2+感受性プローブFura-2は340nmと380nmで交互に励起され、放出光は510nmで収集されます。 Ca 2+濃度の変動は比較的遅いので、2秒ごとに1つの比率を獲得する。 - SOCEを活性化するために、以下の古典的タプシガルギン/ Ca 2+再添加プロトコールを用いる：細胞をカルシウム含有培地中に2〜3分間放置する。培地を無カルシウム培地で1〜2分間交換する。
- 1μMタプシガルギンを添加して、内部カルシウム貯蔵量を枯渇させる。
注：タプシガルギンは、細胞小胞体Ca 2+ ATPアーゼ（SERCA）ポンプ活性の不可逆的なブロッカーである.8〜10分後、迅速に培地をカルシウム含有培地に交換する。 Ca 2+はSOCEチャネルを介して細胞に入る。実験を終了する前に約5分間待ちます。
注意：タプシガルギンは、有毒な化合物であり、手袋で取り扱う必要があります。
- 1μMタプシガルギンを添加して、内部カルシウム貯蔵量を枯渇させる。
8. Ca 2+測定分析
注：収集ソフトウェアを使用して分析を実行します。
- 実験を開きます。細胞が存在しない領域（背景領域）に領域1を描画し、分析対象の細胞の細胞質に他の領域を描画する（領域は任意の画像上に描くことができる：340nm、380nm、または比率画像）。 [実験を実行]> [参照画像]に移動します。 340と380のチャンネルの下で、 "地域1"を選択し、 "バックグラウンドを引く"をクリックします。
- バックグラウンド領域を通過する蛍光ダストスポットなど、バックグラウンド領域と干渉しないこと、および実験の間に細胞が動いていないことを確認するために、実験全体を実行する（F4：前方）。
注：選択された関心領域暗い部分は含めないでください。それ以外の場合は、バックグラウンドの一部が測定に含まれるため、比率の値はノイズが多いように見えます。 - [ログデータ]をクリックし、再度実験全体を再生します。
注：これにより、時間と比率が記録されたスプレッドシートが開きます。個々の340nmおよび380nmの波長を節約することも可能である。 - SOCEについての情報を得るには、Ca 2+再添加の振幅とCa 2+進入期の傾き（ 図3 ）の2つの重要なパラメータを実験から抽出する。
- Ca 2+上昇の最大振幅からCa 2+再添加の直前に比の値を減算することによって振幅を得る。 Ca 2+再添加後の最初の秒の線形回帰を適合させることによって最大傾きを得る。
注：タプシガルギン応答のカーブの下の領域も、extracの有益なパラメータですそれはSRに貯蔵されている遊離カルシウムの量を反映しているからである。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ヒト筋肉試料の酵素的解離の後、細胞はGMで増幅された。 CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-細胞と定義されるヒト筋芽細胞は、FACS後に得られた。筋芽細胞は分析された集団の60％以上を占めていた（ 図1 ）。初代ヒト筋芽細胞を再播種し、コンフルエントになるまで増殖させ、DM中で48時間培養した。転写因子MEF2および筋肉特異的タンパク質ミオシン重鎖（MyHC）の発現のための免疫染色の後、我々は、大部分の細胞がインビトロで筋管を形成し （MyHC陽性細胞）、融解指数値が60.9±1.3％ （n = 5; 図2 ）。予備細胞と呼ばれるヒト筋芽細胞の約40％がこの最終分化を免れ、未分化単核細胞のままであることも観察した。機能的研究のために、本発明者らは、開始の48時間後の筋芽細胞または筋管のCa 2+応答を分析した差別化。 図3は、SOCEを誘導するために使用される代表的なプロトコルと、そのような記録から抽出するための主要パラメータを示す。 SOCEに関与する分子に関連する情報を識別するために、目的の分子に対するsiRNAを細胞にトランスフェクトした。 図4は、筋芽細胞におけるSOCEに対するTRPCファミリーのCa 2+ -透過性チャネルをサイレンシングすることの影響を示す。
図1 ：ヒトの筋芽細胞のFACS。解離したヒト細胞を、以下の細胞表面マーカー：CD45、CD56、CD34、CD144、およびCD146に対する抗体で免疫染色した。 CD45陽性造血細胞を排除した後、CD56発現に基づいてCD45陰性細胞を分離した。次いで、CD56陽性集団をCD34、CD144およびCD146についてゲートした。ヒト筋芽細胞をCD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-細胞を、以前に記載されているように19、4。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2 ：ヒトの筋芽細胞分化。 （ A ）ヒト筋芽細胞のコンフルエントな単層をDMに48時間曝露した。一定;核を同定するために、MEF2（赤色）、MyHC（緑色）、およびDAPI（青色）に対する抗体で染色した。スケールバー=50μm。 （ B ）融合指数は、筋管に取り込まれた核の数を、特定の分野の核の総数で割ったものを表す。データは、5回の独立した実験の平均±SEMである。ank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3 ：タプシガルジン誘導SOCEの代表的なカルシウム測定。筋管にFura-2を負荷し、細胞質ゾルCa 2+濃度を測定した。 （ A ）細胞は、カルシウム含有培地中で数分間、続いてカルシウム非含有培地中で2分間置く。次いで、1μMタプシガルギンを8分間使用し、続いてカルシウムを再添加する。そのような記録から抽出する3つの重要なパラメータは、タプシガルギン応答の曲線下面積、SOCEの傾き、SOCEの振幅である。 （ B ）3つのパラメータの定量化。曲線の下の領域は、ER / SRに保存されているCa 2+の量に関する情報を提供し、2つの他のパラメータは、定量的SOCEのアサーションこの図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4 ：SOCEにおけるTRPC1およびTRPC4の関与。 （ A ）siTRPC1またはsiTRPC1およびsiTRPC4でトランスフェクトした増殖筋芽細胞において、Fura-2を用いてサイトゾルCa 2+濃度を評価した。 SOCEは、外部Ca 2+ （Ca 2+を含まない）が存在しない場合に1μMタプシガルギンによる内部貯蔵枯渇により誘発され、2mM外部Ca 2+の再添加中に測定された。各トレースは、代表的なカバースリップの平均を表す。 （ B ）SOCE振幅に対するsiRNAの効果の定量。この数字は、許可を得て、参考文献12から変更されています。バーar e平均±SEM、* p <0.05。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
| 増殖培地（GM）： | 濃度 | 分化培地（DM）： | 濃度 | |||||
| ハムのF10 | DMEM | |||||||
| FCS | 15％ | ウシ血清アルブミン | 0.5mg / ml | |||||
| ウシ血清アルブミン | 0.5mg / ml | 表皮成長因子 | 10ng / ml||||||
| フェチュイン | 0.5mg / ml | インスリン | 0.01mg / ml | |||||
| 表皮成長因子 | 10ng / ml | クレアチン | 1mM | |||||
| デキサメタゾン | 0.39μg/ ml | ピルビン酸塩 | 100μg/ ml | |||||
| インスリン | 0.04mg / ml | ウリジン | 50μg/ ml | |||||
| クレアチン | 1mM | ゲンタマイシン | 10μg/ ml | |||||
| ピルビン酸塩 | 100μg/ ml | <td colspan = "2"> | ||||||
| ウリジン | 50μg/ ml | |||||||
| ゲンタマイシン | 5μg/ ml | |||||||
表1：筋芽細胞培養のための培地組成。
| チューブ | 抗体 | |||||
| 1 | なし | |||||
| 2 | アイソタイプAlexaFluor 488-、アイソタイプPE-CF594、アイソタイプPE、アイソタイプPECy7Isotype APC | |||||
| 3 | マウス抗ヒトCD56-AlexaFluor 488 | |||||
| 4 | マウス抗- ヒトCD45 PE-CF594 | |||||
| 5 | マウス抗ヒトCD144-PE | |||||
| 6 | マウス抗ヒトCD146-PECy7 | |||||
| 7 | マウス抗ヒトCD34-APC | |||||
| 8 | マウス抗ヒトCD56-AlexaFluor488、マウス抗ヒトCD45 PE-CF594、マウス抗ヒトCD144-PE、マウス抗ヒトCD34-APC、マウス抗ヒトCD146-PECy7 | |||||
表2：細胞選別に用いられる抗体。
| カルシウム含有培地 | 濃度 | カルシウムを含まない培地 | 濃度 | |||||
| NaCl | NaCl | 135mM | ||||||
| KCl | 5mM | KCl | 5mM | |||||
| MgCl2 | 1mM | MgCl2 | 1mM | |||||
| CaCl2 | 2mM | EGTA | 1mM | |||||
| Hepes | 10mM | Hepes | 10mM | |||||
| グルコース | 10mM | グルコース | 10mM | |||||
| NaOHで調整したpH7.45 | NaOHで調整したpH7.45 | |||||||
表3：カルシウムイメージング実験のための培地組成。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
成体骨格筋由来のヒト筋芽細胞の単離および培養は、筋肉分化および筋肉再生を研究するインビトロモデルを提供する。この論文では、高収量のヒト筋芽細胞の精製を簡単かつ低コストな方法で可能にするプロトコールを提供する。さらに、この技術は、単離された筋芽細胞の割合および筋原性分化効率に関して、信頼性の高い再現性のある結果を提供する。実際、細胞選別後に約60％のヒト筋芽細胞を得た。これらの細胞は、最大6継代（約30回の倍加）の培養で維持することができ、その能力を分化させる。さらに、DMにおいて2〜3日後、筋芽細胞融合が最大であるように、筋原性分化は、培地をGMからDMに変化させた後に急速に生じる。このモデルでは、筋芽細胞の約60％がDMで2日後に筋管に融合する。別の利点は、これらの初代ヒト細胞l培養物はsiRNAで簡単にトランスフェクションされます。私たちの研究室で使用されているGMとDM培地は自家製です。あるいは、市販の培地を使用してもよいが、ヒトの初代培養においてその効率を試みたことはない。
上記の方法の1つの欠点は、組織の酵素的消化中にトリプシンを使用することである。この手順は、細胞表面マーカーの大部分を除去し、FACSを実施する前に数日間細胞を培養液中に放置することを意味する。コラゲナーゼは、膜タンパク質をより良く保存し、組織解離直後のヒト筋芽細胞の選別を可能にするために、トリプシンの代わりに使用することができた。しかし、コラゲナーゼのコストはトリプシンよりも有意に高く、その後の実験に十分な細胞数を得るために細胞選別後に増幅工程が依然として必要となる。この技術のもう一つの限界は、オルトープから得られた筋肉サンプルの「質」であるic手術。確かに、得られた組織片は、手術により多かれ少なかれ損なわれる可能性があり、手術室と実験室での細胞解離との間の時間は日々変化する可能性がある。しかし、筋芽細胞の単離、精製、および筋管への分化のために、我々は日常的に満足のいく結果を得る。最後に、患者の年齢は、衛星細胞の量および再生能力が20歳で低下するにつれて、問題となり得る。したがって、私たちは40歳未満の若い患者に実験を限定します。
前述したように、筋芽細胞は迅速かつ効率的に分化し、骨格筋分化の初期事象を研究する大きな利点である。しかし、筋管が急速に形成されると、それらは自然に培養プレートから収縮して分離する傾向も有する。これは、後の融合事象の分析を妨げる。これらの後の出来事を研究するためには、コートに細胞外マトリックスと培養プレートは、細胞接着を向上させ、筋管剥離21を減少させます。
蛍光プローブFura-2を用いたカルシウムイメージングは、広く使用され、再現性の高い技術であり、実施が容易である。 Fura-2のローディングは効率的であり、Fura-2のようなレシオメトリックプローブの使用は、単一波長染料に対していくつかの利点を有する。それは、焦点の変化または細胞間および細胞内の負荷（ 例えば、核対サイトゾル）の差異を標準化する。 SOCEを誘発し測定するために我々が記述したプロトコルは、多くの異なる細胞系において定期的に使用されている。異なるチャネルまたはカルシウム調節因子のサイレンシングは、SOCEの分子組成および筋芽細胞および筋管の両方における異なる選手の相対的重要性の解明を可能にする。 Fura-2およびCa 2+イメージングを用いる別のアプローチは、Mn 2+クエンチ技術。 Mn 2+は、Ca 2+透過性チャネルを介して細胞に入り、fura-2蛍光を消光する。急冷速度の尺度はSOCE 22、23のより直接的な尺度を与えます。しかし、これはわずかに異なる装置の利用を必要とする。 Ca 2+シグナリングはまた、異なる細胞コンパートメントに正確に局在化する大きな利点を有する遺伝的にコードされたCa 2+インジケータを用いて行うことができる。欠点は、細胞のトランスフェクションとシグナルのダイナミクスが必要であることです。シグナルのダイナミクスは通常、化学色素24よりも少なくなります。ミトコンドリアまたはSRのような細胞小器官におけるCa 2+を測定するために、遺伝子プローブが金本位物である。しかし、細胞質Ca 2+測定のために、Fura-2を遺伝的プローブよりも使用する利点は残っている。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者には競合する金銭的利益はない。
Acknowledgments
この作品は、スイス国立科学財団（助成金番号310030-166313）、「ファンデーションスイスの病気を治癒させる」、「Foundation Marcel Levaillant」、「Fondation pour la rechercheostéo-articulaire」のサポートを受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham’s F10 | ThermoFisher Scientific | 31550-023 | |
| FCS | ThermoFisher Scientific | 10270-106 | Lot 41G5532K |
| BSA | Sigma | O5482 | |
| fetuin | Sigma | F3385 | |
| EGF | Corning | 354001 | |
| Dexamethansone | Sigma | D1756 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Creatine | Sigma | 27900 | |
| Pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Falcon 50 mL tube | Falcon | 352070 | |
| Falcon 15 mL tube | Falcon | 352096 | |
| Falcon 5 mL tube (FACS) | Falcon | 352058 | |
| Culture medium: OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985-047 | |
| Transfectant reagnt: RNAiMax | ThermoFisher Scientific | 1756064 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190-094 | |
| Mounting medium | Fluka | 10981 | |
| Mouse anti-MyHC * | DSHB | MF20 | concentrate |
| Mouse anti-myogenin | BD Pharmigen | 556358 | |
| Rabbit anti-MEF2 | Santa Cruz Biotech | C-21 | |
| Goat anti-mouse Alexa488 | ThermoFisher Scientific | A11029 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 546 | ThermoFisher Scientific | A11035 | |
| Mouse anti human CD56-Alexa488 | BD Pharmingen | 557699 | |
| Mouse anti human CD146-PECy7 | BD Pharmingen | 562135 | |
| Mouse anti human CD45-PE-CF594 | BD Pharmingen | 562279 | |
| Mouse anti human CD34-APC | BD Pharmingen | 345804 | |
| Mouse anti human CD144-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
| Alexa Fluor 488 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557702 | |
| PECy7 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557872 | |
| PE-CF594 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 562292 | |
| APC mouse IgG1k | BD Pharmingen | 550854 | |
| PE mouse IgG1k | BD Pharmingen | 556650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | CAUTION: toxic compound |
| Paraformaldehyde | Fluka | 762400 | |
| Fura-2 AM | ThermoFisher Scientific | F1201 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher Scientific | P3000MP | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | CAUTION : toxic compound |
| Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3 | Molecular Device | ||
| * : MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A. |
References
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and Skeletal Muscle Regeneration. Compr Physiol. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. Adult skeletal muscle stem cells. Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).
- Chen, W. C., et al. Isolation of blood-vessel-derived multipotent precursors from human skeletal muscle. J Vis Exp. (90), e51195 (2014).
- Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21 (6), 1087-1093 (2012).
- Charville, G. W., et al. Ex Vivo Expansion and In Vivo Self-Renewal of Human Muscle Stem Cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
- Stiber, J., et al. STIM1 signalling controls store-operated calcium entry required for development and contractile function in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 10 (6), 688-697 (2008).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiol Rev. 95 (4), 1383-1436 (2015).
- Darbellay, B., et al. STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium entry regulates human myoblast differentiation. J Biol Chem. 284 (8), 5370-5380 (2009).
- Darbellay, B., et al. Human muscle economy myoblast differentiation and excitation-contraction coupling use the same molecular partners, STIM1 and STIM2. J Biol Chem. 285 (29), 22437-22447 (2010).
- Nilius, B., Owsianik, G., Voets, T., Peters, J. A. Transient receptor potential cation channels in disease. Physiol Rev. 87 (1), 165-217 (2007).
- Vandebrouck, C., Martin, D., Colson-Van Schoor, M., Debaix, H., Gailly, P. Involvement of TRPC in the abnormal calcium influx observed in dystrophic (mdx) mouse skeletal muscle fibers. J Cell Bio. 158 (6), 1089-1096 (2002).
- Antigny, F., Koenig, S., Bernheim, L., Frieden, M. During post-natal human myogenesis, normal myotube size requires TRPC1- and TRPC4-mediated Ca(2)(+) entry. J Cell Sci. 126 (11), 2525-2533 (2013).
- Brinkmeier, H. TRP channels in skeletal muscle: gene expression, function and implications for disease. Adv Exp Med Biol. 704, 749-758 (2011).
- Pan, Z., Brotto, M., Ma, J. Store-operated Ca2+ entry in muscle physiology and diseases. BMB Rep. 47 (2), 69-79 (2014).
- Lacruz, R. S., Feske, S. Diseases caused by mutations in ORAI1 and STIM1. Ann N Y Acad Sci. 1356, 45-79 (2015).
- Li, T., et al. STIM1-Ca(2+) signaling is required for the hypertrophic growth of skeletal muscle in mice. Mol Cell Biol. 32 (15), 3009-3017 (2012).
- Wei-Lapierre, L., Carrell, E. M., Boncompagni, S., Protasi, F., Dirksen, R. T. Orai1-dependent calcium entry promotes skeletal muscle growth and limits fatigue. Nat Commun. 4, 2805 (2013).
- Konig, S., et al. Membrane hyperpolarization triggers myogenin and myocyte enhancer factor-2 expression during human myoblast differentiation. J Biol Chem. 279 (27), 28187-28196 (2004).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Bigot, A., et al. Age-Associated Methylation Suppresses SPRY1, Leading to a Failure of Re-quiescence and Loss of the Reserve Stem Cell Pool in Elderly Muscle. Cell Rep. 13 (6), 1172-1182 (2015).
- Bettadapur, A., et al. Prolonged Culture of Aligned Skeletal Myotubes on Micromolded Gelatin Hydrogels. Sci Rep. 6, 28855 (2016).
- Darbellay, B., Arnaudeau, S., Bader, C. R., Konig, S., Bernheim, L. STIM1L is a new actin-binding splice variant involved in fast repetitive Ca2+ release. J Cell Biol. 194 (2), 335-346 (2011).
- Sauc, S., et al. STIM1L traps and gates Orai1 channels without remodeling the cortical ER. J Cell Sci. 128 (8), 1568-1579 (2015).
- Demaurex, N. Calcium measurements in organelles with Ca2+-sensitive fluorescent proteins. Cell Calcium. 38 (3-4), 213-222 (2005).
